荧光定量PCR仪技术原理(罗氏)
荧光定量PCR原理及实验步骤精选全文
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荧光定量PCR原理及实验步骤
一、实时荧光定量PCR原理
常规PCR技术对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测。
实时定量PCR技术，在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析。
几个概念：
（1）扩增曲线：
（2）荧光阈值：
（3）Ct值：
（4）标准曲线
SYBR Green工作原理：
1、SYBR Green 能结合到双链DNA的小沟部位
2、SYBR Green 只有和双链DNA结合后才发荧光
3、变性时，DNA双链分开，无荧光
4、复性和延伸时，形成双链DNA，SYBR Green 发荧光，在此阶段采集荧光
信号。
二、实验步骤
1. 实验前先在大型仪器共享平台上预约多元荧光定量PCR仪。
1、将所需引物和SYBgreen（避光）拿出，解冻。
计算好所有引物和SYBgreen
的用量。
2、反应体系（25μL）如下：
H2O 11μL
SYBgreen 12.5Μl
上游引物0.25μL
下游引物0.25μL
cDNA 1μL
可先将H2O 和SYBgreen按照所需量配好后，分装，再根据需要加引物和模板。
4、加完所有试剂后，盖上盖子，混匀，离心。
上机。
荧光定量pcr仪原理
荧光定量pcr仪原理
荧光定量PCR仪是一种用于测量PCR反应过程中荧光信号的仪器。
其原理基于PCR反应中的DNA扩增过程以及荧光染料的发射和检测。
PCR是一种通过使用DNA聚合酶酶和特定引物，在适当的温度下连续进行反复的DNA复制过程。
PCR反应通常包含三个基本步骤：变性（解旋DNA双链），退火（引物结合到模板DNA上），和延伸（DNA聚合酶沿引物扩增目标序列）。
此过程会导致目标DNA序列数量的指数性增加。
荧光定量PCR仪中，DNA的扩增过程通常伴随着一种荧光染料的加入。
这种荧光染料会在扩增过程中与新合成的DNA结合，产生荧光信号。
荧光定量PCR仪通过在PCR反应过程中记录荧光信号的强度来测量PCR反应的进程。
仪器中的光学系统会周期性地激发荧光信号，并通过检测器检测信号的强度。
荧光定量PCR仪可以记录每一个PCR循环的荧光信号，然后使用计算机软件分析这些信号的特征，例如峰值高度或面积。
通过与已知浓度的标准样品进行比较，可以利用荧光信号的强度来定量PCR反应中的目标DNA的初始浓度。
罗氏荧光定量pcr仪器
罗氏荧光定量PCR仪器简介罗氏荧光定量PCR仪器（Roche Real-Time PCR System）是一种用于荧光定量PCR（Polymerase Chain Reaction）的仪器。
PCR技术是一种广泛应用于分子生物学领域的技术，可以在体外大量复制DNA序列。
荧光定量PCR通过荧光信号的强度来定量PCR反应产物的数量，具有高灵敏度、高准确性和高通量的特点，被广泛应用于生命科学研究、疾病诊断和药物研发等领域。
罗氏是一家全球领先的医药和诊断解决方案提供商，旗下的荧光定量PCR仪器采用先进的技术和设计，为用户提供可靠和精确的PCR分析结果。
主要特点1.高灵敏度：罗氏荧光定量PCR仪器采用先进的光学系统，能够检测和定量非常低浓度的荧光信号，提高了实验的灵敏度。
2.高准确性：仪器内置的精确温度控制系统和优化的PCR反应条件，保证了实验结果的准确性和可重复性。
3.高通量：罗氏荧光定量PCR仪器支持多样品同时进行PCR反应，大大提高了实验的通量，节省了时间和成本。
4.灵活性：仪器配备了多样的PCR试剂和芯片，可以适应不同实验需求的扩增反应。
5.友好的用户界面：仪器具有直观的用户界面和易于操作的软件，用户可以轻松设置实验参数、监控实时反应和分析数据结果。
主要应用罗氏荧光定量PCR仪器在各种领域都有广泛的应用，包括但不限于以下几个方面：1.基因表达分析：通过定量PCR技术，可以准确测量基因在不同组织、细胞或疾病状态下的表达水平，帮助科研人员了解基因的功能和调控机制。
2.微生物检测：罗氏荧光定量PCR仪器可以用于检测和定量微生物如细菌、病毒、真菌等的核酸序列，广泛应用于食品安全、临床微生物学和环境监测等领域。
3.病毒载量检测：病毒载量是评估病毒感染严重程度的重要指标，罗氏荧光定量PCR仪器可以定量分析病毒的核酸含量，用于临床病毒学研究和病毒感染诊断。
4.药物研发：罗氏荧光定量PCR仪器可以用于药物研发过程中的基因表达分析、药物代谢相关基因的筛选和药物安全性评估等方面，为药物研发提供有力支持。
