09-蛋白质组研究中的翻译后修饰
蛋白质药物的翻译后修饰
百泰派克生物科技
蛋白质药物的翻译后修饰
随着生物医药技术的发展，越来越多的蛋白质类药物被开发出来用于各种疾病的治疗，常见的蛋白质类药物如蛋白质、多肽、单克隆抗体、疫苗和抗体偶联药物等。
这些蛋白质类药物有时需要进行一些修饰才能发挥预想的生物学功能，达到治疗效果。
常见的蛋白质药物翻译后修饰包括糖基化、二硫键、乙酰化和磷酸化等，不同的修饰类型、氨基酸修饰位点以及修饰的含量都会严重影响药物终产品的安全性和疗效性。
研究表明，糖基化程度的高低与促红细胞生成素（一种蛋白类药物）的活性和半衰期密切相关，单克隆抗体的糖链类型影响其与受体的亲和力。
因此，对蛋白质药物的翻译后修饰的分析与鉴定是必不可少的。
目前主要依靠液相色谱-串联质谱技术对蛋白质药物进行翻译后修饰鉴定，其原理和分析流程与常规的蛋白质翻译后修饰鉴定类似。
百泰派克生物科技采用Thermo Fisher的Q ExactiveHF质谱平台结合Nano-LC色谱，提供快速高效的蛋白质药物翻译后修饰鉴定服务技术包裹，您只需要将您的实验目的告诉我们并将您的样品寄给我们，我们会负责项目后续所有事宜，包括蛋白提取、蛋白酶切、修饰肽段富集、肽段分离、质谱分析、质谱原始数据分析、生物信息学分析，欢迎免费咨询。
蛋白质翻译后修饰简介
蛋 白质 翻 译 后 修 饰 简 介
陈 霞 罗 良煌 （ 江 西 省 泰 和 中 学 ３ ４ ３ ７ ０ ０ ）
摘 要 蛋 白质 翻译后修饰使蛋 白质类 型增 多， 结构更复杂 、 调控 更精确 、 作用更 专一 、 功 能更完善 。本 文对蛋 白质泛素化 、 磷 酸 泛 素化 磷酸化 乙酰化 脂基化 甲基化 糖基化 化、 乙酰化 、 糖基化 、 甲基化 和脂基化 等 ６ 种常见 的蛋 白质翻译后修饰类型及其生物学功能进行概述。 关键 词 蛋 白质 翻译后修饰
１ 蛋白质翻译后修饰的概念
痴呆 、 帕金森症等与蛋 白质泛素化异常有关 ， 当病变神 经细胞 中泛 素 一蛋 白酶 体经 典 途径 出 现 障碍 或 过载 时， 蛋 白质不能及时被降解 ， 导致细胞 内异 常蛋 白质 聚
集， 从 而形成 包涵体引起各类神经变性疾病 ； 泛 素与相 关基因融合表达可增强细胞免疫反应 。
与底物结合 ： 在Ｅ ３的催化作 用下 ， 泛素 ｃ末端 与底物 上 的赖氨酸 ｓ一 氨基结合 ； ④ 降解 ： 泛素 蛋 白最 后被转 运到蛋 白酶体 中完全降解 。 蛋 白质泛 素化对 于细胞 分 化 、 调控、 生 物合 成 、 凋 亡、 免疫应答 和应激 反应 等生理 过程 都起着 很重 要 的 作用 。研究表 明 ， 泛素 一 蛋 白酶体抑 制剂 ＭＧ一１ ３ ２能 够显著抑制 消化道 肿瘤 细胞 的增殖 并诱 导其 凋亡 ， 从
２ ． ３ 乙酰化 蛋 白质 乙酰化是 指蛋 白质 在 乙酰基转
质连接 酶（ Ｅ ３ ） 。泛素化 的过程 大致如 下 ： ①形 素 ｃ末端 的甘氨酸 在
消耗 Ａ Ｔ Ｐ的作用 下 形成 硫脂 键 ； ② 泛素 转 移 ： 连 接在 Ｅ １ 上的泛素被转 移到 Ｅ ２的半 胱 氨酸 的 活性位 点 ； ③
蛋白质翻译后修饰研究进展
蛋白质翻译后修饰研究进展郭会灿( 石家庄职业技术学院化学工程系，石家庄050081)[摘要]: 翻译后修饰在蛋白质加工、成熟的过程中发挥着重要的作用，它可以改变蛋白质的物理、化学性质，影响蛋白质的空间构象、立体位阻及其稳定性，进而对蛋白质的生物学活性产生作用，引起蛋白质的功能改变。
