荧光定量PCR基础原理
荧光定量pcr原理及应用
荧光定量PCR原理及应用一、引言荧光定量PCR（Quantitative Polymerase Chain Reaction）是一种广泛应用于生物学和医学领域的分子生物学技术，它能够在短时间内扩增DNA序列并定量测量样品中特定DNA的数量。
本文将深入探讨荧光定量PCR的原理和应用。
二、荧光定量PCR原理2.1 PCR基本原理回顾在了解荧光定量PCR原理前，我们首先回顾一下PCR的基本原理。
PCR是一种通过反复复制DNA片段的技术，它基于DNA复制的三个基本步骤：变性、引物结合和延伸。
1.变性：将DNA加热到95℃，使其两个链分离成单链。
2.引物结合：将温度降至适合引物结合的温度。
引物是针对待扩增的DNA片段设计的短寡核苷酸序列，它们与待扩增片段的两端互补。
引物结合到待扩增片段上。
3.延伸：在适当的酶的作用下，延伸引物，合成互补链。
通过重复这个循环，DNA片段会指数增加。
2.2 荧光定量PCR原理荧光定量PCR在PCR的基础上进行了改进，引入荧光染料和荧光探针。
荧光染料可以与DNA结合并发出荧光信号，荧光探针可以在PCR过程中实时检测DNA的扩增情况。
1.引物设计：荧光定量PCR需要设计两个引物，一个用于扩增目标DNA，另一个用于扩增内参（house-keeping gene），作为对比和标准。
2.荧光染料：在PCR反应体系中添加荧光染料，如SYBR Green。
SYBR Green可以结合到PCR产物的DNA上，并发出荧光信号。
3.荧光探针：荧光定量PCR还可以使用荧光探针，如TaqMan探针。
TaqMan探针是一种特殊的寡核苷酸序列，它含有两个荧光染料（荧光报告染料和荧光阻断染料）和一个酶切位点。
在PCR反应中，当探针与待扩增片段结合时，酶会切除探针，导致荧光信号的降低。
4.实时检测：荧光定量PCR可以实时检测PCR反应体系中的荧光信号。
荧光信号的强度与PCR产物的数量成正比，通过检测荧光信号的变化，可以定量测量待扩增片段的数量。
荧光定量pcr的原理方法
荧光定量pcr的原理方法
荧光定量PCR（Fluorescent Quantitative PCR，qPCR）是一种用荧光信号量化检测PCR产物的方法，用于定量分析目标DNA或RNA的含量。
荧光定量PCR的基本原理如下：
1.引物设计：设计特异性引物，使其能够特异性地扩增目标DNA或RNA序列。
2.模板DNA或RNA的提取：从样品中提取目标DNA或RNA。
3.cDNA合成：对于RNA样品，需要首先将RNA反转录成cDNA，作为PCR 的模板。
4.Real-time PCR扩增反应：将模板DNA或cDNA与引物和荧光探针一起加入PCR反应体系中，进行实时PCR扩增。
PCR反应体系中还包括核苷酸，聚合酶和缓冲液等。
5.荧光信号检测：随着PCR的进行，荧光探针被解旋成单链，释放出与之配对的荧光染料。
荧光染料产生荧光信号，信号强度与扩增产物的数量成正比。
6.荧光信号检测系统：荧光信号检测系统实时检测PCR反应体系中的荧光信号，并将其转换成数值。
7.标准曲线绘制：通过使用已知浓度的标准品进行一系列稀释，绘制出标准曲线。
标准曲线将荧光信号强度与目标DNA或RNA的初始浓度之间建立了一个标准关系。
8.样品定量：通过对样品的荧光信号强度进行测量，并使用标准曲线进行插值计算，确定样品中目标DNA或RNA的初始浓度。
荧光定量PCR具有高灵敏度、高特异性、宽动态范围、低检测限和快速分析等优点，广泛应用于分子生物学和疾病诊断等领域。
荧光定量PCR的原理及其应用
荧光定量PCR的循环过程
变性
在95℃下，DNA双链被打开，形成单 链模板。
延伸
在72℃下，DNA聚合酶从引物3'端开 始延伸DNA链。
退火
感谢您的观看
THANKS
定量分析。
引物设计
引物是荧光定量PCR反应的关 键，用于扩增特定的DNA片 段。引物设计需遵循一定的 原则，如特异性、长度、GC 含量等。
反应条件
荧光定量PCR反应需要设置适 当的反应条件，如温度、时 间、循环数等。这些条件直 接影响扩增效率和准确性。
荧光信号的收集和分析
荧光信号收集