罗氏rochelc96原理
罗氏rochelc96原理
罗氏基因扩增仪是一种用于进行聚合酶链式反应（PCR）的仪器，其原理与常规PCR仪相似，但可能具有更高的精度、灵敏度和自动化程度。
以下是其基本原理：
一、热循环：罗氏基因扩增仪通过热循环的方式控制温度，使得PCR反应中的不同步骤（变性、退火、延伸）可以在不同的温度下进行。
热循环通常由Peltier热电堆控制，可以快速准确地升降温度。
二、样品定位：罗氏基因扩增仪通常配备有多个样品位，每个样品位可以放置一个反应管或板。
样品定位系统可以确保每个反应管或板被准确放置在相应的温度区域中，以保证PCR反应的准确性和可靠性。
三、自动化控制：罗氏基因扩增仪通常具有自动化控制系统，可以通过预设程序自动执行PCR反应的温度循环、时间控制、温度梯度等参数。
这样可以提高操作的便捷性和重复性，减少操作者的操作失误。
四、检测和分析：一些罗氏基因扩增仪还配备有检测和分析系统，可以实时监测PCR反应的进程，并对反应产物进行定量或定性分析。
这样可以及时评估PCR反应的质量和结果。
总的来说，罗氏基因扩增仪的原理是基于PCR技术，通过精确控制温度、样品定位和自动化控制等功能，实现对PCR反应的快速、准确和可靠的执行，从而满足科研、临床和其他领域对PCR技术的需求。
荧光定量PCR的原理方法及结果分析
荧光定量PCR的原理方法及结果分析荧光定量PCR（quantitative polymerase chain reaction，qPCR）是一种常用的检测DNA或RNA含量的方法，通过测定荧光信号的强度来确定起始模板数量的多少。
其原理主要包括引物的选择、PCR反应的进行、荧光信号的测定以及数据分析等步骤。
首先，荧光定量PCR需要选择适当的引物。
引物的设计要求首先能够特异性地与目标序列结合，这样才能保证只有起始模板被扩增。
引物的长度通常在18-24个碱基对之间，GC含量在40-60%之间，碱基序列中不能存在太多的重复序列或者分子倒序等结构。
此外，引物的Tm值应该相近，不应过于接近，以免引物发生二次结合。
另外，荧光标记的引物通常采用双探针（dual-labeled probe）和SYBR Green I染料，二者的优缺点各有不同：双探针对应用的目标突变不敏感，但是对于长序列的目标扩增效果较好；SYBR Green I适用于鉴定多个不同基因的扩增，但是对于PCR产物的目标特异性检测较差。
其次，PCR反应的进行是荧光定量PCR的核心步骤。
反应体系通常包括引物、模板DNA、DNA聚合酶、荧光标记剂和反应缓冲液。
PCR反应过程中，首先是变性，将模板DNA的双链分离；然后是退火，使引物与目标序列结合；接着是延伸，DNA聚合酶在适当的温度下进行链延伸。
PCR反应的循环数通常在25-40之间，具体循环数多少需要根据目标序列的长度和浓度来决定。
PCR反应条件的优化要注意引物浓度、PCR温度和时间。
第三，荧光信号的测定是荧光定量PCR中不可或缺的步骤。
通常，荧光信号的测定可以通过荧光实时扩增仪来进行。
在每一个PCR循环过程中，荧光实时扩增仪会记录下PCR反应管中荧光信号的强度。
随着PCR反应的进行，PCR产物的数量也在逐渐增加，荧光信号的强度也会增加。
荧光信号的强度与PCR产物的数量之间存在着一定的线性关系，利用标准曲线可以将荧光信号的强度转化为起始模板的绝对数量。
罗氏实时荧光定量PCR仪课件
02
罗氏实时荧光定量PCR仪 介绍
仪器的基本结构
仪器外观
操作界面
罗氏实时荧光定量PCR仪外观为长方 体，尺寸适中，便于实验室放置。
仪器配备彩色触摸屏，操作界面友好 ，方便用户进行参数设置和实验操作 。
内部结构
仪器内部包括加热模块、光学检测系 统、电脑控制系统等部分，各部分协 同工作完成PCR扩增和荧光检测。
制定仪器的维护保养计划，按照 计划进行保养，保证仪器的正常
运行和使用寿命。
THANKS
感谢观看
通过比较不同样本之间的基因表达数据，可以筛选出差异表达的基 因，进一步研究其在生物学过程中的作用。
基因表达调控机制研究
通过实时监测基因转录水平的变化，有助于深入了解基因表达的调 控机制，为相关疾病的研究和治疗提供线索。
在病毒检测中的应用
1 2 3
病毒载量测定
利用罗氏实时荧光定量PCR仪，可以快速、准确 地测定病毒载量，为临床诊断和治疗提供依据。
02
根据错误提示查找相关资料或联系技术支持解决。
仪器运行结果不准确
03
检查样品是否符合要求，运行程序是否正确，仪器是否经过校
正等。
仪器的保养与校正
定期清洗仪器内部
根据仪器使用情况定期清洗仪器 内部，包括清洗反应管、更换滤
芯等。
校正仪器
定期邀请专业技术人员对仪器进 行校正，确保仪器准确性。
