离子交换层析分离纯化蔗糖酶
蔗糖酶的分离提纯及酶促反应动力学实验
11.04.2024
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3、 蔗糖酶粗品（E1）的制备
①自溶：15g（一小袋）高活性干酵母粉倒入250ml烧杯中、少量多次地 加入50ml蒸馏水，搅拌均匀，成糊状后加入1.5g乙酸钠、25ml乙酸乙 酯，搅匀，再于35℃ 恒温水浴中搅拌30分钟，观察菌体自溶现象；
②抽提：补加蒸馏水30ml，搅匀，盖好，于35℃ 恒温过夜， 8000r/min
7.学习掌握酶促反应动力学中用双倒数法测定Km的方法、选择 确
定酶促反应最适条件（温度、pH值、离子浓度等）的方法；
8.学习《正交试验法》中最简单的入门知识：用正交表设计
试验方案、用极差分析处理试验数据并分析试验结果。
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Байду номын сангаас
二、实验原理
前言
酶是生物体内具有催化功能的蛋白质，可据酶蛋白的结构 和性质选择分离提纯条件和含量测定方法。
② 工作以曲葡线萄。糖(mg)含量为横坐标、A540值为纵坐标，画出
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3，5-二硝基水杨酸比色定糖法工作曲线的制作
试号 含糖量 葡萄糖标准液 去离子水 3，5-二硝基水杨酸试剂 A540
（mg） （ml） （ml）
（ ml）
10
0
2.0
3
2 0.4 0.2
1.8
3
3 0.8 0.4
⑥ 保存成品E3
测酶E3活力及蛋白质浓度
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成品E3 计算出E3浓度
周六（全天）上午8：00开始
(1).蔗糖酶米氏常数的测定
(2).用正交法测定几种因素
对蔗糖酶 活力的影响
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浙江大学生物化学实验甲 2011-酵母蔗糖酶的提取原理
酵母蔗糖酶的制备原理一、蔗糖酶(invertase or sucrase)简介蔗糖酶（EC.3.2.1.26）为水解酶类，主要存在于酵母中，如啤酒酵母、面包酵母，也存在于曲霉、青霉和毛霉等霉菌和细菌及植物中，可专一性地催化蔗糖水解为果糖和葡萄糖的反应。
酵母蔗糖酶的分子量约270000D（因来源不同，分子量有差异），pI约5.6，最适pH4.6，耐酸和热，最适温度50℃。
耐乙醇，因此可用乙醇沉淀进行分离纯化。
二、酵母蔗糖酶的分离纯化本试验分离纯化酵母蔗糖酶分四步：缓冲液抽提，加热纯化，乙醇分级沉淀，DEAE-Sepharose柱层析分离纯化。
㈠、前三步分离纯化的原理如下：㈡、离子交换DEAE-Sepharose柱层析分离纯化的原理1、离子交换柱层析分离混合物的基本原理离子交换层析（Ion Exchange Chromatography）是一种根据待分离物质的阳或阴离子和相对应的离子交换剂间的静电结合，即根据物质酸碱性、极性等差异，通过离子间的吸附和脱吸附而将溶液中各组分分开的一种技术。
离子交换层析是一种液-固相层析技术。
其中，液相称洗脱液，固相的惰性支持介质称离子交换剂。
在离子交换剂上具有带电基团，不同的交换剂所具有的带电基团的电荷性质不同，如交换剂上的带电基团带正电荷，则可结合溶液（液相）中的阴离子，这样的交换剂称为阴离子交换剂，如DEAE 纤维素（二乙胺基乙基-纤维素）、强碱型的离子交换树脂等。
反之，如交换剂上的带电基团带负电荷，则可结合溶液中的阳离子，这样的交换剂称为阳离子交换剂，如CM-纤维素、强酸性的离子交换树脂等。
离子与交换剂的静电结合作用具有如下特点：可逆性：在一定条件下，结合在交换剂上的离子可被其它离子取代而离开交换剂并随洗脱液流出层析柱。
选择性：离子所带的电荷越多，水合离子半径越小越易结合。
遵循质量作用定理：对某一特定离子，随离子浓度的增大，则遵循质量作用定理向与交 换剂结合方向进行。
