植物组织过氧化氢含量的测定
过氧化氢酶活力的测定实验报告
竭诚为您提供优质文档/双击可除过氧化氢酶活力的测定实验报告篇一：实验35过氧化氢酶的活性测定植物在逆境下或衰老时，由于体内活性氧代谢加强而使h2o2发生累积。
h2o2可以直接或间接地氧化细胞内核酸，蛋白质等生物大分子，并使细胞膜遭受损害，从而加速细胞的衰老和解体。
过氧化氢酶可以清除h2o2，是植物体内重要的酶促防御系统之一。
因此，植物组织中h2o2含量和过氧化氢酶活性与植物的抗逆性密切相关。
本实验用分光光度法测定过氧化氢含量，利用高锰酸钾滴定法和紫外吸收法测定过氧化氢酶活性。
一、过氧化氢含量的测定【原理】h2o2与硫酸钛（或氯化钛）生成过氧化物—钛复合物黄色沉淀，可被h２so4溶解后，在415nm波长下比色测定。
在一定范围内，其颜色深浅与h2o2浓度呈线性关系。
【仪器和用具】研钵；移液管0.2ml×2支，5ml×1支；容量瓶10ml×7个，离心管5ml×8支；离心机；分光光度计。
【试剂】100μmol/Lh2o2丙酮试剂：取30%分析纯h2o257μl，溶于100ml，再稀释100倍；2mol/L硫酸；5%（w/V）硫酸钛；丙酮；浓氨水。
【方法】1.制作标准曲线：取10ml离心管7支，顺序编号，并按表40-1加入试剂。
待沉淀完全溶解后，将其小心转入10ml容量瓶中，并用蒸馏水少量多次冲洗离心管，将洗涤液合并后定容至10ml 刻度，415nm波长下比色。
2.样品提取和测定：(1)称取新鲜植物组织2~5g（视h2o2含量多少而定），按材料与提取剂1∶1的比例加入4℃下预冷的丙酮和少许石英砂研磨成匀浆后，转入离心管3000r/min下离心10min，弃去残渣，上清液即为样品提取液。
(2)用移液管吸取样品提取液1ml，按表35-1加入5%硫酸钛和浓氨水，待沉淀形成后3000rpm/min离心10min，弃去上清液。
沉淀用丙酮反复洗涤3～5次，直到去除植物色素。
(3)向洗涤后的沉淀中加入2mol硫酸5ml，待完全溶解后，与标准曲线同样的方法定容并比色。
植物过氧化氢(H2O2)说明书
植物过氧化氢（H2O2）酶联免疫分析试剂盒使用说明书本试剂仅供研究使用目的：本试剂盒用于测定植物组织，细胞上清及相关液体样本中过氧化氢（H2O2）的含量。
实验原理：本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中植物过氧化氢（H2O2）水平。
用纯化的植物过氧化氢（H2O2）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入过氧化氢（H2O2）,再与HRP标记的过氧化氢（H2O2）抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。
TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。
颜色的深浅和样品中的过氧化氢（H2O2）呈正相关。
用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中植物过氧化氢（H2O2）浓度。
样本处理及要求：1. 血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。
2. 血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。
3. 尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。
胸腹水、脑脊液参照实行。
4. 细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。
离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清。
检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。
通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。
离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清。
