实验十二 去壁低渗法制备植物染色体标本
12染色体标本的制备
实验十二染色体标本的制备一、实验目的1.了解利用动物骨髓进行细胞染色体制片的一般方法，2.掌握细胞收集、低渗、滴片等技术手段。
3.观察和了解小鼠染色体的数目及形态特征。
二、实验原理染色体上的基因决定了一个物种生长发育的全部信息。
因此通过染色体分析，可以了解某一物种最基本的遗传指标。
进行染色体标本的制备一般取自细胞分裂旺盛的组织，如骨髓、淋巴细胞以及通过人工培养的悬浮液。
将秋水仙素注射到动物的腹腔内，经肠系膜吸收可转运到骨髓，使正在分裂的细胞不能形成纺锤体，染色体停在中期状态，经过处理和制片后就可以清楚地观察到染色体。
这种制片方法是属于侵害性的，因此这种方法适用于动物来源丰富、动物个体较小的材料。
对于大型动物可以采取骨髓穿刺术获得红骨髓，在临床上用于一些血液疾病的研究分析。
对于一些珍稀的鸟类可采用羽髓来制片，方法基本一样。
人类的染色体分析可采用外周血培养的方法来获得大量的细胞材料。
骨髓细胞具有丰富的细胞质和高度分裂能力，因此不必经体外培养，也不需要植物血球凝集素（PHA）的刺激，可直接观察到分裂细胞。
经秋水仙素处理后，分裂的骨髓细胞被阻断在有丝分裂中期，再经离心、低渗、固定、滴片等步骤，便可制作出理想的染色体标本，是研究动物细胞遗传学的好材料。
骨髓细胞染色体标本的制备，具有取材容易，方法简单易行等优点，设备也简单，在一般的实验室均可进行。
三、实验仪器、材料和试剂：1.仪器、用具天平，离心机，光学显微镜，恒温水浴锅，试管架，烧杯，离心管，刀片，镊子，解剖盘，解剖剪，镊子，注射器，纱布，冰冻载玻片，吸水纸，吸管，镜头纸。
2.材料体重20克左右的小鼠。
3.试剂(1)0.075mol/L KCl低渗液(2)Carnoy固定液（甲醇：醋酸＝3:1）(3)0.1%秋水仙素(4)Giemsa染色液【方法与步骤】1. 秋水仙素处理：在做实验前3~4小时，按每克体重2-4μg的量，向小鼠腹腔注射0.1％的秋水仙素。
去壁低渗法制备植物染色体标本实验
去壁低渗法制备植物染色体标本实验方法步骤：1、材料培养：将高粱的种子充分浸种后，摆在铺有滤纸的培养皿内，在25℃温箱发芽培养2、预处理：待根长至0.5-1cm时,切取根尖立即放入盛有0.2%秋水仙素和0.002mol/L 8-羟基喹啉水溶液等量混合液的小瓶中预处理2-3小时3、前低渗：切取分裂旺盛的部分根尖（1mm），放入0.075mol/L氯化钾低渗液中，在25℃条件下处理30分钟。
以下可分两种方法进行处理4、（1）吸去前低渗液，立即加入甲醇：冰醋酸（3：1）固定液固定不少于1h。
（2）水洗：将固定好的材料用蒸馏水洗三次，除去材料中的固定液，在1mol/L 的HCl于60℃处理15分钟。