在荧光定量PCR反应过程中，仪器会自动收集每个循环的 荧光信号。这些信号可以实时监测扩增过程，并用于定量 分析。
由于荧光定量PCR技术采用了标准曲线法， 可以建立统一的定量标准，使得不同实验 之间的结果具有可比性和可重复性。
缺点
成本较高
荧光定量PCR技术需要特殊的仪器设备和荧光染料，因此 相对于传统PCR技术，其成本较高。
操作复杂
荧光定量PCR技术的操作相对较为复杂，需要经过一定的 培训和技术指导才能获得准确的结果。
用将更加深入和广泛。
对未来发展的展望和挑战
要点一
展望
荧光定量PCR技术将继续发展，新方法和新技术的应用将 进一步提高其灵敏度、特异性和自动化程度。同时，荧光 定量PCR的应用领域也将不断拓展，为临床诊断和生物科 学研究提供更多有效的工具。
要点二
挑战
尽管荧光定量PCR技术已经取得了很大的进展，但仍存在 一些挑战和限制，如提高检测灵敏度和特异性、降低成本 和提高检测速度等。未来需要不断改进和完善技术，以适 应不断变化的需求和应用场景。
1、试述荧光定量pcr技术的原理、方法、注意事项及其在临床与科研中的应用
1、试述荧光定量pcr技术的原理、方法、注意事项及其在临床与科研中的应用
荧光定量PCR是一种在PCR反应过程中，通过荧光信号的检测来对PCR产物进行实时定量分析的技术。
1. 原理：
荧光定量PCR利用荧光染料或者荧光探针，标记扩增过程中的每一个循环的产物，这些荧光标记的产物在激发光的作用下会发出荧光。
随着反应的进行，PCR产物不断累积，荧光信号也随之增强。
通过对荧光信号的实时监测，可以推断出样本中起始模板的数量。
2. 方法：
主要方法包括探针法、SYBR Green I染料法和分子信标法等。
探针法使用与目标序列特异性结合的荧光探针来标记PCR产物。
SYBR Green I染料法则是利用染料与双链DNA的结合特性，将染料添加到反应体系中，随着PCR产物的增加，染料的荧光信号也增强。
3. 注意事项：
荧光定量PCR对样品纯度要求较高，应避免杂质的干扰。
反应体系中的成分和浓度需要精确控制，以确保实验结果的准确性。
荧光定量PCR的结果解读需要参考标准曲线，以确定未知样本中的目标序列数量。
4. 在临床与科研中的应用：
在临床应用中，荧光定量PCR被广泛用于病原体检测、基因突变分析、遗传病诊断以及癌症研究等。
例如，用于检测病毒如HIV、HBV等的载量，或者检测癌症相关基因的表达水平。
在科研领域，荧光定量PCR可用于基因表达分析、基因组学和表观遗传学研究中。
例如，比较不同组织或细胞类型的基因表达差异，或者研究表观遗传修饰对基因表达的影响。
总的来说，荧光定量PCR技术是一种高灵敏度、高特异性的核酸定量分析方法，对于临床诊断和科学研究具有重要意义。
荧光定量pcr技术原理
荧光定量pcr技术原理荧光定量PCR技术（qPCR）是一种广泛应用于遗传学、病毒学、生物学以及医学等领域的分子生物学技术。
qPCR技术不仅能够准确快速地定量检测DNA模板，还可以检测RNA模板和蛋白质模板。
下面，将对qPCR技术的原理和步骤进行详细解释。
qPCR技术可以快速、精确地检测DNA，RNA和蛋白质等生物分子，其基本原理是通过PCR扩增反应，将DNA等靶分子浓缩，使其达到检测的限度。
同时，通过加入荧光标记的探针或引物，可以精确地记录反应的进程。
PCR反应完成后，荧光信号的变化可以直接反映出DNA分子的变化情况，进而得出浓度的定量结果。
qPCR反应主要包含两个步骤：PCR扩增基因片段和荧光信号检测。
PCR扩增基因片段的过程与普通PCR相同，但是在反应体系中加入荧光标记的探针或引物，所以荧光定量PCR反应的结果不仅表明结果是否出现，还可以定量检测出靶基因的数量。
因此，qPCR技术经常用于测定遗传性状、基因表达水平、微生物的定量，等等。
qPCR技术的优点主要体现在检测精度和灵敏度方面。
相对于传统的PCR技术，qPCR技术具有更高的检测灵敏度和更高的重复性，并且可以在较短的时间内处理大量样本；同时，qPCR技术可以在未开放区间（如DNA合成反应合成DNA的时候）检测反应的进程，这大大提高了实验的灵活性和可操作性。
2. 荧光定量PCR技术步骤（1）实验设计。
