荧光定量PCR检测技术

如果检测到荧光信号超过域值被认为是 真正的信号，它可用于定义样本的域值 循环数（Ct）。 Ct值的含义是： 每个反应管内的荧光信号达到设定的域

值时所经历的循环数。
什么是C(t)值
C(t)
Threshold（域值）
为什么要引入C(t)值
Endpoin
96 replicates of B7 gene molecular beacon

1 、采用闭管检测，不需 PCR 后处理， 并采用dUTP-UNG酶的防污染系统，扩 增和检测一次同时完成。不需开盖，不
产生污染，避免了假阳性。
FQ-PCR与普通PCR的区别

2 、探针与被检 DNA 序列特异杂交， 增强了特异性。
A、上下游引物和探针三道关卡控制其 特异性； B、引物和探针都比较长，退火温度较 高，非特异性扩增几率减少。
FQ-PCR与普通PCR的区别


5、可以多重检测。
如果检测两种以上的基因片断，可以对各个 基因分别设计探针和引物，在不同的反应管 中进行TaqMan检测，或者将各自的探针分 别标记不同的荧光信号，在同一个反应体系 中检测多个基因片断。
二、SYBR荧光染料原理

在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧 光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入 DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入 链中的SYBR染料分子不会发射任何荧 光信号，从而保证荧光信号的增加与 PCR产物的增加完全同步。


FQ-PCR与普通PCR的区别
3、可定量结果，准确灵敏地反应了 病原体的感染和治疗恢复情况。
FQ-PCR与普通PCR的区别

4、光谱分析仪直读结果，自动分析， 增强了 灵敏性和客观性。能够实时检测，即一边PCR， 一边检测PCR的结果，而不需要在PCR结束之 后进行核酸电泳来显示PCR反应的结果，（因 此实时荧光PCR检测技术操作更简单；也避免 了核酸电泳非常难以回避的化学污染和核酸污 染等严重问题）；
如果找不到合适的引物，可调整探针（向 前或向后）的序列，或重新选择一个探针， 再寻找合适的引物。
普通PCR临床检测技术的缺点
普通PCR临床检测技术虽然解决了检 出率低、周期长的问题，但由于假阳 性率高，不能正确指导临床实践。
因此国家卫生部曾在1997年行文禁 止将普通PCR技术用于临床诊断。
FQ-PCR与普通PCR的区别
核酸探针的高特异性 光谱技术的高灵敏性和可计量性


实时荧光定量PCR

定义
利用荧光信号对PCR反应的过程进行实时监控

目的
对起始模板进行定量

优点
灵敏，重复性，动态范围宽，高通量

原理
Ct 值与起始模板浓度的对数成比例
实时荧光定量PCR原理

PCR反应过程中产生的DNA拷贝数是呈指数 方式增加的，随着反应循环数的增加，最终 PCR反应不再以指数方式生成模板，从而进入 平台期。
在传统的PCR 中，常用凝胶电泳分离并用荧 光染色来检测PCR反应的最终扩增产物，因此 用此终点法对PCR产物定量存在不可靠之处。

利用电泳定量
11,500 counts / 5200 counts = 2.2 fold difference
实时荧光定量PCR原理

在real-time Q-PCR中，对整个PCR反 应扩增过程进行了实时的监测和连续地 分析扩增相关的荧光信号，随着反应时 间的进行，监测到的荧光信号的变化可 以绘制成一条曲线。
如何定量
标准曲线 未知样品的C(t) 值 定量
荧光化学

荧光定量PCR所使用的荧光化学可分 为两种：荧光探针和荧光染料。 荧光探针：TaqMan荧光探针

荧光染料：SYBR荧光染料
一、TaqMan检测技术原理

PCR扩增时在加入一对引物的同时加入 一个特异性的荧光探针，该探针为一寡 核苷酸，与扩增片断内部某一段系列相 同或互补，两端分别标记一个报告荧光 基团和一个淬灭荧光基团。
（一）选择靶基因