建立维护保养计划
详细记录实验数据，包括荧光信号的 变化、扩增曲线等，并对数据进行整 理和分析。
实验后处理
仪器清洁与保养
数据审核与报告撰写
实验结束据进行审核，撰写详细的实验报 告，包括实验目的、方法、结果和结论等 。
样品处理
罗氏荧光定量
罗氏荧光定量1. 简介罗氏荧光定量是一种常用的生物化学分析技术，用于测定样品中特定物质的含量。
该技术基于罗氏荧光染料与目标物质之间的特异性结合，通过测量荧光信号的强度来计算目标物质的浓度。
2. 原理罗氏荧光定量的原理基于荧光共振能量转移（FRET）现象。
FRET是一种非辐射能量传递的过程，其中一个荧光染料（受体）吸收能量并将其传递给另一个荧光染料（供体），从而引起供体的荧光发射。
在罗氏荧光定量中，供体和受体分别与目标物质的特定结构域结合。
当目标物质存在时，供体和受体之间的距离会发生改变，从而影响FRET的效率。
通过测量供体的荧光强度变化，可以计算目标物质的浓度。
3. 实验步骤3.1 样品准备首先，需要准备样品，样品可以是生物体、细胞、蛋白质等。
样品应根据实验的要求进行处理和处理，以确保准确测量目标物质的浓度。
3.2 罗氏染料标记接下来，需要将罗氏染料标记在样品中的目标物质上。
这可以通过化学反应或特定的结合方式实现。
标记过程需要确保染料与目标物质之间的特异性结合，并且不影响目标物质的功能和性质。
3.3 荧光测量完成标记后，可以进行荧光测量。
通常使用荧光分光光度计或荧光显微镜来测量样品中的荧光强度。
荧光测量需要选择适当的激发波长和发射波长，并根据实验要求进行多次测量以确保结果的准确性。
3.4 数据处理与分析最后，需要进行数据处理和分析。
根据荧光测量结果，可以绘制荧光强度与目标物质浓度之间的标准曲线。
通过与标准曲线的比较，可以计算样品中目标物质的浓度。
4. 应用领域罗氏荧光定量广泛应用于生物医学研究和临床诊断中。
以下是一些常见的应用领域：4.1 蛋白质定量罗氏荧光定量可用于测定蛋白质样品中特定蛋白质的浓度。
这对于研究蛋白质相互作用、酶促反应和蛋白质表达水平的变化非常有用。
4.2 DNA/RNA定量罗氏荧光定量也可以用于测定DNA或RNA样品中的目标序列的浓度。
这对于分子生物学研究、基因表达分析和疾病诊断非常重要。
罗氏荧光定量
罗氏荧光定量
【最新版】
目录
1.罗氏荧光定量的概述
2.罗氏荧光定量的原理
3.罗氏荧光定量的应用领域
4.罗氏荧光定量的优势与局限性
正文
罗氏荧光定量（Roche Fluorescence Quantification）是一种荧光定量检测技术，广泛应用于生物科学、医学研究和药物研发等领域。
通过对荧光信号的定量检测，可实现对生物分子的数量、活性和其他特性的准确分析。
罗氏荧光定量的原理是基于荧光信号的强度与生物分子的数量成正比。
当荧光标记的生物分子与待测样本中的目标分子结合时，荧光信号的强度会发生变化。
通过检测荧光信号的强度，可以推算出目标分子的数量。
这种方法具有高灵敏度、高特异性和高重复性等优点，有利于实现对生物分子的精确定量。
罗氏荧光定量技术在多个应用领域发挥着重要作用。
在生物科学研究中，该技术可用于检测基因表达、蛋白质表达和细胞因子等生物分子的数量。
在医学研究中，罗氏荧光定量技术可以用于疾病标志物的检测和疾病进展的监测。
在药物研发领域，该技术可用于评估药物的作用机制、药效和毒性等。
尽管罗氏荧光定量技术具有众多优势，但仍存在一定的局限性。
例如，荧光标记的生物分子可能会发生褪色或降解，影响检测结果的准确性。
此外，荧光定量检测受到荧光波长、荧光强度和检测时间等因素的影响，需要进行严格的质量控制和数据处理。
总之，罗氏荧光定量技术是一种具有广泛应用前景的荧光定量检测方法。
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PCR 定量方法
绝对定量模式
相对定量模式
外标准 (单色检测)
外标准 含内参照 (双色检测)
校准品校准
外标准 (无校准品)
无扩增效率校正
有扩增效率校正
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20
10
实时荧光定量PCR的原理公式
N＝N02n=N0(1+E)n logN=
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21
绝对定量原理（标准曲线）
Target
未知标本
未知标本
log (F2/F1) log (F2/F1)
n
Crossing Point (Cycles) Crossing Point (Cycles)