（3）酶解去壁：在小瓶内加入混合酶液（酶液量以浸过材料为合适），在25℃下酶解30-60分钟（4）后低渗：吸去酶液，慢慢加入(25±0.5) ℃的双蒸水,轻轻洗一次,然后在双蒸水中浸泡10分钟。
5、悬液法：（1）制备细胞悬液：倒去双蒸水，用镊子立即将材料夹碎形成细胞悬液（2）固定：向细胞中加入新配制的甲醇：冰醋酸（3：1）固定液1-2ml，使成细胞悬液时间在10分钟到数小时不等。
（3）去沉淀：静置片刻使大块组织沉淀，然后取上层细胞悬液于另一个小瓶中。
（4）去上清夜：将上层细胞悬液静置30分钟左右，即可见细胞沉淀，用吸管轻轻吸去上清夜，留约0.5ml左右细胞悬液置备标本(5)标本制备:在一张经过充分洗净脱脂,并预先在蒸馏水中冷冻的清洁载玻片上,用吸管滴2-3滴细胞悬液,立即将载玻片一端抬起,并轻轻吹气，使细胞迅速分散，然后在酒精灯火焰上微微加热烤干。
（6）染色：经干燥的玻片标本，用Giemsa染色液染色30分钟，然后用自来水细流冲洗，甩干水珠空气干燥6、在显微镜下寻找典型的中期染色体，注意观察中期染色体的长臂、短臂和着丝粒位置，并尽可能找到具随体染色体。
植物染色体标本制备的去壁、低渗法及其在细胞遗传学中的意义
植物染色体标本制备的去壁、低渗法及其在细胞遗传学中的意
义
植物染色体标本制备的去壁、低渗法是通过去除细胞壁，使得细胞内的染色体能够在液态介质（通常是醋酸或者醋酸-乙醇混合液）中自由展开，并与染色剂染色，从而得到适合观察和分析的染色体标本。
这种制备方法在植物细胞遗传学中得到广泛应用。
首先，通过去除细胞壁，可使得染色体得以展开成线性或环形的形式，方便进行观察和分析。
其次，在去壁液中低渗透压下染色质水肿膨胀，使染色体的结构更加明晰，染色效果更佳。
同时，去壁液中还含有某些成分，如乙酸和染色剂，可促进染色体的凝聚和染色，从而也有助于染色体的分析和研究。
植物染色体标本制备的去壁、低渗法在植物细胞遗传学中有着重要的应用价值，可用于染色体数目和形态的分析、基因定位和标记、染色体变异的检测和研究等。
特别是在遗传改良中，该方法也被广泛应用于植物杂交和基因转移等研究领域。
植物染色体标本的制备与观察 实验报告
实验七植物染色体标本的制备与观察一、实验目的
学习植物染色体标本的制备技术，掌握染色体的技术方法，了解染色体的生物学意义。
二、实验用品
Carnoy固定液、0.1%秋水仙素溶液、1mol/HCL、Schiff溶液、亚硫酸水溶液（漂洗液）、混合酶液（纤维素酶、果胶酶各1%-2%）、Carbor fuchsin(卡宝品红)染液配方1、配方2
三、实验方法
1.取材：将大蒜培养，待胚根长达1-2cm时。
窃取0.5cm
长的根尖部分。
2.预处理：将切下的根尖浸入0.1%秋水仙素液中，室温下
处理3-4h
3.固定：取出根尖，投入Carnoy 液固定2-24h,换入70%
酒精，暂时保存
4.水解：把根尖投入预热的58-60℃1mol/HCL中，恒温下
水解14-15min.
