荧光PCR检测原理
荧光定量 pcr 的基本原理和步骤
荧光定量PCR的基本原理和步骤
荧光定量PCR（quantitative polymerase chain reaction，qPCR）是一种常用的分子生物学技术，可以用于检测和定量DNA或RNA分子。
其基本原理是在PCR过程中加入荧光探针，通过监测荧光信号的强度来定量PCR产物的数量。
下面是荧光定量PCR的基本步骤：
1. 样品处理：首先需要从待检测样品中提取DNA或RNA，并进行适当的处理，例如反转录、扩增等。
2. 设计引物：根据待检测的目标序列设计特异性引物。
3. PCR反应体系的制备：将引物、荧光探针、dNTPs、PCR缓冲液等混合，制备PCR反应体系。
4. PCR反应：将样品DNA或RNA与PCR反应体系混合，进行PCR反应。
5. 荧光定量：在PCR反应过程中，荧光探针会结合到目标序列上，并通过荧光信号的产生来检测PCR产物的数量。
在荧光定量PCR中，通常采用SYBR Green或TaqMan探针来检测PCR产物的数量。
6. 数据分析：通过对荧光信号的强度进行分析，计算出样品中目标序列的数量，并进行比较和分析。
需要注意的是，在荧光定量PCR中，需要选择合适的荧光探针和荧光信号检测系统，以确保准确和可靠的结果。
此
外，为了避免PCR过程中的污染和误差，需要严格控制PCR 反应条件和操作流程。
荧光定量pcr的原理方法
荧光定量pcr的原理方法
荧光定量PCR（Fluorescent Quantitative PCR，qPCR）是一种用荧光信号量化检测PCR产物的方法，用于定量分析目标DNA或RNA的含量。
荧光定量PCR的基本原理如下：
1.引物设计：设计特异性引物，使其能够特异性地扩增目标DNA或RNA序列。
2.模板DNA或RNA的提取：从样品中提取目标DNA或RNA。
3.cDNA合成：对于RNA样品，需要首先将RNA反转录成cDNA，作为PCR 的模板。
4.Real-time PCR扩增反应：将模板DNA或cDNA与引物和荧光探针一起加入PCR反应体系中，进行实时PCR扩增。
PCR反应体系中还包括核苷酸，聚合酶和缓冲液等。
5.荧光信号检测：随着PCR的进行，荧光探针被解旋成单链，释放出与之配对的荧光染料。
荧光染料产生荧光信号，信号强度与扩增产物的数量成正比。
6.荧光信号检测系统：荧光信号检测系统实时检测PCR反应体系中的荧光信号，并将其转换成数值。
7.标准曲线绘制：通过使用已知浓度的标准品进行一系列稀释，绘制出标准曲线。
标准曲线将荧光信号强度与目标DNA或RNA的初始浓度之间建立了一个标准关系。
8.样品定量：通过对样品的荧光信号强度进行测量，并使用标准曲线进行插值计算，确定样品中目标DNA或RNA的初始浓度。
荧光定量PCR具有高灵敏度、高特异性、宽动态范围、低检测限和快速分析等优点，广泛应用于分子生物学和疾病诊断等领域。
概述荧光定量PCR技术的基本原理
概述荧光定量PCR技术的基本原理
荧光定量PCR技术是一种用于定量测量目标DNA序列数量的技术。
它基于普通PCR技术，但在PCR反应中引入了一种荧光探针，以实现对产物扩增过程的实时监测和定量测量。
实现荧光定量PCR的基本原理如下：
1. 选择适当的引物和荧光探针：引物用于特异性扩增目标DNA序列，而荧光探针用于标记并检测PCR产物的存在。
2. 引物和荧光探针的设计：引物的设计要确保特异性扩增目标DNA序列，而荧光探针通常由一个荧光染料和一个荧光淬灭器组成，荧光染料在引物与目标DNA序列结合时发荧光信号，而荧光淬灭器则抑制荧光信号。
3. PCR反应条件的设置：包括扩增温度、循环数等参数的设置，以确保高效的PCR扩增反应。
4. 实时监测PCR反应：在PCR反应过程中，荧光探针与目标DNA序列结合并发荧光信号，荧光信号的增加与PCR产物的扩增过程成正相关。
通过荧光信号的强度可以定量测量目标DNA序列的数量。