修饰基团自身的结构特性对蛋白质的性质、功能也会产生深远的影响。
在已有的研究基础上，综述蛋白质翻译后修饰的主要类型以及各修饰作用潜在的生物学功能。
[关键词]: 蛋白质翻译后修饰糖基化乙酰化泛素化磷酸化生命有机体是一个复杂、动态的系统，时刻进行着不断的新陈代谢，产生新物质、清除废物质及有害物质、协调各个部位间的功能发挥。
偶尔该系统也会发生紊乱，引发各种异常功能，出现疾病的症状。
而这所有的一切都依赖于生物大分子蛋白质。
蛋白质是机体内各种功能的执行者，如机体免疫、细胞凋亡、信号转导、刺激反应及个体发育等。
蛋白质功能的正常发挥决定着有机体能否有序、高效的进行。
体内基因表达产物的正确折叠、空间构象的正确形成决定了蛋白质的正常功能，而翻译后修饰在这个成熟过程中发挥着重要的调节作用。
因为翻译后修饰使蛋白质的结构更为复杂，功能更为完善，调节更为精细，作用更为专一。
并且细胞内许多蛋白质的功能也是通过动态的蛋白质翻译后修饰来调控的; 细胞的许多生理功能，例如细胞对外界环境的应答［1，2］，也是通过动态的蛋白质翻译后修饰来实现的。
正是这种蛋白质翻译后修饰的作用，使得一个基因并不只对应一个蛋白质，从而赋予生命过程更多的复杂性。
因此，阐明蛋白质翻译后修饰的类型、机制及其功能对保障生命有机体的正常运转，预防、治疗相关的疾病有着重要意义。
1 蛋白质翻译后修饰类型蛋白质翻译后修饰是一个复杂的过程，目前在真核生物中20 种以上的修饰类型，比较常见的为糖基化、乙酰化、泛素化、磷酸化以及近年发现的SUMO化。
1.1 糖基化在真核细胞中普遍存在低聚糖通过糖苷键与蛋白质上特定的氨基酸共价结合的形式，主要包括O糖基化、N 糖基化、C 甘露糖化和GPI ( glycophosphatidlyinositol)锚定连接［3］。
蛋白组学翻译后修饰
可编辑ppt
12
抗体免疫印迹法
优点
灵敏 直观
克服同位素法的局限
无同位素污染，操作相对方便 可检测无磷酸化转换的蛋白 能区分不同残基的磷酸化
可编辑ppt
13
磷酸化肽段的分离和富集
使用磷酸化蛋白的抗体 IMAC法 磷酸基团亲和取代
可编辑ppt
14
磷酸化蛋白的抗体
蛋白质组学
浙江大学 生命科学学院
江辉
可编辑ppt
1
第五章 蛋白质 翻译后修饰的鉴定
可编辑ppt
2
蛋白质的翻译后修饰
很多前体蛋白是没有活性的，常常要进行一个系列 的翻译后加工，才能成为具有功能的成熟蛋白。
加工的类型是多种多样的，一般分为四种：
N-端fMet或Met的切除：原核生物的肽链，其N-端不保 留fMet，大约半数蛋白由脱甲酰酶（deformylase）除去 甲酰基，留下Met作为第一个氨基酸；在原核及真核细 胞中fMet或者Met一般都要被除去
二硫键的形成
化学修饰
剪切：很多的前体蛋白要经过剪切后方可成为成熟的蛋 白 ，如胰岛素
可编辑ppt
3
蛋白质的翻译后化学修饰
蛋白质翻译后修饰在生命体中具有十分重要的作 用，它使蛋白质的结构更为复杂, 功能更为完善， 调节更为精细, 作用更为专一。
化学修饰的类型也很多，包括磷酸化（如核糖体 蛋白的Ser，Tyr和Trp残基常被磷酸化）；糖基化 （如各种糖蛋白）；泛素化（要进入蛋白酶体降 解的蛋白）；甲基化（如组蛋白，肌蛋白），乙 酰化（如组蛋白），羟基化（如胶原蛋白）等。
可编辑ppt
4
翻译后化学修饰的生物学效应
泛素化对于细胞分化与凋亡、DNA 修复、免疫应 答和应激反应等生理过程起着重要作用;
蛋白翻译后修饰
凋亡,从而最终发展成为癌细胞 .