5.染色：用配方2染5-10min
6.用蒸馏水西区多余染液
7.酶解:酶解20min左右
8.洗涤：用蒸馏水洗涤，除去残留酶液后加45%醋酸。
9.压片：将根尖置于载玻片上，滴半滴45%醋酸，盖上盖
玻片，压片
10.镜检
四、实验结果及分析
这是用大蒜根尖所制的玻片观察到的，只能看到被染色的核，但未能清晰观察搭配中期分裂相中染色体的排列。
分析实验失败原因如下：
1.处理时间不对，处理时细胞未处于分裂
中期
2.所用试剂配的有问题，导致最终只能看
到核被染色，但看不到中期染色体的清晰排布。
植物常规染色体制片-固定和低渗处理
实验二植物常规染色体制片Ⅱ固定和低渗处--固定和低渗处理（综合性实验）遵义师范学院生命科学学院韦若勋一、实验目的1、掌握植物根尖染色体制片过程中固1掌握植物根尖染色体制片过程中固涂片；定和涂片的方法；2、掌握植物根尖染色体制片过程中低渗处理根尖细胞的方法；3、熟悉固定液、低渗溶液和酶液的配制。
二、实验原理、三、实验器具及试剂（一）实验器具指管、量筒、棕色瓶、烧杯、天平等。
指管量筒棕色瓶烧杯天平等三、实验器具及试剂(二)实验试剂1、0.075mol/L 氯化钾称取KCI 5.6g，少许鲜蒸馏水溶解，定溶1000 ml。
225%2、2.5% 纤维素酶和果胶酶酶解混合液纤维素酶、果胶酶各1g,鲜蒸馏水分别溶解,定溶20ml,再等量混合即可。
3、固定液甲醇：冰乙酸=3：1，现配现用。
4、45%醋酸溶液44%醋酸溶液四、实验材料、1、已预处理好的蚕豆、绿豆、洋葱和大蒜已预处理好的蚕豆绿豆洋葱和大蒜等植物的根尖。
五、实验方法与步骤五、实验方法与步骤2、酶解去壁（1）方法①第二次取材,放入管内；②加2.5%混合酶浸没全部材料；③25℃下处理2－3h；④触即破为度。
以一触即破为度。
（2）注意事项处理过程中防止酶液干燥，并摇动酶液，使其充分作用。
五、实验方法与步骤5、后低渗（1）方法①酶液回收：用平口吸管,排气后直插孔底,缓慢吸酶；②鲜蒸馏水清洗3次；③蒸馏水浸没全部材料，处理20min（2）注意事项酶解时冲酶解过度时不宜冲洗。
（3）作用①细胞吸水膨胀使染色体分散膜外；②降低胞质浓度，清洁染色体标本。
五实验方法与步骤4、固定（1）方法①吸干蒸馏水(平、直、慢)；②用固定液冲洗3次(平、直、慢)；③浸没全部材料，处理30min以上。
（2）注意事项①酶解过度时不冲洗；②固定液鲜配鲜用。
固定液鲜配鲜用（3）作用①杀死细胞，保留分裂相；②使细胞质蛋白变性和沉淀,清晰染色体图像；③促进染色体着色。
五、实验方法与步骤5、制片或涂片（1）方法①取冰冻玻片1张，放滤纸上；②取根尖材料放于玻片中央，滴1-2滴固定液；③用镊子迅速将材料压碎涂布，并去除大块组织残渣；④再加固定液，轻吹使染色体扩散，在酒精灯上干燥。
植物染色体的标本制备
植物染色体的标本制备目前，国内外常用的植物染色体制片技术可以分为两种，即压片技术和去壁低渗技术。
Belling(1921)提出植物染色体压片技术后，压片已成为植物染色体研究中最广泛应用的常规技术；但是由于植物细胞有坚实的细胞壁，染色体很难象动物染色体那样平整地贴在载玻片上，Omura 和Kurata(1978)把植物原生质体技术应用到水稻染色体研究之中，用纤维素酶、果胶酶和0.075mol.L-1氯化钾处理取得了一定的进展，陈瑞阳等人（1979、1982）提出了植物染色体标本制备的酶解去壁低渗技术，并在多种植物上得到广泛应用，成为当今植物染色体研究中的重要方法。