标准曲线 (外标准或内标准)
标准曲线 (外标准或内标准)
log (F2/F1) log (F2/F1)
E = 1.90 n = 30
N = N0 x (1.90)30 = N0 x 2.3 x 108
N : number of amplified molecules N0 : initial number of molecules
n : number of amplification cycles E : amplification efficiency
5’
10
5
定量PCR原理
染料检测-SYBR Green I
Excitation
5’ 3’
SG SG
Emission
SG SG SG
3’ 5’
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Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET)
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2
1
Target Amplification
No. of Cycles No. Amplicon Copies of Target
1 cycle = 2 Amplicon
2 cycle = 4 Amplicon
1 2 3 4 5
2 4 8 16 32 64 1,048,576 1,073,741,824
绝对和相对定量困难(相对于看家 不仅可以相对定量，还可以绝 基因的定量复杂) 对定量
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5
Cp(Crossing point) or Ct (Cycler threshold)： Cp值，
指样本在PCR过程中其反应液荧光信号增加到超过其 本底荧光时所需要的循环数。
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14
PCR 定量原理
绝对定量模式
相对定量模式
外标准 (单色检测)
外标准 含内参照 (双色检测)
校准品校准
外标准 (无校准品)
无扩增效率校正
有扩增效率校正
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LightCycler 双色检测
原理:
2 对杂交探针 第一对探针标记Fluorescein/LC Red 640 第二对探针标记Fluorescein/LC Red 705
Efficiency depends on:
- 引物 - 片段长度
- 序列(GC)
- 模板纯度
- RT Primer 与 PCR Primer的间距
(RT-Applications)
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定量－扩增效率的影响
n = 30 E = 1.95
N = N0 x (1.95)30 = N0 x 5.0 x 108 2.2-fold difference
31
绝对定量：含内参照和标准品（ 双色检测）
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32
16
绝对定量（含内参照和标准品）-Summary
•
先决条件: 标准品是有已知浓度的目的基因 标准品与样本具有相同的PCR扩增效率
• 特别应用领域: Bacteriology, Virology • 优点: 结果可通过 LightCycler Software 3.53软件快速分析 可以质控PCR抑制剂的存在 (可靠的绝对定量值) • 局限性: 动力学范围较低 (approx. 3-5 magnitudes) 须使用双光检测（Hybridization Probe format ） 无法区分影响PCR扩增效率的因子？
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绝对定量－标准品的准备
纯度: - 要求不含有核苷，引物及盐等干扰PCR的因素，使用 High Pure PCR Product Purification Kit 或MagNAPure LC
浓度： - 测量260nm的吸光度
- 调整模板工作浓度使得加入体积 2 µl 以减少移液误差 处理: - 使用硅化的试管，防气溶胶的无菌枪头 - 对于低浓度模板可加入沉降核酸(e.g., tRNA, 10 ng/µl) - 分装保存 -20°C (DNA) or -70°C (RNA) Roche Appliedry
•