实验设计是qPCR技术的第一步，必须选择适当的引物和探针设计。
引物和探针的设计通常使用在线工具进行设计，二者均需具有较高的特异性，对非靶标序列不产生杂交效应，并且需要对目标序列具有较高的亲和性，以获得较好的扩增效果和检测结果。
（2）qPCR反应。
qPCR反应可以在各种qPCR仪器中进行。
在反应中，将提取的DNA或RNA按照设计好的引物和探针进行PCR扩增。
反应条件会因引物和探针的选择而有所不同。
反应结束后，qPCR仪器可以自动记录荧光信号变化，并计算扩增产物的数量，从而得出样品中目标序列的浓度。
实时荧光定量PCR原理
实时荧光定量PCR原理1.PCR基本原理PCR通过在不断循环的体系中复制和放大特定DNA片段，从而实现DNA的快速扩增。
PCR反应通常包括三个步骤：变性、退火和延伸。
在变性步骤中，DNA的双链结构被解开，形成两条单链DNA。
在退火步骤中，引物与目标DNA的互补序列结合，形成引物-目标DNA结合复合物。
在延伸步骤中，DNA聚合酶通过追加互补碱基，并使用引物作为起始点，在目标DNA的基础上合成新的DNA链。
实时荧光PCR是对传统PCR技术的改进，它通过添加荧光探针（也称为探针引物）来实时监测PCR反应的进程。
荧光探针通常由两部分组成：一个荧光标记物和一个定向增效子。
在PCR反应的延伸步骤中，荧光探针与目标DNA的互补序列结合，并被PCR酶切割，导致荧光信号被释放。
3.原理图解实时荧光PCR通常需要使用一个双喷嘴热循环仪（Thermal Cycler），其中一个喷嘴用于控制样品的温度，另一个喷嘴用于实时监测PCR反应的进程。
具体的PCR反应流程如下：-备制PCR试剂：将PCR反应所需的试剂混合均匀，包括DNA模板、引物、荧光探针和内参物。
-生成PCR产物：通过一系列的循环反应，将DNA模板放大成大量的PCR产物。
-荧光信号监测：PCR反应过程中，荧光探针与PCR产物的结合会释放荧光信号。
实时荧光PCR系统通过探测和记录PCR反应体系中的荧光信号，并在每个循环结束时测定信号强度。
4.数据解读和PCR效率计算实时荧光PCR的结果通常以荧光信号的周期阈值（Ct值）表示，Ct值是荧光信号强度超过背景噪音的循环数。
Ct值越低，表示PCR产物浓度越高，反之亦然。
根据Ct值，可以计算PCR的效率。
效率（E）的计算公式为：E =10^(-1/slope) - 1，其中slope为荧光曲线的斜率。
效率越接近1，表示PCR反应越有效。
5.RT-qPCR的应用RT-qPCR可应用于多个领域，包括基因表达分析、病原体检测和药物开发等。
荧光定量pcr实验原理与应用
荧光定量pcr实验原理与应用荧光定量PCR（qPCR）是一种高灵敏度、高特异性的DNA扩增技术，通过检测PCR反应体系中的荧光信号实时监测DNA的合成量。
这种技术结合了传统PCR的高效性和荧光探针的高度特异性，广泛应用于基因表达分析、病原体检测、基因定量、基因型鉴定等领域。
一、原理荧光定量PCR利用荧光信号与PCR产物数量呈正比的原理，通过实时监测PCR反应过程中荧光信号的强度变化来确定反应体系中模板DNA的初始量。
在PCR反应中，荧光探针与特定的DNA序列结合，并发出荧光信号。
随着PCR反应的进行，产物数量逐渐增加，荧光信号也随之增加。
通过检测荧光信号的增长曲线，可以确定初始模板DNA的数量。
二、应用1.基因表达分析：荧光定量PCR可用于实时监测基因的表达水平，通过检测靶基因的mRNA量来研究基因在不同条件下的表达情况。
2.病原体检测：荧光定量PCR可用于快速准确地检测病原体的存在，如病毒、细菌等，对临床诊断和疾病监测具有重要意义。
3.基因定量：荧光定量PCR可用于定量分析基因拷贝数、基因表达水平等，对基因功能研究和疾病诊断有重要作用。
4.基因型鉴定：荧光定量PCR可用于检测基因型多态性，如单核苷酸多态性（SNP）、插入缺失等，用于遗传学研究和个体鉴定。
三、优势与传统PCR技术相比，荧光定量PCR具有以下优势：1.高灵敏度：荧光信号与PCR产物数量呈正比，可实现低拷贝数DNA的检测。
2.高特异性：荧光探针设计精准，可准确识别靶基因序列，避免非特异性扩增。