压片技术和去壁低渗技术在取材和预处理要求及其操作都是相同的，即两者的材料基础条件是相同的，但它们所采用的染色体分散方法是不同的。
压片法是以人工外加机械压力使染色体分散，而去壁低渗法是用酶分解细胞壁，低渗液使细胞膜吸胀、水表面张力使染色体分开。
两种技术各有其优缺点，前者操作快速简便、省材省时，后者染色体易于展开、且真实不变形，尤其是对成熟细胞多的植物组织，如芽、愈伤组织等材料有独到效果，本实验主要介绍去壁低渗染色体制片技术。
一、实验原理植物根尖的分生细胞的有丝分裂，每天都有分裂高峰时间，此时把根尖固定，经过染色和压片，再置放在显微镜下观察，可以看到大量处于有丝分裂各时期的细胞和染色体。
二、实验目的根尖染色体压片法，是观察植物染色体最常用的方法，也是研究染色体组型、染色体分带、染色体畸变和姊妹染色单体交换的基础。
学习醋酸洋红染色的具体操作方法，掌握植物有丝分裂制片技术，通过大量的制片观察，能比较快速准确地判断细胞有丝分裂前、中、后、末期的染色体图象，并对其典型制片照像。
三、实验材料大蒜（Aillumsativum）、洋葱（Aillumcepa）的鳞基或蚕豆（Viciafaba）的种子。
四、实验内容1、植物染色体制片技术训练，独立完成植物根尖、茎尖及幼叶的取材、预处理、固定、制片、染色等染色体制片全过程，并获得图象清晰、完整、高度分散的染色体典型图象制片；2、染色体显微照相技术训练，用生物摄影显微镜，摄制某新资源植物种典型的染色体图象照片40张，并从中挑选确定清晰的图片；3、细胞有丝分裂典型时期识别技能训练，通过大量的染色体图象观察，能比较快速准确地判断细胞有丝分裂前、中、后、末各个时期的。
去壁低渗法制备植物染色体标本
作业
中期染色体具有哪些形态特征？
绘制一完整细胞并带有随体的中期染色 体图
实验步骤
1、材料培养：将玉米或大麦的种子充分后，摆在铺有滤纸的培养皿 内，在25℃温箱发芽培养
2、预处理：待根长至0.5-1cm时,切取根尖立即放入盛有1ml0.2%秋 水仙素的小瓶中预处理2-3小时
3、前低渗：切取分裂旺盛的部分根尖（1mm），放入0.075mol/L氯 化钾低渗液中，在25℃条件下处理30分钟。以下可分两种方法 进行处理
(5)标本制备:在一张经过充分洗净脱脂,并预先在蒸馏水中冷冻的 清洁载玻片上,用吸管滴2-3滴细胞悬液,立即将载玻片一端抬起, 并轻轻吹气，使细胞迅速分散，然后在酒精灯火焰上微微加热 烤干。
5、经干燥的玻片标本，用Giemsa染色液染色30分钟，然后用自来水 细流冲洗，甩干水珠空气干燥。
6、在显微镜下寻找典型的中期染色体，注意观察中期染色体的长臂、 短臂和着丝粒位置，并尽可能找到具随体染色体。
实验步骤
2）第种方法，悬液法：
（1）制备细胞悬液：倒去双蒸水，用镊子立即将材料夹碎形成细胞 悬液
（2）固定：向细胞中加入新配制的甲醇：冰醋酸（3：1）固定液12ml，使成细胞悬液
（3）去沉淀：静置片刻使大块组织沉淀，然后取上层细胞悬液于另 一个小瓶中。
（4）去上清夜：将上层细胞悬液静置30分钟左右，即可见细胞沉淀， 用吸管轻轻吸去上清夜，留约0.5ml左右细胞悬液置备标本
去壁低渗法制备 植物染色体标本
实验目的
掌握植物染色体标本制备的去壁低渗方法 了解中期染色体的形态结构
实验原理
植物细胞有很坚实的细胞壁，染色体 很难像动物染色体那样平整地贴在载玻 片上，可通过纤维素酶和果胶酶处理去 掉细胞壁；用低渗溶液处理可以提高染 色体的分散程度。陈瑞阳等（1979， 1982）提出了植物染色体标本制备的酶 解去壁低渗法，并在多种植物上得到广 泛应用，成为当前植物染色体研究中的 重要方法。