先决条件
已知的标准品浓度 外标准品与样品有相同的 PCR-扩增效率 • 典型应用的领域: 细菌学，病毒学 • 优点: 动态范围广 (10 -1010 copies) 结果可通过 LightCycler 软件快速分析 检测模式灵活（SYBR Green， 水解探针，杂交探针） • 方法的局限性： 对PCR抑制剂及其他因子对PCR的影响未知
PCR与荧光定量PCR区别 荧光定量PCR的检测模式 荧光定量PCR的定量分析 荧光定量PCR的溶解曲线分析
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9
定量PCR原理
染料检测-SYBR Green I
SG SG SG
5’
Emission Excitation
SG SG
3’
3’
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26
13
绝对定量－标准曲线制作
使用至少3个点，最好5个点 对于中等浓度和高浓度，每个稀释度需要一个位点 对于在一个局限的检测范围内的定量，使用两次重复甚至三次重复 制备标准曲线时，使用的稀释系列最好每个梯度选一个点 (e.g., 1:10, 1:100, 1:1000, ...)
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优势: 同时检测2个独立的靶目标序列 应用: 多重 PCR，对多个靶目标同时进行突变分析
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30
15
绝对定量：含内参照和标准品（ 双色检测）
标准品
目的基因（标记 LC Red 640） 内参照（标记 LC Red 705）
未知标本 (26)
阴性对照
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17
主要内容
PCR与荧光定量PCR区别 荧光定量PCR的检测模式 荧光定量PCR的定量分析 荧光定量PCR的溶解曲线分析
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18
9
LightCycler 在科研方面的应用
定量分析
基因分型（SNP）
产物性质分析
log (copy number)
n
log (copy number)
38
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22
Roche Molecular Biochemicals
Diagnostics
LightCycler的定量原理
11
定量的先决条件
EfficiencyStandard = EfficiencySample
7
Ct值与起始模板的关系
N=N0×E n，logN=log N0 +nlogE n=Ct
Ct值与起始模板的关系研究表明：每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数 存在线性关系。起始拷贝数越多，要达到域值所需得循环数越少，即Ct值越小。
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8
4
主要内容
N： N0： N： E： 扩增产物量; 启始模板量; 循环数; 扩增效率 (0 E1)
log(1+E)n+logN0 -nlog(1+E) +logN
logN0=
Cp =n = －logN0/log(1+E) +logN/log(1+E) (Y=kX+b )
结论：Cp值与模板起始浓度的负对数成线性关系
荧光定量PCR技术原理
罗氏诊断产品（上海）有限公司 广州办事处 应用科学\分子诊断部 应用专员 胡旭霞 Xu_xia.hu@
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1
主要内容
PCR与荧光定量PCR区别 荧光定量PCR的检测模式 荧光定量PCR的定量分析 荧光定量PCR的溶解曲线分析
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6
定量PCR原理
探针检测-水解探针
5’ 5’ 3’
Excitation Excitation R
R R
3’ 3’ 5’
R
Q Q Q Q
3’
5’
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杂交探针（HybProbe）
Oligo 1: Fluorescein Transfer