5. 分析数据：根据荧光信号的强度和扩增循环数，可以绘制荧光增幅曲线，并通过内部标准物质或标准曲线来计算目标DNA序列的浓度。
荧光定量PCR技术具有高灵敏度、高特异性和高准确性的优点，可以用于基因表达分析、突变检测、病原体检测等领域。
荧光定量PCR技术原理与结果分析
荧光定量PCR技术原理与结果分析一、荧光定量PCR技术原理1.基本原理荧光定量PCR技术基于传统的PCR技术，其中关键的步骤是DNA的扩增。
PCR过程中，DNA模板会通过聚合酶链式反应在多个循环中进行指数级扩增。
在扩增过程中，每一个循环都包括三个主要步骤：变性，引物结合和扩增。
2.荧光标记3.荧光信号检测与分析在PCR反应的扩增过程中，荧光强度会随着PCR产物的扩增而增加。
荧光信号的强度与扩增目标DNA的数量成正比。
因此，通过测量PCR反应中发出的荧光信号的强度，可以确定目标DNA的起始数量。
二、荧光定量PCR技术结果分析1.标准曲线2.反应效率反应效率是PCR扩增的关键因素之一、反应效率是通过标准曲线的斜率来表示的，斜率越接近1，表示反应效率越高。
较低的PCR反应效率可能是由于试剂的浓度不足、PCR条件不合适或者目标DNA的起始浓度低。
3.CT值CT值是PCR反应过程中，荧光信号由背景噪声中分离出来的阈值周期数。
在荧光定量PCR实验中，CT值用于计算目标DNA的起始浓度。
CT值越小，表示目标DNA的起始数量越多。
4.荧光指数荧光指数是指测量PCR反应中特定周期（一般为指定阈值之后的周期）的荧光信号的增加量。
荧光指数也可以用来评估PCR的效果和目标DNA的起始数量。
荧光指数越高，表示目标DNA的起始数量越多。
5.目标基因的相对表达量总结起来就是，荧光定量PCR技术通过引入荧光标记的引物和探针，在PCR反应中实时监测荧光信号的强度变化来定量分析目标DNA的起始数量。
通过制备标准曲线、测量CT值和荧光指数，可以对PCR反应的效果和目标DNA的表达量进行定量分析。
此外，荧光定量PCR还可以用于研究目标基因的相对表达量。
荧光pcr检测原理
荧光pcr检测原理
荧光PCR（Polymerase Chain Reaction）是PCR技术的一种改进，其原理是利用荧光染料标记特定的DNA序列，通过PCR过程将其扩增到足够数量后，利用特殊的仪器检测荧光信号，从而确定样本中是否存在目标DNA序列。
荧光PCR的具体操作步骤如下：
1. 设计PCR引物，其中一对引物的末端分别标记有荧光染料，如SYBR Green、FAM、HEX、ROX等。
2. 将荧光PCR反应体系中的模板DNA、引物和其他反应成分混合，进行PCR 扩增。
3. 在PCR反应过程中，如果荧光引物与样本中的目标DNA序列结合，就会发生SYBR Green绿色荧光或FAM/HEX/ROX等其他染料的荧光信号。
4. 利用特殊的实时荧光PCR仪器对PCR反应过程中的荧光信号进行实时监测和数据分析，从而确定是否存在目标DNA序列。
荧光PCR技术广泛应用于医学、生物学、环境监测等领域，可以检测病原微生物、基因突变、遗传多态性等多种生物学事件。
由于其灵敏度高、特异性强、快
速易操作等优点，成为了目前分子诊断和生物技术研究中的重要技术手段。
pcr荧光探针法原理
pcr荧光探针法原理PCR荧光探针法是一种常用的核酸分析技术，可以快速、高效地检测特定DNA序列的存在。
其原理基于PCR技术和荧光探针的特性。
首先，PCR(聚合酶链反应)是一种体外的DNA扩增技术，可以在短时间内扩增特定的DNA片段。
PCR需要一段目标DNA序列的两个引物，引物能够特异性地与目标DNA序列的两个端部相互补充，作为DNA复制的起始点。
在PCR过程中，通过一系列的温度变化来实现DNA的分离、引物的结合和扩增。
反应体系含有模板DNA、引物、四种核苷酸和聚合酶。
在适当的温度下，DNA双链解离为两条单链，形成可供扩增的单链模板。
然后，反应体系升温使引物与单链模板互补结合，形成DNA双链。