3.实时监测：可实时监测PCR反应过程中的荧光信号，得到实时、准确的反应动态信息。
4.高准确性：荧光定量PCR结果稳定可靠，可用于定量分析和比较研究。
荧光定量PCR作为一种高效、高灵敏的DNA定量技术，在生命科学研究、临床诊断、食品安全监测等领域具有广泛应用前景。
随着技术的不断发展和完善，荧光定量PCR将在更多领域发挥重要作用，为科学研究和临床实践提供强有力的支持。
荧光定量PCR原理及应用
荧光定量PCR原理及应用首先，PCR反应：荧光定量PCR使用特异性引物将目标DNA序列扩增。
PCR反应通常包括以下步骤：变性、退火和延伸。
在变性步骤中，反应体系中的DNA双链被加热至95°C，使其变性成两个单链。
随后，在退火温度下，引物与目标DNA的互补序列结合。
最后，在延伸温度下，DNA聚合酶以引物为模板合成新的DNA链。
这些步骤会重复多次，每次都会使目标DNA序列的拷贝数翻倍。
接下来，扩增曲线：随着PCR循环的进行，扩增曲线会呈指数增加。
扩增曲线反映了PCR反应体系中拷贝数的变化。
在扩增曲线的指数增长阶段，荧光信号会迅速增加。
随着PCR循环数增加，荧光信号的增加速率会逐渐减慢。
根据扩增曲线的特征，可以计算出PCR的阈值周期数（Ct值），即荧光信号超过背景噪音的周期数。
Ct值可以用来定量目标DNA序列的拷贝数。
最后，荧光探针：荧光探针是一种含有荧光染料和阻尼染料（quencher）的引物。
引物特异性地结合在扩增产物的靶标序列上。
在引物结合的过程中，荧光信号被抑制。
当引物与靶标序列结合后，PCR反应体系中DNA聚合酶会将DNA链分离，使荧光信号被释放出来。
通过检测释放的荧光信号，可以定量PCR反应体系中目标DNA序列的拷贝数。
1.肿瘤检测：荧光定量PCR可以检测肿瘤相关基因的突变、重排和拷贝数变化。
通过定量目标基因的变化，可以实现对肿瘤的早期诊断和治疗监测。
2.微生物检测：荧光定量PCR可以快速检测致病微生物的存在。
例如，在食品安全领域，可以用荧光定量PCR检测食品中的细菌和病毒污染。
3.分子诊断：荧光定量PCR可以定量检测与疾病相关的遗传变异。
例如，可以通过荧光定量PCR检测与遗传病相关的突变，为临床诊断提供准确的基因检测结果。
4.环境监测：荧光定量PCR可以快速检测环境中的微生物群落的变化。
例如，在水源污染监测中，可以用荧光定量PCR检测水体中的细菌和寄生虫的存在。
总之，荧光定量PCR是一种快速高效的检测技术，可以广泛应用于医学诊断、食品安全、环境监测等领域。
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荧光扩增曲线分三阶段
荧光背景信号，荧光信号指数扩增阶段，平台期 荧光背景信号阶段：该时期扩增的荧光信号被背景信
号所掩盖，扩增产物量无法判断。 平台期：扩增产物不再呈指数增加，PCR终产物量与 起始模板量无线性关系，无法计算起始DNA拷贝数。 荧光信号指数扩增阶段：该时期，PCR产物量的对数 值与起始模板量呈线性关系，因此选择这一阶段进行 定量分析。引入两个概念：荧光阈值和Ct值。
实时定量PCR的两个重要概念
（1）荧光域值（ threshold）：荧光扩增曲线上
人为设定一个值，以PCR反应的前15 个循环的荧光 信号作为荧光本底信号，一般荧光域值定义为315个循环的荧光信号的标准偏差的10 倍。
阈值 = 基线信号的标准偏差 x 10
实时定量PCR的两个重要概念
(2)Ct值：也称循环阈值，C代表Cycle，t代表
结合SYBR Green I
退火：产生荧光信号
SYBR Green I 染料仅在与双链 DNA（dsDNA）结合时发射荧
光，所发射的光波是蓝色光。SYBR Green I 不会与单链 DNA 结合，因此变性时荧光强度最低。dsDNA形成单链（图 A） 合成双链（图 B）时，SYBR Green I 结合于dsDNA上，结合的 SYBR Green I（绿色光）的荧光信号强度增强。延伸末期（图 C）时，所有 DNA 均是双链，结合状态的SYBR Green I 含量 达最大，该 PCR 周期中荧光信号也达最大。因此，通常是在 延伸期结束时进行 SYBR Green I 荧光信号测定。