浙江大学生物化学实验甲酵母蔗糖酶的提取原理
酵母蔗糖酶的制备原理一、蔗糖酶(invertase or sucrase)简介蔗糖酶（EC.3.2.1.26）为水解酶类，主要存在于酵母中，如啤酒酵母、面包酵母，也存在于曲霉、青霉和毛霉等霉菌和细菌及植物中，可专一性地催化蔗糖水解为果糖和葡萄糖的反应。
酵母蔗糖酶的分子量约270000D（因来源不同，分子量有差异），pI约5.6，最适pH4.6，耐酸和热，最适温度50℃。
耐乙醇，因此可用乙醇沉淀进行分离纯化。
二、酵母蔗糖酶的分离纯化本试验分离纯化酵母蔗糖酶分四步：缓冲液抽提，加热纯化，乙醇分级沉淀，DEAE-Sepharose柱层析分离纯化。
㈠、前三步分离纯化的原理如下：㈡、离子交换DEAE-Sepharose柱层析分离纯化的原理1、离子交换柱层析分离混合物的基本原理离子交换层析（Ion Exchange Chromatography）是一种根据待分离物质的阳或阴离子和相对应的离子交换剂间的静电结合，即根据物质酸碱性、极性等差异，通过离子间的吸附和脱吸附而将溶液中各组分分开的一种技术。
离子交换层析是一种液-固相层析技术。
其中，液相称洗脱液，固相的惰性支持介质称离子交换剂。
在离子交换剂上具有带电基团，不同的交换剂所具有的带电基团的电荷性质不同，如交换剂上的带电基团带正电荷，则可结合溶液（液相）中的阴离子，这样的交换剂称为阴离子交换剂，如DEAE 纤维素（二乙胺基乙基-纤维素）、强碱型的离子交换树脂等。
反之，如交换剂上的带电基团带负电荷，则可结合溶液中的阳离子，这样的交换剂称为阳离子交换剂，如CM-纤维素、强酸性的离子交换树脂等。
离子与交换剂的静电结合作用具有如下特点：可逆性：在一定条件下，结合在交换剂上的离子可被其它离子取代而离开交换剂并随洗脱液流出层析柱。
选择性：离子所带的电荷越多，水合离子半径越小越易结合。
遵循质量作用定理：对某一特定离子，随离子浓度的增大，则遵循质量作用定理向与交 换剂结合方向进行。
蔗糖酶的提取和纯化步骤
色1小时。
10. 脱色：回收染色液，凝胶板先用水漂洗数次，再用脱色液脱色，直 到蛋白质区带清晰。确定目的蛋白条带位置，估算分子量，比较不
同纯化过程对杂蛋白去除状况。
※剥胶时要小心，保持胶完好无损，染色要充分。
低分子量标准蛋白试剂盒:
•
低分子量标准蛋白： 兔磷酸化酶B 牛血清白蛋白
MW=97,400 MW=66,200
②以1号管为参比调零，记录光密度值A650，以标准液的浓度为横坐 标， A650值为纵坐标，画出工作曲线。
蛋白含量测定的计算
Pr (mg/ml)=
A650值对应的µ g数(Pr)×10-3 ×稀释倍数 Pr溶液的ml数
BSA标准液 250 µ g/ml
SDS-PAGE电泳实验过程
1. 准备玻璃板：将玻璃板用蒸馏水洗净晾干(实验室前后的空调
蔗糖酶米氏常数的测定操作方法
1）将离子交换柱层析得的E3稀释(pH4.6 HAC缓冲液)至20U/mL，共16ml。 2）取试管8支，按0--7编号，0为对照管。 3）按表 1将蔗糖液、醋酸缓冲液分别加入试管中，于35℃水浴中保温（使 温度平衡，以下同）10min。
4）取约16ml酶液，放入同一水浴中保温约10min。
Buffer
10%SDS 10%Ap TEMED
6、样品预处理：
低分子量蛋白Mark,E1,E2,E3,E4,牛血清白蛋 白。 （1）低分子量蛋白Mark、牛血清白蛋白和E4的样品 由实验室提供。
（2）E1,E2,E3,E4分别取20µ l，再加入20µ l 2倍 (2X)样品缓冲液，在沸水中煮3分钟(本次实验1个 E3、E4-1和E4-2由实验室提供)，点动离心除沉淀。
线的时候，将电流改为20mA （如果同时电泳两块胶，电流恒定在
生物化学实验示范报告-蔗糖酶的提取与纯化(正确)
生物化学实验示范报告:实验名称：蔗糖酶的分离提取与纯化实验目的:1．掌握蔗糖酶分离提纯的原理与实验操作方法；2．掌握有机溶剂分级纯化蔗糖酶的原理和操作方法，了解蔗糖酶的离子交换层析法纯化原理；3．掌握酶活、酶比活等基本概念及测定原理、计算和操作方法；4．巩固并熟练掌握Folin法测定牛血清蛋白和3、5 -二硝基水杨酸法测定葡萄糖标准曲线制作方法，并能通过回归方程测定还原糖及蛋白质的含量。