随后，反应体系再升温至合适的温度，使聚合酶在引物的引导下开始DNA的合成，形成新的DNA分子。
每个PCR循环包含多个温度变化阶段，使DNA的扩增指数级增加。
PCR荧光探针是一种特殊的寡聚核苷酸序列，分为引物、探针和信号生成物三个部分。
引物与目标DNA序列互补结合，探针结合在引物扩增产物的中间，并且包含一个荧光信号生成物。
在PCR过程中，当探针与目标DNA序列互补结合时，引物酶的活性会切割探针，释放出荧光信号。
荧光信号的强度与目标DNA序列的存在量成正比。
PCR荧光探针法可以通过检测荧光信号的强度来间接定量目标DNA序列的含量。
总结起来，PCR荧光探针法通过PCR技术的扩增作用和荧光探针的特殊设计，实现了对特定DNA序列的快速检测。
该方法具有高灵敏度、高特异性和高可靠性的特点，被广泛应用于基因表达分析、病原体检测和基因突变鉴定等领域。
荧光定量PCR法原理汇总
荧光定量PCR法原理汇总荧光定量PCR（qPCR）是一种基于聚合酶链反应（PCR）的技术，它可以定量分析DNA或RNA样本中的特定序列的数量。
与传统PCR技术相比，qPCR在PCR反应过程中使用荧光探针，可以实时监测PCR的过程，从而准确地测量样本中特定序列的起始数量。
qPCR的原理基于PCR的基本原理。
PCR是一种体外的DNA复制技术，它包括三个基本步骤：变性、退火和延伸。
在PCR过程中，DNA模板通过变性步骤被解旋为两个单链，然后通过退火步骤与引物结合。
引物是专门设计用于与目标序列的两个特定区域匹配的DNA序列。
在延伸步骤中，一个热稳定的DNA聚合酶使用含有四种不同的核苷酸（dNTPs）的反应混合物将新的DNA链合成到DNA模板的两个引物上。
在qPCR中，引入了荧光探针作为PCR反应的组成部分，以实时监测PCR过程。
荧光探针是一种特殊的DNA或RNA分子，它包含与目标序列完全互补的DNA或RNA序列，并带有荧光基团和荧光基团的一个化学修饰物。
在PCR过程中，荧光探针与目标序列的两个引物结合，并且在DNA聚合酶合成新DNA链的过程中与PCR产物结合。
qPCR反应通常包括在PCR反应混合物中加入一个可与荧光探针结合并释放荧光信号的DNA聚合酶。
当PCR在退火温度下进行时，引物与荧光探针结合，并且DNA聚合酶开始合成新的DNA链。
当DNA聚合酶遇到荧光探针时，它通过切割探针的一部分来释放荧光信号。
这个切割过程导致荧光分子由于解除荧光基团的约束而发光，从而产生一个荧光信号。
荧光信号的强度与PCR过程中目标序列数量的增加成正比。
在qPCR中，荧光信号通过一个实时检测系统进行监测和记录。
实时检测系统使用一个光学探测器读取PCR反应混合物中的荧光信号，并将其转换为可以量化的数字信号。
这个数字信号表示PCR过程中荧光信号的时间和强度变化，从而可以精确测量之前PCR反应混合物中目标序列的起始数量。
qPCR可以被广泛应用于许多领域，例如基因表达分析、病原体检测和遗传变异分析。
荧光PCR核酸检测原理
荧光PCR核酸检测原理荧光PCR核酸检测是一种基于聚合酶链式反应（PCR）技术的检测方法，它通过引入荧光探针，在PCR扩增的过程中实时检测靶标DNA 或RNA的存在与数量。
荧光PCR核酸检测原理基于PCR技术和荧光探针的特性，具有高效、准确、快速的优点，被广泛应用于基因分型、致病菌检测以及疾病诊断等领域。
一、PCR技术简介聚合酶链式反应（PCR）是一种体外扩增靶标DNA或RNA的技术，通过反复循环的DNA复制过程，将少量的模板DNA扩增到可以被检测的数量级。
PCR反应包括三个主要步骤：变性、退火和延伸，其中需要用到两个引物：前向引物和反向引物。
前向引物和反向引物会通过互补配对与靶标DNA或RNA序列结合，在适当的条件下，聚合酶将合成新的DNA链。
二、荧光探针的原理及种类荧光探针可以实时监测PCR反应过程中靶标DNA或RNA的扩增情况。
荧光探针一般包括一个引物序列和一个荧光染料。
在PCR扩增的过程中，荧光探针与靶标序列结合后，荧光染料将被释放出来并发出荧光信号。
