G6PD缺乏高铁血红蛋白法检查分子生物学设计性实验

样尿
胆红素增加
实验检查结果： 红细胞大量破坏 单核吞噬细胞系 统产生胆红素增加 超过肝摄取、转化和 排泄的能力 未结合胆红素浓度增加 （血浆胆红素、未结合胆红素含量增高、结合 胆红素浓度改变不大） 当超过 34.2mmol/L时出现显性黄疸 肝对胆红素的摄取、转化和排泄增多 进入胆道系统肠肝循环 尿胆原和尿胆 素增多
1. 根据上述患儿的临床表现和实验室检 查，初步判断患儿是何种疾病？ 蚕豆病起病急遽，大多在进食新鲜蚕豆后 1～2天内发
生溶血，最短者只有2小时，最长者可相隔9天。如因 吸入花粉而发病者，症状可在数分钟内出现。潜伏期 的长短与症状的轻重无关。 本病的贫血程度和症 状大多很严重。症状有全身不适、疲倦乏力、畏寒、 发热、头晕、头痛、厌食、恶心、呕吐、腹痛等。巩 膜轻度黄染，尿色如浓红茶或甚至如酱油。一般病例 症状持续2～6天。最重者出现面色极度苍白，全身衰 竭，脉搏微弱而速，血压下降，神志迟钝或烦躁不安， 少尿或闭尿等急性循环衰竭和急性肾功能衰竭的表现。
2.请设计实验进一步明确诊断 要求：实验名称，实验方法，主要 试剂和仪器，实验操作流程及注意事项， 结果如何分析。
G6PD缺乏症的检查方法：

高铁血红蛋白还原实验 高铁血红蛋白还原实验 变性珠蛋白小体生成实验（可做为G6PD缺乏的筛选实验） G6PD活性测定 G6PD荧光斑点实验（特异性较好、方法简单） 抗坏血酸-氰化物实验
实验检查结果： 潜血：潜在的出血，也就是由肉眼下或是显微 镜下无法观察到有红血球的存在，但如果用试 纸检验时却有反应，当红血球被破坏时，其内 含的血红素会释放出来，所以，尿液试棒才能 侦测到血红素的反应。 尿液下没有见红细胞可能是因为红细胞本身的 寿命已到，也可能是喝了大量水，尿液稀薄红 血球破裂。
注意事项： 1. 对于贫血患者应将红细胞比容调整在0.35~0.40 （35%~40%） 2. 草酸盐抗凝剂具有还原性，不宜使用。 3. 试剂的比例要准确，否则易产生假阳性或假阴性。 4. 标本不应有凝块或溶血，以免影响测定结果。
高铁血红蛋白还原实验 ——G6PD缺乏症检查
结果分析： 高铁血红蛋白还原实验（MHb）正常人还原率>75%(比色 法） 蚕豆病患者MHb还原率31%~74%（杂合子遗传者） 还原率<30%（纯合子型） 患者如存在高铁血红蛋白（HbH）、不稳定血红 蛋白、高脂血症、巨球蛋白血症等均可造成假阳 性。NADPH-MHb还原酶缺乏（罕见）也可出现 阳性结果
高铁血红蛋白还原实验 ——G6PD缺乏症检查
4.孵育后混匀，取血0.1ml，加PH 7.4 磷酸盐缓冲 液10ml，混匀，2min后在波长635nm处测定吸光 度（设为SA） 5.空白对照，用未加亚硝酸纳葡萄糖的血液，同 样孵育后取0.1ml,加PH 7.4 磷酸盐缓冲液10ml， 2min后测定吸光度为B。然后加入亚硝酸钠葡萄 糖混合溶液1滴，混匀，5min后再测其吸光度为 ST，此为高铁血红蛋白对照
蚕豆病发病机理：
1. 蚕豆病的遗传机理 2. 蚕豆病的诱发机制 蚕豆症是一种性染色体隐性遗传,意思是女 蚕豆病属先天性酶代谢缺陷遗传病，与体内红 性的一对 X性染色体都带有疾病基因才会发 细胞缺乏葡萄糖－ 6 －磷酸脱氢酶（ G－6－PD） 病，男性只有一个 X 性染色体，所以只要这 有关。在正常情况下，人体红细胞有一种具抗氧 个X染色体异常就会发病。只有一个异常X染 化作用的物质——谷胱甘肽。 G－6－PD缺乏者， 色体的女性没有症状，但是她们所生的男孩 谷胱甘肽尤其是还原型谷胱甘肽明显减少，致使 如果得到这个异常的X染色体，就会发病。 红细胞对氧化作用十分敏感。 食入新鲜蚕豆后，蚕豆中所含的巢菜碱甙物质， 可使血液中的氧化性物质增多，导致红细胞被破 坏，从而发生以黄疸和贫血为主要特征的全身溶 血性反应。
高铁血红蛋白还原实验 ——G6PD缺乏症检查
操作： 1.在试管中加入葡萄糖20mg，109mmol/L枸橼酸钠溶 液0.2ml,静脉血1.8ml,混匀。
2.离心15min，取出，调整血细胞与血浆的比例为 1： 1 后混匀。
3.取上述抗凝血1ml,加亚硝酸钠葡萄糖混合溶液和亚 甲蓝溶液各0.05ml，颠倒混合15次，使与氧气充分接 触，加塞后放37℃水浴或孵箱中3h。
分 子 生 物 学 设 计 性 实 验
——G6PD 缺 乏 高 铁 血 红 蛋 白 法 检 查 主讲：
组员：
案例：
患儿，男性，3岁，因面色苍白伴血尿1天入院。1天 前食用新鲜蚕豆后，今日出现恶心、呕吐、排尿呈酱油 样色，面色苍白。据家长反映，患者的姐姐也曾发生过 类似情况。 体格检查：体温38℃，脉搏150次/分，呼吸40次/分， 血压80/60mmHg，呼吸急促，神清，萎靡，面色苍白， 皮肤及巩膜黄染，体型较同龄人瘦小。心、肺未及异常， 肝、脾未触及，双肾区无叩击痛，神经系统检查未及异 常。实验室检查：红细胞 1.98×1012/L，血红蛋白 53g/L，血清总胆红素85.5µmol/L，结合胆红素 13.7µmol/L，未结合胆红素71.8µmol/L，尿蛋白（++）， 潜血(+)，尿胆红素(－)，尿胆素原(+)， 尿液镜下 未见红细胞。
高铁血红蛋白还原实验 ——G6PD缺乏症检查
实验试剂：
1. 0.18 mol/L亚硝酸钠和0.28mol/L葡萄糖混溶液 亚硝酸钠1.25g、葡萄糖 5.0g、蒸馏水溶解，并加至100ml储存于棕色瓶中，放4℃冰箱，可保存一 个月 2. 0.4mmol/L亚甲蓝溶液 亚甲蓝（含3个结晶水）0.15g，蒸馏水加至 100ml。先将亚甲蓝放入乳钵中，加蒸馏水少量研磨，待溶解后移到100ml 容量瓶中，在再加蒸馏水至100ml，混匀过滤，此液可贮存3个月。 3. 0.02mol/L磷酸盐缓冲液（PH7.4）磷酸氢二钠229.5mg、磷酸二氢钾 52.2mg，加蒸馏水至100ml。或用0.0667mmol/L PH 7.4磷酸盐缓冲液稀释 3倍。 4. 109mmol/L枸橼酸钠溶液（32g/L）
3. 从生化代谢解释患儿的临床表现和实验检查 结果。 实验检查结果： 红细胞和血红蛋白含量减少 原因：G6PD缺陷 不能通过磷酸戊糖途径 提供足够的NADPH以维持还原型谷胱甘肽 红细胞脆性增加，易于破裂 红细胞在遇到 蚕豆中的某些强氧化剂时，细胞膜破坏 红细胞减少
实验检查结果： 形成原尿后， 超过肾小管和 集合管的重吸 收作用 尿蛋白量 增加
高铁血红蛋白还原实验 ——G6PD缺乏症检查 计算：
高铁血红蛋白还原率（%） = [1 – (SA-B)/(ST-B)]×100%
式中：SA-B、ST-B分别为还原后和还原前高铁 血红蛋白的吸光度； SA-B/ST-B为还原后剩 余高铁血红蛋白的比值。
高铁血红蛋白还原实验 ——G6PD缺乏症检查
临床表现：
面色苍白 红细胞大量破坏 血压降低 心率、脉搏加 快 胃肠血流量 不足
溶血性贫血
白细胞、巨噬细 胞、血小板增多
血红蛋白量减 少
胃肠道平滑 肌痉挛收缩
炎症反应 体温升高
O2供应不足
呼吸急促、微弱
恶心、呕吐
4. 要想探讨该病发生的分子基础，可以用哪些 技术检测什么目的基因？
可使用技术：
扩增G6PD基因第10、11、12、13外显子639bpDNA片 段结合寡核苷酸探针斑点杂交技术