2.5 磷酸化
DNA新陈代谢的研究中：细胞中DNA损伤可导致人的复制蛋 白 A(RPA)32 kD 亚基 N 端的过度磷酸化, 这有助于调控 DNA 的新陈代谢, 促进DNA 修复. 有数据显示, 过度磷酸化会 导致 RPA 构象改变 , 降低 DNA 复制的活性 , 但不会影响
泛素-蛋白酶系统是存在于所有真核生物细胞的调控
系统。降解过程中需要三种酶的参与: 泛素激活酶(E1)、
泛素结合酶(E2)和泛素蛋白质连接酶(E3)。泛素化降解
蛋白的过程中对蛋白的特异性识别依赖 E3. 由 E2s 和 E3s 介导的泛素化过程可以被去泛素化酶(DUBs)逆转.。
2.4 泛素化
目前发现的 DUBs 可分为两大类 : 泛素碳端水解酶 (ubiquitin C-terminal hydrolases,UCHs)和泛素特异性
DNA 的修复。
2.6 SUMO 化
SUMO为小泛素相关修饰物 (small ubiquitin- related modifier，SUMO)分子，是一种近年发现的泛素样分子，也参与 蛋白质翻译后修饰，但是不介导靶蛋白的蛋白酶体降解， 而 是可逆性修饰靶蛋白，参与靶蛋白的定位及功能调节过程。
3 研究方法及关键技术
蛋白酶 (ubiquitin-spicific processing proteases,
UBPs) ，两者都是半胱氨酸水解酶。泛素化降解蛋白 的过程中对蛋白的特异性识别依赖E3. 由E2s 和E3s 介导的泛素化过程可以被去泛素化酶 (DUBs)逆转通常 情况下, UCHs 主要水解羰基端的酯和泛素的氨基键,
2.3 糖基化
发生在高尔基体上：起始于丝氨酸和苏氨酸羟基 上连接N-乙酰半乳糖胺、N-乙酰葡萄糖胺、甘露糖及
蛋白翻译后修饰综述
蛋白翻译后修饰综述蛋白质翻译后修饰 (Protein translational modifications,PTMs) 通过功能基团或蛋白质的共价添加、调节亚基的蛋白水解切割或整个蛋白质的降解来增加蛋白质组的功能多样性。
三羧酸循环是葡萄糖在线粒体代谢的一个重要环节。
葡萄糖产生的乙酰辅酶A进入三羧酸循环，产生大量还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide，NADH）和还原型黄素腺嘌呤二核苷酸（reduced flavin adenine dinucleotide，FADH2），为呼吸链提供电子，推动氧化磷酸化反应合成三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）。
三羧酸循环有8个关键催化酶，它们的催化活性均受翻译后修饰的调节。
（一）乙酰化及琥珀酰化在调节三羧酸循环中，乙酰化的作用以抑制为主，而琥珀酰化以激活为主。
琥珀酸脱氢酶（succinate dehydrogenase，SDH）是三羧酸循环关键酶之一，位于线粒体内膜。
由A和B两个亚基组成。
SDH催化琥珀酸转为富马酸，并且产生FADH2。
A亚基（SDHA）活性既受乙酰化调节也受琥珀酰化调节，而两种修饰作用相反：乙酰化抑制该亚基活性，去乙酰化后该亚基活性提高[13]。
动物模型研究发现，胚胎期母亲低蛋白饮食可增加出生后肥胖及T2DM发生率，机制是SIRT3表达减少，增加SDH 乙酰化状态，降低SDH活性[14]。