染色体技术之制片技术的原理
三、比较：
植物染色体标本的制备最常用的方法是压片法， 但压片法的不足是由于细胞堆积致使染色体很难彻 底分散开。 而去壁低渗火焰干燥法则有效地克服了压片法 中存在的染色体分散不开，平展不开等不足，现已 广泛用于核型分析，染色体显带
原理：
有丝分裂是体细胞分裂的主要方式，一般发生在植物的根 尖或茎尖的分生组织中。在有丝分裂时，细胞核与细胞质有 较大的变化，但以细胞核内染色体的变化最为明显，而且是 有规律的进行。 各种生物染色体在数目和形态上是相对恒定的，并随科属 种的不同而具有一定的特征。 人们若需了解某一物种的染色体数目，最有效的方法就是 观察有丝分裂的中期，这样可以得到较为准确的结果。
二、去壁低渗干燥火焰法
原理：
植物细胞有很坚实的细胞壁，染色体很难像动物染色体 那样平整地贴在载玻片上，可通过纤维素酶和果胶酶处理去 掉细胞壁；用低渗溶液处理可以提高染色体的分散程度。 去壁低渗干燥火焰法是：先用纤维素酶和果胶酶去除细胞 壁，得到原生质体，再将细胞进行低渗处理，即把细胞置于 低渗液（低浓度的kcl或蒸馏水）中，使细胞充分吸胀,染色 体分散，平展地铺在载玻片上，再用火焰干燥让染色体紧贴 在载玻片上。
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五、实验步骤
结果观察
• 先在低倍物镜下进行观察，找到较好的 中期分裂相后，直接加显微镜油并转换 为油镜头进行观察（若色）。选择较好的分裂相用显微镜上 配备数码照相装置摄影，并将打印照片 附于实验报告中。
蚕豆根尖2n=2x=12
豌豆根尖 2n=2x=14
实验十二 去壁低渗法制备植物 染色体标本
一、实验目的
1.了解植物细胞周期中染色体的动态变化。 2.学习去壁低渗火焰干燥法进行植物染色体制 片的基本原理和方法。
二、实验原理
• 植物染色体的常规压片技术在植物细胞遗传学研究中发挥了重要 作用,特别 是许多植物的染色体计数和组型分析都是用这种方法完 成的,但这种方法也存在一定缺陷,如染色体很难完全散开,容易产 生重叠、变形、断裂，影响显带结果等，给核型分析增加了不少 困难。另外，在当前植物染色体Giemsa分带研究中，由于压片法 很难完全除掉细胞质及细胞壁对染色体的覆盖，因而常常造成 Giemsa带可重复性较低，使植物染色体Giemsa分带研究受到一定 的影响。其次，由于植物染色体处理方法尚不理想，影响到亚显 微结构的研究。因此改革植物染色体压片法是促进植物染色体的 研究，特别是植物染色体Giemsa分带和亚显微结构研究的重要关 键。20世纪70年代以来，一些从事植物染色体研究的学者，参照 动物及人类染色体标本制备技术，开展了对植物细胞去壁、低渗、 火焰干燥方法的研究，取得了很好的结果，目前这种方法已广泛 用于染色体计数、组型分析、显带、显微操作、原位杂交等分子 细胞遗传学研究领域。
玉米根尖 2n=2x=20
水稻根尖 2n=2x=24
五、作业
• 比较动植物低渗法制作染色体玻片的异 同。
三、实验材料
• 水稻（Oryza sativa）、玉米(Zea mays)、蚕豆（Vicia faba）、豌豆(Pisum sativum)种子或洋葱(allium cepa)鳞茎。
四、实验器具与药品
• ⒈器具：恒温培养箱，显微镜，载玻片， 酒精灯。 • ⒉药品试剂：对二氯苯饱和溶液，甲醇， 冰醋酸，70%酒精，纤维素酶，果胶酶， Giemsa原液，1/15mol/L(pH6.8～7.2)， 0.075mol/L KCl。