根据荧光信号的强弱可以确定靶标序列的存在与数量。
常用的荧光探针有以下几种：1. TaqMan探针：包括一个与靶标序列互补的引物和一个含有荧光染料和荧光淬灭剂的探针。
在PCR扩增过程中，当探针与靶标序列结合时，荧光信号被释放出来，从而检测扩增情况。
2. 分子探针：包括两个与靶标序列互补的引物和一个含有荧光染料的探针。
引物结合在靶标序列的两个相邻位置上，当探针被切割释放出荧光信号时，可以确定靶标序列的存在与数量。
3. PNA探针：PNA是一种具有非天然的胺基酸结构的寡核苷酸结合物，与DNA或RNA具有高度的亲和力。
PNA探针在PCR扩增过程中结合在靶标序列上，发出荧光信号。
三、荧光PCR核酸检测的应用荧光PCR核酸检测在许多领域中得到了广泛的应用。
以下是几个典型的应用案例：1. 基因分型：荧光PCR核酸检测可以用于基因分型，识别个体间的基因差异，例如在疾病易感基因的检测中起到关键作用。
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实时荧光定量PCR技术是指在PCR反应体系中加入荧光染料或荧光基团，利用荧光信号来实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板浓度进行定量分析。
其特点有：(1)用产生荧光信号的指示剂显示扩增产物的量，进行实时动态连续的荧光监测，避免终点定量的不准确性，并且消除了标本和产物的污染，且无复杂的产物后续处理过程。
(2)荧光信号通过荧光染料嵌入双链DNA，或荧光探针特异结合木得检测物等方法获得，打打提高了检测的灵敏度、特异性和精确性。
Real-time O-PCR可以应用于mRNA表达的研究、DNA拷贝数的检测、单核苷酸多态性的测定、细胞因子的表达分析、肿瘤耐药基因表达的研究以及病毒感染的定量监测。
实时荧光定量PCR技术的基本原理在PCR反应体系中加入荧光染料或荧光基团，这些荧光物质有其特定的波长。
仪器可以自动检出，利用荧光信号积累，实时监测整个PCR进程，在PCR循环中，测量的信号将作为荧光阈值的坐标。
并且引入一个——Ct值（Threshold cycle）概念，Ct值是指产生可被检测到得荧光信号所需的最小循环数，是在PCR 循环过程中荧光信号由本底开始进入指数增长阶段的拐点所对应的循环次数。
荧光阈值相当于基线荧光信号的平均信号标准偏差的10倍。
一般认为在荧光阈值以上所测出的荧光信号是一个可信的信号，可以用于定义一个样本的Ct值。
通常用不同浓度的标准样品的Ct值来产生标准曲线，然后计算相对方程式。
方程式的斜度可以用来检查PCR的效率，所有标准曲线的线性回归分析需要存在一个高相关系数（R²＞0.99），这样才能认为实验的过程和数据是可信的，使用这个方程式计算出未知样本的初始模板量。
实时荧光定量PCR仪都有软件，可以从标准曲线中自动地计算出未知样本的初始模板量。
实时荧光定量PCR技术的应用1. 基因工程研究领域①基因表达研究：对β地中海贫血症患者β与γ珠蛋白mRNA水平进行检测，其结果特异性强、定量准确，为了解β地中海贫血的分子病理机制及其临床诊断提供了可靠的检测数据。
②转基因研究：利用两种发光探针及适当的循环阈值，扩增一个转移后的基因和一个对照基因，以分析转基因老鼠接合性。
该方法为45个转基因动物的同型结合及异质结合提供了明确的鉴定结果。
通过实时定量PCR检测，同型结合的异质接合动物交配后其子代中转基因的传递情况符合孟德尔遗传规律。
这项技术在转基因动物繁育及基因剂量功能效应实验中将有很大的用途。
③单核苷酸多态性（SNP）及突变分析：实时荧光定量PCR一个诱人的应用前景是用于检测基于两条探针和基因组的不稳定性。
基因突变基于两条探针，一条探针横跨突变点，另一条为锚定探针，与无突变位点的靶序列杂交。
两条探针用两种不同的发光基团标记。