TaqMan技术主要用于检测，所以其扩增 的基因必须是特异的，如： 某种病原微生物所共有的保守基因 （检测某种病原微生物）； 某个血清型所特有的基因序列 （区分检测某个血清型）； 选择决定毒力强弱的基因 （区分强毒和弱毒）等。
（二）选择探针
选择探针需要同时满足以下条件： 1、在靶基因的保守区域 2、G+C含量在40%以上； 3、相同碱基连续不超过4个；
SYBR Green I (双链DNA结合染料)
ssDNA = free dye (weak fluorophore)
dsDNA = Binds minor groove (intense fluorophore)
人医现所开展的检测项目

乙肝病毒（HBV）荧光定量PCR检测 丙肝病毒（HCV）荧光定量PCR检测 淋球菌（NG）荧光定量PCR检测 沙眼衣原体（CT）荧光定量PCR检测 解脲支原体（UU）荧光定量PCR检测 结核分支杆菌（TB）荧光定量PCR检测
原理示意图

PCR扩增前
上游引物

荧 完好探针 荧 光 光 淬 物 灭 物 质 质
模板负链
PCR扩增时
DNA合成 探针水解，释放荧光
Donor dye (Reporter)
TaqMan® 探针
Acceptor dye (Quencher)
未结合的探针
Light Energy transfer Taq
（三）选择引物
3、与靶基因其他区域配对较少； 4、G+C含量在40%以上； 5、相同碱基连续不超过4个；


6、Tm值比探针Tm值低10±1℃;
（三）选择引物

7、探针与两条引物之间的各种组合形成 的二聚体都较少，特别是引物3’端与探针 配对很少；

8、PCR扩增片断在70—250个碱基之间。

探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭 基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’－3’外切 酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬 灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到 荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧 光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产 物形成完全同步。
TaqMan检测技术

4、Tm值在71±2℃;
（二）选择探针
5、内部自身配对较少；
6、5’端不为G；
7、G数目比C数目少； 如果6和7难以满足的时候，就要考 虑用互补序列作探针。
（三）选择引物

探针选好之后Βιβλιοθήκη 在探针的上下游分别选 择合适的引物序列，引物应满足如下的 条件:
1、在靶基因保守和无二级结构的区域；


2、与探针所在区域不重叠；
兽医现所开展的检测项目
禽流感病毒（ALV）荧光定量 PCR检测 新城疫病毒（NDV）荧光定量 PCR检测 蓝耳病病毒（PRRSV）荧光定 量PCR检测

实时荧光定量PCR原理

在PCR反应早期，产生荧光的水平不能 与背景明显地区别，而后荧光的产生进 入指数期、线性期和最终的平台期，因 此可以在PCR反应处于指数期的某一点 上来检测PCR产物的量，并且由此来推 断模板最初的含量。
实时荧光定量PCR原理

为了便于对所检测样本进行比较，在real-time Q-
Ct
实时荧光定量PCR原理

研究表明，每个模板的Ct值与该模 板的起始拷贝数的对数存在线性关 系，起始拷贝数越多，Ct值越小。
实时荧光定量
Ct 18 and Ct 22, 2^(4 Ct shift) = 16 fold difference
实时荧光定量PCR原理

利用已知起始拷贝数的标准品可作出 标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝 数的对数，纵坐标代Ct值。因此只要 获得未知样品的Ct值，即可从标准曲 线上计算出该样品的起始拷贝数。
荧光定量PCR检测技术
（FQ-PCR, Fluorescence quantitative PCR）
实时荧光定量PCR技术

所谓real-time FQ-PCR技术，是指
在PCR反应体系中加入荧光基因，利
用荧光信号累积实时监测整个PCR进
程，最后通过标准曲线对未知模板进 行定量分析的方法。

是一种完全闭管式的PCR和荧光探针杂 交技术相结合的定量PCR方法。 PCR的高效扩增特性
PCR反应的指数期，首先需设定一定荧光信号的域值
（threshold）。

以PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底 信号 （baseline），荧光域值的缺省设置是3～15 个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。

threshold = 10 ´ SDcycle 6-15
实时荧光定量PCR原理
光发射或者以热量形式散失
探针、引物与目的片段结合，FRET
Light Emission
Light
Taq
Taq 水解探针，报告荧光素与淬灭荧光素分离
TaqMan检测技术的设计

与普通PCR的设计基本相同，区别
在于引物与探针的设计一般需要特
定的软件，如美国ABI公司开发的
Primer Express软件。