保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。
5. 组织标本：切割标本后，称取重量。
加入一定量的PBS，PH7.4。
用液氮迅速冷冻保存备用。
标本融化后仍然保持2-8℃的温度。
植物组织中过氧化氢含量及过氧化氢酶活性测定
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植物叶片中过氧化氢含量测定方法的改进
5、离心：将反应后的离心管放入离心机中，离心10分钟，分离出上层清液。 6、检测：将上层清液滴加到光电倍增管上，记录光子数。
7、结果计算：根据光子数计算过氧化氢浓度。
三、注意事项
1、实验过程中要保持温度和pH值的稳定，以免影响实验结果。 2、选取的植物组织要健康、无病虫害，以保证实验结果的可靠性。
二、实验步骤
1、准备试剂和设备：准备好过氧化物酶、底物、缓冲液、离心管、离心机、 光电倍增管等。
2、样品处理：选取健康的植物组织，用蒸馏水冲洗干净，然后用滤纸吸干 表面水分。将组织切成小块，放入离心管中。
3、添加试剂：向离心管中加入适量的缓冲液、过氧化物酶和底物，充分混 合均匀。
4、反应：将离心管放入37℃恒温摇床中反应30分钟。
本次演示旨在探讨一种快速测定植物叶片叶绿素含量的方法，为相关研究提 供参考。
方法介绍
目前，测定植物叶片叶绿素含量的方法主要包括分光光度法、光谱法、荧光 法等。其中，分光光度法是最常用的方法之一。本实验采用分光光度法中的 Arnon-Noory公式，通过测量叶片在663nm和645nm处的吸光度来计算叶绿素含量。 该公式已被广泛应用于叶绿素含量的快速测定。
3、测量吸光度：将研磨好的匀浆倒入比色杯中，加入适量的80%丙酮溶液， 充分摇匀后，在分光光度计上分别测量663nm和645nm处的吸光度。
4、数据处理：根据Arnon-Noory公式计算叶绿素含量。
1、不同植物的叶绿素含量存在 差异
2、不同部位的叶片叶绿素含量 也有所不同
结论
通过实验，我们探讨了一种快速测定植物叶片叶绿素含量的方法，并发现不 同植物及不同部位叶片的叶绿素含量存在差异。这些差异可能是由植物本身的生 物学特性、环境因素等共同作用的结果。
[指南]过氧化氢的测定方法
![[指南]过氧化氢的测定方法](https://img.taocdn.com/s3/m/f534caf85ff7ba0d4a7302768e9951e79b8969ef.png)
过氧化氢的测定方法三、过氧化氢酶的活性----紫外吸收法[原理] H202在240nm波长下有强吸收，过氧化氢酶能分解过氧化氢，使反应溶液吸光度（A240）随反应时间而降低。
根据测量吸光的变化速度即可测出过氧化氢酶的活性。
[仪器与用具] 紫外分光光度计；离心机；研钵；容量瓶250ml1个；刻度吸管0.5ml2支；2ml1支；10ml试管3支；恒温水浴锅。
[试剂] 0.2mol?L-1pH7．8磷酸缓冲液(内含1％聚乙烯吡咯烷酮)；0．1mol?L-1H202(用0．1mol?L-1高锰酸钾标定)。
[方法]1．酶液提取称取新鲜小麦叶片或其他植物组织0．5g，置研钵中，加入2-3ml 4℃下预冷的pH7.0磷酸缓冲液和少量石英砂研磨成匀浆后，转入25ml容量瓶中，并用缓冲液冲洗研钵数次，合并冲洗液，并定容到刻度。
混合均匀，将量瓶置5℃冰箱中静置10min，取上部澄清液在4000r.min-1下离心15min，上清液即为过氧化氢酶粗提液，5℃下保存备用。
2．测定取10ml试管3支，其中2支为样品测定管，1支为空白管，按表42-2顺序加入试剂。
25℃预热后,逐管加入0.3ml0.1mol的H2O2，每加完1管立即记时，并迅速倒入石英比色杯，240nm下测定吸光度，每隔1min读数1次，共测4min，待3支管全部测定完后，按式42-3计算酶活性。
3．结果计算以1min内A240减少0．1的酶量为1个酶活单位(u)。
过氧化氢酶的活性（u.g-1min-1）=式中 Aso--加入煮死酶液的对照管吸光值；As1,As2-样品管吸光值；Vt--粗酶提取液总体积(ml);V1--测定用粗酶液体积(ml);FW--样品鲜重(g); 0．1-A20每下降0．1为1个酶活单位(u);t-加过氧化氢到最后一次读数时间(min)。