如靶序列中无突变，探针杂交便完全配对，如有突变，则探针与靶序列不完全配对，会降低杂交体得稳定性，从而降低其熔解温度（Tm）。
这样便可对突变和多态性进行分析。
2. 医学研究领域①病原体检测：由于实时荧光定量PCR方法可靠性和重复性好，并且操作简便、快速、结果判断客观，目前，人们用此方法对人类免疫缺陷病毒、肝炎病毒、结核杆菌、巨细胞病毒、EB病毒、流感病毒A、流感病毒B等病原体的检测。
荧光定量PCR问世后的几年中，积累了大量有关病原体核酸量与感染性疾病发生、发展和预后之间关系的资料，这些研究资料不断丰富，将形成感染性疾病的临床分子诊断标准。
②药物疗效考核：利用实时荧光定量PCR技术检测临床样品中与抗药性相关的基因的表达。
结果证明，实时荧光定量PCR系统是定量检测抗药基因表达的可靠方法，应用这种技术可以预测化疗将引起的反应。
③肿瘤基因检测：肿瘤的本质是细胞内基因发生了变化，是一种多基因异常的疾病，这些异常变化用实时荧光定量PCR方法都可以检测出来。
目前用此方法进行过端粒酶hTERT基因、慢性粒细胞性白血病bcr/abl融合基因、肿瘤MDRI 基因、白血病WTI基因、肿瘤ER基因、前列腺癌PSM基因、肿瘤相关的病毒基因等多种基因的表达检测。
随着与肿瘤相关的新基因的不断发现。
荧光定量PCR 技术将会在肿瘤的研究中发挥更大的作用。
3. 其他领域用实时荧光定量PCR方法对免疫组分进行分析是其应用的重要方面。
所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
检测方法1.SYBRGreenⅠ法：在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA 双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。
SYBR定量PCR扩增荧光曲线图PCR产物熔解曲线图（单一峰图表明PCR扩增产物的单一性）2.TaqMan探针法：探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物的形成完全同步。
服务流程1.客户认真写好订单，提供待检基因相关信息；2.签订技术服务合同，支付预付款（30-50%)；3.设计合成定量PCR引物（或客户提供文献引物委托本公司合成）；4.DNA/RNA的抽提、定量、RNA反转录；5.PCR预实验，主要检测引物的特异性和扩增效率；6.正式定量实验：对所有样品上机检测；7.实验结果和数据分析，形成报告。
收费标准优惠包干价：120元/样/基因（SYBRgreenI法，相对定量）（含RNA提取，反转录，引物合成费用，上机测试费用（3个重复）；一个内参免费（内参3个重复）Ct值（Cycle threshold，循环阈值）的含义为：每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数（如图1所示）。
1. 荧光阈值（threshold）的设定PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光阈值的缺省（默认）设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：threshold = 10*SDcycle 3-152. Ct值与起始模板的关系每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，公式如下。
Ct=-1/lg(1+Ex)*lgX0+lgN/lg(1+Ex)n为扩增反应的循环次数，X0为初始模板量，Ex为扩增效率，N为荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量。
起始拷贝数越多，Ct值越小。
利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值。