柠檬酸合酶和异柠檬酸脱氢酶2（isocitrate dehydrogenase 2，IDH2）的催化活性也受乙酰化抑制[15,16]。
但是，乙酰化修饰也可增加三羧酸循环中某些酶的活性，如苹果酸脱氢酶（malate dehydrogenase，MDH）和顺乌头酸酶[16,17]。
与乙酰化修饰的作用相反，琥珀酰化增加SDH活性[13]，但抑制IDH2的活性[18]。
翻译后修饰蛋白质组与代谢组整合分析
翻译后修饰蛋白质组与代谢组整合分析蛋白质的翻译后修饰（Post Translational Modifications, PTMs）是蛋白质在翻译中或翻译后经历的一个共价加工过程。
翻译后修饰蛋白质组是指细胞或组织等整体水平上的翻译后修饰蛋白质。
目前，已知的蛋白质翻译后修饰主要包括糖基化、磷酸化、酰化、泛素化、二硫键配对、甲基化和亚硝基化等等。
代谢组是细胞、组织或生物体内的小分子（通常称为代谢物）的整体水平。
翻译后修饰蛋白质可以调节细胞生物过程、影响机体的代谢变化。
影响代谢的翻译后修饰蛋白质不仅包括翻译后修饰转录因子，还包括翻译后修饰代谢酶。
因此，整合分析翻译后修饰蛋白质组和代谢组，比较它们的表达异同，有利于从不同层面解析生物的代谢机制，挖掘差异修饰蛋白质、代谢物、及它们参与的重要通路和相关基因，以进行后续深入研究。
百泰派克生物科技采用Thermo Fisher的Orbitrap Fusion Lumos质谱平台结合nanoLC-MS/MS纳升色谱，将磷酸化/糖基化/泛素化/乙酰化/甲基化/二硫键/亚硝基化等翻译后修饰鉴定服务，多种样品靶向和非靶向代谢组学分析服务，结合可定制化的生物信息学分析方法进行整合，为广大科研工作者提供基于质谱的翻译后修饰蛋白质组与代谢组整合分析服务。
翻译后修饰蛋白质组与代谢组整合分析流程翻译后修饰蛋白质组与代谢组整合分析流程。
应用领域农林领域：抗逆胁迫机制，物种保护研究等；畜牧业：致病机理研究，肉类及乳制品品质研究等；海洋水产：渔业环境与水产品安全等；微生物：致病机理，耐药机制，病原体-宿主相互作用研究等；生物医药：生物标志物，疾病机理机制，疾病分型，药物开发，个性化治疗等；环境科学：发酵过程优化，生物燃料生产，环境危害风险评估研究等；食品科学：食品储藏及加工条件优化，食品组分及品质鉴定，食品安全监检测等。
中/英文项目报告在技术报告中，百泰派克会为您提供详细的中/英文双语版技术报告，报告包括：1. 实验步骤（中英文）。
蛋白质翻译后修饰——末端修饰(氨基末端、羧基末端)——加密版
蛋白质翻译后修饰——末端修饰（氨基末端、羧基末端）（~~by luckyboy）（微生物班、精简打印、元旦巨献版）在核糖体上翻译的时候，当氨基酸添加到新生多肽之后，在体内氨基酸残基会发生各种各样的共价修饰。
I、氨基端的修饰初生蛋白的第一个氨基酸的命运：在细菌中：在细菌中生物合成蛋白质的第一步一般是甲酰甲硫氨酰-tRNAfmet和第二个氨酰tRNA通过肽键合成，因此初生蛋白质存在一个甲酰甲硫氨酰位点。
在真核生物中：虽然N末端甲硫氨酰位点从第一个甲硫氨酸获取在成熟蛋白质中很常见，N末端的α-甲基一般很快会被移除，接着在大多数情况下甲硫氨酸残基会被断裂下来。