注意:凡在240nm下有强吸收的物质对本实验有干扰。
【思考题】1、影响过氧化氢酶活性测定的因素有哪些?2、过氧化氢酶与哪些生化过程有关?参考文献【1】Mukherjee S P,Choudhuri M A.Determination of glycoalte oxidase activety H2O2 content and catalase activity.Physiol Plant.1983(58):167-170【2】蒋明义，郭绍刚，渗透胁迫下稻苗铁催化的膜脂过氧化作用.植物生理学报.1996.22(1):6-12【3】林植芳，李双顺等.衰老叶片和叶绿体中H2O2的积累与膜脂过氧化的关系，植物生理学报.1998,14(1):16-22【4】邹琦.植物生理生化实验指导.北京：中国农业出版社，1995【5】【美】吉尔鲍特GG.缪辉南，陈石根等译.酶法分析手册.上海：上海科学技术出版社，1982实验材料：小白菜注意事项：1、三角瓶、容量瓶等务必要清洗干净。
植物细胞过氧化氢的测定方法_张小莉
植物学报Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ｏｆ Ｂｏｔａｎｙ ２００９， ４４ （１）： １０３−１０６， ｗｗｗ．ｃｈｉｎｂｕｌｌｂｏｔａｎｙ．ｃｏｍ收稿日期： ２００７－１２－１１； 接受日期： ２００８－０２－１９基金项目： 国家自然科学基金（Ｎｏ．３０５３０４３０）＊ 通讯作者。
Ｅ－ｍａｉｌ： ｓｏｎｇｃｐ＠ｈｅｎｕ．ｅｄｕ．ｃｎ．技术方法．植物细胞过氧化氢的测定方法张小莉１，２， 王鹏程１， 宋纯鹏１＊１河南大学生命科学学院， 河南省植物逆境生物学重点实验室， 开封 ４７５００１； ２河南省中医学院， 郑州 ４５０００８摘要 过氧化氢是重要的活性氧之一， 激素等发育信号和胁迫刺激可以诱导细胞内Ｈ２Ｏ２的产生和积累， 继而调控植物的气孔运动、生长发育、衰老和逆境应答等诸多生理过程。
准确测定植物细胞内Ｈ２Ｏ２的含量及变化模式是系统研究Ｈ２Ｏ２信号转导及其生物学功能的一个关键技术。
该文以拟南芥为实验材料， 介绍了目前植物细胞Ｈ２Ｏ２的主要测定方法， 包括激光共聚焦显微检测、紫外分光光度计检测和ＤＡＢ组织染色， 在此基础上比较分析了上述方法在灵敏度、检测范围、定量、成本以及耗时等方面的差异， 为相关研究选择合适的Ｈ２Ｏ２检测技术提供参考。
关键词 激光共聚焦显微成像， ＤＡＢ染色， 过氧化氢， 分光光度法张小莉， 王鹏程， 宋纯鹏 （２００９）． 植物细胞过氧化氢的测定方法． 植物学报 ４４， １０３－１０６．过氧化氢是活性氧（ａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ｓｐｅｃｉｅｓ， ＡＯＳ）的一种， 多种外界刺激或细胞内信号分子都可以导致细胞内Ｈ２Ｏ２的积累。
Ｈ２Ｏ２不仅具有损伤生物大分子、产生细胞毒害的能力， 而且还被证明可以作为信号分子， 在气孔运动、生物和非生物胁迫应答、细胞程序性死亡、激素应答以及生长发育调控过程中起重要作用（Ｎｅｉｌｌ ｅｔ ａｌ．， ２００２； Ｌａｌｏｉ ｅｔ ａｌ．， ２００４； Ｃｈｅｎｇ ａｎｄ Ｓｏｎｇ，２００６）。
过氧化氢（H2O2）含量检测试剂盒说明书
过氧化氢（H2O2）含量检测试剂盒说明书可见分光光度法货号：BC3590规格：50T/48S产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。
试剂名称规格保存条件试剂一液体100 mL×1瓶（自备）4℃保存试剂二粉剂×1瓶4℃保存试剂三液体12 mL×1瓶4℃保存试剂四液体60 mL×1瓶4℃保存标准品液体1 mL×1支4℃保存溶液的配制：1、试剂一：丙酮自备。
2、试剂二：临用前加入6 mL浓盐酸充分溶解备用，用不完的试剂4℃保存。
3、标准品：1mmol/mL H2O2标准液。
产品说明：H2O2是生物体内最常见的活性氧分子，主要由SOD和XOD等催化产生，由CAT和POD等催化降解。
H2O2不仅是重要的活性氧之一，也是活性氧相互转化的枢纽。