因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。
实时荧光定量PCR所使用的荧光物质可分为两种：荧光探针和荧光染料。
现将其原理简述如下：1. TaqMan荧光探针：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。
探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq 酶的5'－3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。
而新型TaqMan-MGB 探针使该技术既可进行基因定量分析，又可分析基因突变（SNP），有望成为基因诊断和个体化用药分析的首选技术平台。
2. SYBR荧光染料：在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料非特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。
SYBR仅与双链DNA进行结合，因此可以通过溶解曲线，确定PCR反应是否特异。
3. 分子信标：是一种在5和3末端自身形成一个8个碱基左右的发夹结构的茎环双标记寡核苷酸探针，两端的核酸序列互补配对，导致荧光基团与淬灭基团紧紧靠近，不会产生荧光。
PCR产物生成后，退火过程中，分子信标中间部分与特定DNA序列配对，荧光基因与淬灭基因分离产生荧光。
1．传统定量PCR方法简介1）内参照法：在不同的PCR反应管中加入已定量的内标和引物，内标用基因工程方法合成。
上游引物用荧光标记，下游引物不标记。
在模板扩增的同时，内标也被扩增。
在PCR产物中，由于内标与靶模板的长度不同，二者的扩增产物可用电泳或高效液相分离开来，分别测定其荧光强度，以内标为对照定量待检测模板。
2）竞争法：选择由突变克隆产生的含有一个新内切位点的外源竞争性模板。
在同一反应管中，待测样品与竞争模板用同一对引物同时扩增（其中一个引物为荧光标记）。
扩增后用内切酶消化PCR产物，竞争性模板的产物被酶解为两个片段，而待测模板不被酶切，可通过电泳或高效液相将两种产物分开，分别测定荧光强度，根据已知模板推测未知模板的起始拷贝数。
3）PCR－ELISA法：利用地高辛或生物素等标记引物，扩增产物被固相板上特异的探针所结合，再加入抗地高辛或生物素酶标抗体－辣根过氧化物酶结合物，最终酶使底物显色。
常规的PCR－ELISA法只是定性实验，若加入内标，作出标准曲线，也可实现定量检测目的。
2．内标在传统定量中的作用由于传统定量方法都是终点检测，即PCR到达平台期后进行检测，而PCR经过对数期扩增到达平台期时，检测重现性极差。
同一个模板在96孔PCR仪上做96次重复实验，所得结果有很大差异，因此无法直接从终点产物量推算出起始模板量。
加入内标后，可部分消除终产物定量所造成的不准确性。
但即使如此，传统的定量方法也都只能算作半定量、粗略定量的方法。
3．内标对定量PCR的影响若在待测样品中加入已知起始拷贝数的内标，则PCR反应变为双重PCR，双重PCR反应中存在两种模板之间的干扰和竞争，尤其当两种模板的起始拷贝数相差比较大时，这种竞争会表现得更为显著。
但由于待测样品的起始拷贝数是未知的，所以无法加入合适数量的已知模板作为内标。
也正是这个原因，传统定量方法虽然加入内标，但仍然只是一种半定量的方法。
实时荧光定量PCR技术有效地解决了传统定量只能终点检测的局限，实现了每一轮循环均检测一次荧光信号的强度，并记录在电脑软件之中，通过对每个样品Ct值的计算，根据标准曲线获得定量结果。
因此，实时荧光定量PCR无需内标是建立在两个基础之上的：1）Ct值的重现性PCR循环在到达Ct值所在的循环数时，刚刚进入真正的指数扩增期（对数期），此时微小误差尚未放大，因此Ct值的重现性极好，即同一模板不同时间扩增或同一时间不同管内扩增，得到的Ct值是恒定的。