实时荧光定量PCR
实时荧光定量PCR技术是一种在PCR反应体系中加入 荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程， 最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 实时荧光定量PCR技术不仅实现了对DNA模板的定 量，而且具有灵敏度高，特异性和可靠性强，重复 性好，自动化程度高、无污染性等突出优势，因此 被公认为当今世界用于临床的最先进核酸分子诊断 技术。
SYBR Green I荧光染料的作用原理
SYBR Green I是一种只与双链DNA小沟结合的荧光染料
，可与所有的各种序列的双链 DNA 分子结合。 当它与DNA双链结合时，发出荧光；变性时，DNA双链 分开时，荧光信号急剧减弱。 在延伸结束阶段，采集荧光信号。 因此，在一个体系内，信号强度与DNA双链总数目成正 比其信号强度代表了双链DNA分子的数量。
阴性结果曲线图示
阳性结果曲线图示
实时荧光定量PCR基本原理
在常规PCR反应的基础上，加入荧光染料或荧光标记
的探针，随着PCR反应的进行，PCR产物不段累积，荧 光信号强度等比增强。每经过一个循环，收集一个荧 光强度信号，这样通过荧光强度变化监测产物量的变 化，从而得到一条荧光扩增曲线。 通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实 时检测，从而对起始模板定量及定性的分析。
染料法优缺点
优点 成本低 通用性好 适合初步筛查 融解曲线功能，分析非特异 性扩增 缺点 只能检测单一模板，无法多 重检测 无模板特异性，非特异性扩 张和引物二聚体也产生荧光 敏感度低，不能准确测序低 拷贝模板 荧光本底高，易引起假阳性
荧光共振能量转移（FRET）
当某个荧光基团的发射谱与另一个荧光基团的吸收光
Rn ：第n个循环时的总信号 RB ：本底 RS ：单位信号强度 X0 ：起始DNA数目 E：PCR效率
Rn = RB + X0 (1+ E)n Rs
当循环次数n=CT值时： RT = RB + X0 (1+ E)CTRs lg (RT-RB) = lg X0 + CT lg (1+ E) + lg Rs CTlg (1+ E) = - lg X0 + lg (RT -RB) – lg Rs
为三个典型时期： 早期背景扩增期、中期指数扩增期（或对数线形扩增 期），以及晚期的平台期
理论上PCR过程中反应产物是以指数规模增长的，但实际的 PCR扩增曲线并不是标准的指数曲线，而是S形曲线； 因为随着PCR循环数的增加，扩增规模迅速增大，Taq酶、 dNTP、引物，甚至DNA模板等各种PCR要素逐渐不敷需求， PCR的效率降低，产物生成的速度逐渐减缓，最终进入平台 期。
PCR扩增的理论模式
PCR中，随着扩增周期的增加，模板以指数方式进行扩增。
PCR 理论方程：N = N0 × (1+E)n
N: 扩增子数量 N0: 起始模板数量 E：扩增效率 n: 循环数
此公式仅在指数扩增期（20-30个循环）内成立。
PCR分期——“S”形曲线
对 PCR 扩增过程的详细分析表明，PCR 扩增曲线可被分
–SYBR® Green I –溴乙锭(Ethidium Bromide) 探针标记-特异性检测 – TaqManTM – TaqMan MGB – Dual-oligo FRET pairs – 分子信标(Molecular beacons) – ScorpionsTM/AmplifluorTM
特异性高
多重基因定量
荧光强度正比于产物 不可逆反应 信号生成后不会自动淬灭
Real time PCR优点
对整个PCR实时监控，明确了指数扩增期，进而可对
起始模板进行定量，且定量范围广； 测定敏感性高，比电泳方法的灵敏度高2-3个数量级； 测定准确度和重复性好，Ct值和模板起始浓度有函数 关系； 大大降低实验室“污染”的可能性。无需后续处理产 物，可分样本处理区，加样去，检测区三区即可。
定性检测
实时荧光定量PCR技术的应用
特定病原的检测 疾病的诊断 GMO检测 基因分型（如SNP、耐药性检测） 辨别真伪的检测