PCR/SSCP片段结合寡核苷酸探针斑点杂交技术 PCR/SSCP分析法 DNA序列分析 探针技术
G6PD 基因定位于 X 染色体长臂 2 区 8 带ⅶ因子及 18Kb，中国人 红-绿色盲基因 之间（Xq28）,长 18Kb，中国人 G6PD 基因 绿色盲基因之间（Xq28） Xq28 目 前依法显得突变种类很多，但能引起题目 中所诉临床症状 G1376Ｔ和 G6PD 的突 变点可能是 G1376Ｔ和 G1388A 点突变 G6PD 基因含 （ 13 个外显子和 12 个内 含子，编码 515 个氨基酸。G6PD 个氨基 酸。G6PD cDNA1388、 cDNA1388、 cDNA1376 同属第 12 外显子，相距仅 12 个核 突变结果使 459 和 463 位的精氨酸 分别被亮氨酸和组 苷酸， 氨酸替代）
5. 患者瘦小与该病症是否有关，为什么？ 无关，因为蚕豆病不属于慢性消 耗性疾病


硝基四氮唑蓝定量法
G6PD比值法 … …
高铁血红蛋白还原实验 ——G6PD缺乏症检查
实验名称：高铁血红蛋白还原实验
——G6PD缺乏症检查
高铁血红蛋白还原实验 ——G6PD缺乏症检查
实验原理：
在有足量的还原辅酶Ⅱ（NADPH)存在下，反应 液中的高铁血红蛋白能被高铁血红蛋白还原酶即细胞 色素b5（黄素酶）还原成亚铁血红蛋白。在体外，这 一还原过程还需要递氢体亚甲蓝的参与。但红细胞内 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）含量正常时，由磷酸 戊糖代谢途径生成NADPH的数量足以完成上述还原 反应。当红细胞内G6PD含量不足或缺乏时，高铁血 红蛋白还原速度减慢，甚至不能还原。高铁血红蛋白 呈褐色，在波长635nm处有吸收峰，可用分光光度计 加以测定。