这个作用是依靠甲硫氨酸氨基肽酶的作用，并且这个裂解过程由第二个残基控制。
（1）在酵母中（啤酒酵母）：如果倒数第二个氨基酸残基有一个0.129nm或更小的回转半径的时候，甲硫氨酸会被完完全全的裂解掉（这些氨基酸有：Gly, Ala, Ser, Cys, Thr, Pro, Val）（3）在真菌或哺乳动物的线粒体中：起始甲硫氨酸的不被去除，但在植物的线粒体中还是会发生的。
在工程菌中：在大肠杆菌中过量表达的蛋白质通过质粒技术会导致一种甲硫氨酸残基保留的不正常现象。
一、乙酰化1．N端a-乙酰基修饰（a-acetyl）在蛋白质中是很普遍的在Ehrlich ascite 细胞中：大概有80%的可溶蛋白是N端a-乙酰基修饰的。
在高等真核生物中：有证据表明在这些细胞中氨基酸末端乙酰化是非常普遍的，几乎可以作为高等真核生物蛋白质的一个典型标志。
在低等真核生物中：N端a-乙酰基的比例比较低，但还是存在的2. N端a-乙酰基化修饰通常是翻译中同时发生的，一般发生在新生肽链大约40个残基长的时候3.N端残基乙酰化修饰的频率（概率）是不同的：一般Ala,Ser > Met,Gly, Asp > Asn,lle,Thr,Val > 其他氨基酸残基（1）在高等真核生物中的蛋白质比细菌或真菌中的蛋白质更可能发生乙酰基修饰（2）在大肠杆菌中表达的真核细胞蛋白部分发生乙酰化。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
酶
细胞
复合糖
脂类
生物体
生物信息流
甘露糖 N-乙酰葡萄糖胺
五糖核心结构式： Manα1-3(Manα1-6)Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc
N
Asn–X–Ser/Thr
C
五糖核心分子式： GlcNAc2Man3
N-连接糖链的五糖核心结构
糖基化位点分析
糖基化蛋白质分析
糖链分析
糖蛋白 单糖分析 蛋白酶水解 去糖基蛋白 氨基酸分析 糖基肽 糖链释放 去糖基肽链 糖链 肽链 氨基酸序列分析 糖链 糖链释放
用IMAC, oligo R3 或 PGC富集
前离子扫描 正电 模式 负电 模式
中性丢失扫描
Biotin标记的磷酸 化残基化学修饰
Avidin柱的 亲和纯化
磷酸酶处理
识别磷酸化肽段
转成正 电模式
MALDI-TOF, MS/MS 分析肽段序列 MS/MS
MS/MS
磷酸化蛋白质组研究策略
DNA
RNA
蛋白质 糖类
分馏纯化，结构分析 • 酶解 • 糖基肽/寡多糖图谱 • 质谱 • 核磁共振
糖蛋白的分析流程
细胞组织
2D-PAGE
切割感兴趣的蛋白质点 纯化
寡糖链 HPLC分析荧 光标记的糖基 糖链鉴定 MS
用糖苷酶酶解 蛋白质 数据库搜索
胰酶胶内酶解 和抽提肽段
靶蛋白的鉴定及功能分析
靶蛋白的鉴定及功能分析
第九章 蛋白质组研究中的翻译后修饰
磷酸化氨基酸残基上的磷酸基团脱落时发生的结构与质量变化
细胞中所有的蛋白质
亲和层析富集 磷酸化蛋白质 ? 使用磷酸化特异性 抗体免役共沉淀
磷酸化蛋白质混合物 一维或二维凝胶电泳
胶内酶解
磷酸化和非磷酸化肽段混合物
2D磷酸化 肽段图谱
从TLC上洗脱 磷酸化肽段 MALDI-TOF, MS/MS或Edman