（A或B？ 有或无？是什么？）
定量分析
绝对定量
(有多少？差几倍？）
病原载量的定量 GMO成分的评估 残留DNA的测定 相对定量 基因表达差异的比较 治疗手段的效果评估
○PCR扩增的理论模式
○Real time PCR理论基础
PCR是将样本中微量的DNA模版放大来研究模版特性。
随着研究的深入，要了解样本中基因的表达模式与疾 病的关系，就需要了解标本中的DNA原始拷贝数。
由于各种环境因素的复杂相互作用，不同的PCR反应
体系进入平台期的时间和平台期的高低都有很大变化 ，即使是重复实验，各种条件基本一致，最后得到的 DNA拷贝数也往往不同。 因此经过PCR扩增的DNA产物量不能反映起始模板量 的真实情况。 通过凝胶电泳EB染色或者同位素标记只能定量PCR的 终产物量，而不能定量起始DNA模版的拷贝数。
threshold。指在PCR循环过程中荧光信号开始由本底 进入指数增长阶段的拐点所对应的循环次数。在实际 操作中，Ct值也就是每个反应管内的荧光信号到达设 定的域值的循环次数,可见Ct值取决于阈值。
基线
阈值 Ct值
Ct值∝DNA起始浓度
Ct值与模板DNA的起始拷贝数的对数存在线性关系。 起始拷贝数越多，达到荧光阈值的Ct值越小。 Rn = RB + X0 (1+ E)n Rs 总信号=本底信号+分子数量×单位信号强度
即 CT= - k lg X0 + b （线性方程）
定量方法
利用已知起始拷贝数的标准品做出标准曲线，纵坐标
代表起始拷贝数的对数，横坐标代表Ct值。所以，只 要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该 样品的起始拷贝数。
Real time PCR 化学原理
双链DNA结合染料染色-非特异性检测
两种定量方法
两种定量方法
终点定量 无规律 终点产物数量：误差大 起点定量 对数期分析：平行性好 拐点产物数量：重现性好， 误差小 扩增效率恒定，标准曲线 呈线性
影响因素多
起始DNA量，更具意义 重现性好，误差小
扩增效率恒定，标准曲线呈线性
普通CR技术的检测模式
普通PCR仪器扩增， 约2.5小时 阴性
探针完整时，报告基团发射的荧光信号被近距离的淬
灭基团吸收；随着PCR的进行，Taq酶在链延伸过程中 遇到与模板结合的探针， 其5‘－3’外切酶活性将探针 酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，游 离于反应体系中，从而荧光监测系统可接收到荧光信 号。
TaqMan探针的数量关系
每扩增一条DNA链，就切断一条探针；
每切断一条探针，就产生一个单位荧光信号，实现了
荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步； 信号强度与结合探针的DNA分子数成正比，报告信号 的强度就代表了模板DNA的拷贝数。
因此该技术可对模板进行准确定量。由于扩增产 物较短时效率较高，故扩增长度一般为50—150bp 。
TaqMan探针的优点
谱重叠，且两个基团距离足够近时，能量可以从短波 长（高能量）的荧光基团传递到长波长（低能量）的 荧光基团，这个过程称为荧光共振能量转移(FRET)， 实际相当于短波长荧光基团释放的荧光被屏蔽。 Hybprobe探针和水解探针均基于 FRET （荧光共振能 量传递）的原理设计的。
TaqMan探针法-水解探针
PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的
荧光探针，该探针只与模板特异性地结合，其结合位 点在两条引物之间。 TaqMan探针为一寡核苷酸，包含两个分子标记，探针 的5′端标记有荧光报告基团(Reporter, R)，如FAM、 VIC等，3′端标记有荧光淬灭基团(Quencher, Q)，如 TAMRA等。
样品检测结果
无法定量
琼脂糖凝胶电泳， 约1小时
阳性
EB染色，约20分钟 紫外成像
实时荧光定量PCR的检测模式
荧光定量PCR仪器扩 增，约2小时
光滑的S型指数曲线， 阳性 检测过程有实时监测 数据 无S型指数曲 线，阴性