一方面，H2O2可以直接或间接地氧化细胞内核酸，蛋白质等生物大分子，并使细胞膜遭受损害，从而加速细胞的衰老和解体；另一方面H2O2也是许多氧化应激反应中的关键调节因子。
H2O2与硫酸钛生成黄色的过氧化钛复合物，在415nm有特征吸收。
技术指标：最低检出限：0.002 μmol/mL线性范围：0.0097-1.5 μmol/mL注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。
如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：可见分光光度计、台式离心机、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、丙酮、浓盐酸、研钵/匀浆器和冰。
操作步骤：一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）1、细菌、细胞或组织样本的制备：收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照每500万细菌或细胞加入1mL试剂一，超声波破碎细菌或细胞（功率20%，超声3秒，间隔10秒，重复30次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
2、组织样本的制备：称取约0.1g组织，加入1mL试剂一进行冰浴匀浆；8000g 4℃离心10min，取全部上清液（注意吸取干净），置冰上待测。
POD 测定方法
植物体POD的测定※<原理>了解过氧化氢酶活性测定的几种方法，掌握用愈创木酚法分别测定过氧化氢酶和过氧化物酶的活性。
过氧化物酶广泛颁布于植物的各个组织器官中。
在有过氧化氢存在下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶褐色物质，可用分光光度计测量生成物的含量。
※<实验材料、试剂与仪器设备>1、实验仪器722型分光光度计、离心机、秒表、电子天平、研钵2、实验试剂愈创木酚、30%过氧化氢、20mmol/LKH2PO4、100mmol/L磷酸缓冲液(pH6.0)、反应混合液［100mmol/L磷酸缓冲液(pH6.0)50mL，加入愈创木酚28uL，加热搅拌，直至愈创木酚溶解，待溶液冷却后，加入30%过氧化氢19uL，混合均匀保存于冰箱中］3、实验材料任何植物材料※<实验步骤>1、粗酶液的提取称取植物(小麦叶片)材料0.1g，加20mmol/LKH2PO4 5mL，于研钵中研磨成匀浆，以10000r/min离心10分钟，收集上清液保存在冷处，所得残渣再用20mmol/LKH2PO45mL溶液提取一次，全并两次上清液。
2、酶活性的测定取比色皿2只，于一只中加入反应混合液3mL，KH2PO41mL，作为校零对照，另一只中加入反应混合液3mL，上述酶液1mL(如酶活性过高可适当稀释)，立即开启秒表，于分光光度计470nm波长下测量OD值，每隔30s读数一次。
以每分钟表示酶活性大小，即以△OD470/min.mg蛋白质表示，蛋白质含量测定按Folin法进行。
※<结果计算>以每分钟吸光度变化值表示酶活性大小，即以ΔA470/[min.g(鲜重)]表示之。
也可以用每min 内A470变化0.01为1个过氧化物酶活性单位(u)表示。
过氧化物酶活性[u/(g.min)]=式中：ΔA470——反应时间内吸光度的变化。
W——植物鲜重，g。
VT ——提取酶液总体积，mL。
Vs ——测定时取用酶液体积,mL。
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植物组织过氧化氢含量
的测定
Company number：【0089WT-8898YT-W8CCB-BUUT-202108】
配制100ml 、100umol/L 的过氧化氢溶液需要多少30%的过氧化氢原液请写出计算过程。
答：首先计算其摩尔浓度：
若30%为其质量百分数
双氧水30%浓度的试剂（上海国药集团出品），室温时实测密度为：1,122g/L，所以，1L 30%含量的双氧水中过氧化氢含量为：1122g/L ×1L×30%=337g
又H2O2的分子量为，那么1L 30%含量的双氧水中过氧化氢浓度为：337/= mol/L.
100ml×10-3×100umol/L×10-6=mol/L×V
V=10-6L=1 ul
若30%为体积分数
100% H2O2密度是1,440 g/L, 30 ml H2O2的质量为1440 g/L ×30
ml×10-3=，30%含量的双氧水中过氧化氢浓度为：= mol/L.
100ml×10-3×100umol/L×10-6=mol/L×V
V=×10-7L= ul
植物组织中过氧化氢含量测定
植物在逆境下或衰老时，由于体内活性氧代谢加强而使H2O2发生累积。
H2O2可以直接或间接地氧化细胞内核酸，蛋白质等生物大分子，并使细胞膜遭受损害，从而加速细胞的衰老和解体。
过氧化氢酶可以清除H2O2，是植物体内重要的酶促防御系统之一。
因此，植物组织中H2O2含量和过氧化氢酶活性与植物的抗逆性密切相关。
本实验用分光光度法测定过氧化氢含量，利用高锰酸钾滴定法和紫外吸收法测定过氧化氢酶活性。
【原理】
H2O2与硫酸钛（或氯化钛）生成过氧化物—钛复合物黄色沉淀，可被H２SO4溶解后，在415nm波长下比色测定。
在一定范围内，其颜色深浅与H2O2浓度呈线性关系。
【仪器和用具】
研钵；移液管×2支，5ml×1支；容量瓶10ml×7个，离心管5ml×8支；离心机；分光光度计。
【试剂】
100μmol/L H2O2丙酮试剂：取30%分析纯H2O2 57μl，溶于100ml，再稀释100倍；2mol/L硫酸；5%（W/V）硫酸钛；丙酮；浓氨水。
【方法】
1.制作标准曲线：取10ml离心管7支，顺序编号，并按表加入试剂。
待沉淀完全溶解后，将其小心转入10ml容量瓶中，并用蒸馏水少量多次冲洗离心管，将洗涤液合并后定容至10ml刻度，415nm波长下比色。
2.样品提取和测定：(1)称取新鲜植物组织2g，按材料与提取剂1∶1的比例加入4℃下预冷的丙酮和少许石英砂研磨成匀浆后，转入离心管3000 r/min下离心10min，弃去残渣，上清液即为样品提取液。
(2)用移液管吸取样品提取液1ml，按表1加入5%硫酸钛和浓氨水，待沉淀形成后5000rpm/min离心10min，弃去上清液。
沉淀用丙酮反复洗涤3～5次，直到去除植物色素。
(3)向洗涤后的沉淀中加入2mol硫酸5ml，待完全溶解后，与标准曲线同样的方法定容并比色。
3.结果计算：
植物组织中H2O2含量(μmol/g Fw)=
C Vt FW V
⨯
⨯1
式中 C—标准曲线上查得样品中H2O2浓度（μmol）； V t—样品提取液总体积（ml）；
V1—测定时用样品提取液体积（ml）；
FW—植物组织鲜重（g）。
得出标准曲线如下图：
测定所得样品的吸光度为，带入得，考虑到称取鲜重代入公式含量为H2O2 =μmol/g Fw。
注意事项
1、离心机离心时应该先配平。
2、加试剂的顺序一定不可以错。
3、每次加完一种试剂后都要充分摇匀。
4、注意所用H2O2的浓度。