实验原理：蔗糖酶分离提纯原理：酵母中的蔗糖酶含量很丰富，实验以安琪酵母粉为原料，首先采用自溶法破碎细胞壁、再用乙醇分级和DEAE—纤维素柱层析两步分离提纯，制备纯度较高的蔗糖酶制剂。
酶分离提纯的原理与蛋白质的相同。
但酶是有催化活性的蛋白质，在分离提纯过程中必须注意：防止酶变性失活；随时测定酶的比活力，并跟踪酶的去向、衡量酶提纯的程度及得率。
有机溶剂分级纯化蔗糖酶原理：利用不同蛋白质在不同浓度的有机溶剂—乙醇中溶解度的差异将蔗糖酶蛋白与其它蛋白质杂质进行有机溶剂分级沉淀，而使提取的蔗糖酶得以纯化（32％的乙醇饱和度沉淀分离杂蛋白，47.5％的乙醇饱和度沉淀分离酶蛋白）。
操作必须在低温下进行且避免有机溶剂局部过浓；分离后应立刻除去有机溶剂并用水或缓冲溶液溶解沉淀的酶蛋白（复溶），确保酶的活性；pH多选在酶蛋白的等电点附近；有机溶剂在中性盐存在时能增加蛋白质的溶解度减少变性，提高分离效果。
蔗糖酶的离子交换层析法纯化原理：本实验采用DEAE-纤维素（DEAE-C11）微粒状的、弱碱性的阴离子纤维素为柱料，进行蔗糖酶的进一步纯化。
它具有分辨率高、化学性质稳定、有开放性的长链结构、有较大的表面积、对蛋白质的吸附容量大等优点；纤维素上离子基团的数量不多，排列疏散，对蛋白质的吸附不是太牢固，用缓和的洗脱条件即可达到分离的目的，不致引起蛋白质的变性。
蔗糖酶活力与比活的测定：在蔗糖酶的纯化过程中，通过3、5-二硝基水杨酸法测定蔗糖酶催化蔗糖生成还原糖的量，测定酶活力大小，跟踪酶的活力。
离子交换层析纯化蔗糖酶实验方法改进研究
X U P ei2y a, Q IU L e2quan (Co llege of B io log ica l and Environm en ta l Eng. , Zhejiang U n iv. of T echno logy, H angzhou 310032, Ch ina)
Sep h ro se 314. 8
2. 05
2. 87
110. 3
109. 7
98. 2
293. 4ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
0. 49
0. 92
200. 4
318. 9
43. 4
93. 2
浓缩倍数
2. 03
1. 82
2. 91
4 结 语
经 过 上 述 几 种 纯 化 方 法 的 比 较, 采 用 Q Sep ha ro se 纯化方法进行实验改进, 具有如下特点。
100m in 缩短到现在的 50m in, 减少不必要的实验重 复, 实验过程比较紧凑。
(3) 节约实验支出。离子交换介质D EA E2纤维素 由于流速慢, 柱床高度会随缓冲液浓度及 pH 改变, 不 能承受 0. 1M 以上 N aO H 清洗, 重生效果差, 寿命短。 琼脂糖介质在分辨率、回收率、流速等具有优越性。 且 其化学稳定性极高, 不易破碎, 可以承受 1M N aO H 的 清洗, 重生效果好, 可以使用数百至上千次, 因而降低 了成本。
采用 Pha rm acia 公司生产的琼脂糖为基质的弱阴 离子交换柱 D EA E Sep ha ro se 16×10 用起始缓冲液 0. 05M T ris2HCL pH 7. 3 缓冲液平衡, 加样, 先用0. 05 M T ris2HCL 缓冲液洗脱, 流速为每分钟 1mL , 然后盐 度 梯 度 洗 脱, 经 100m in 流 动 相 由 0. 05M T ris2HCL pH 7. 3 缓冲液到 1M N aCL 的 0. 05M T ris2HCL pH 7. 3 缓冲液, 每管收集 3mL , 进行紫外检测 (280nm ) 和酶活 力测定。
浙江大学生物化学丙实验报告
. . . . 实验报告课程名称： 生物化学实验（丙） 指导老师： 方祥年 成绩：实验名称： 离子交换柱层析分离纯化蔗糖酶 同组学生： 金宇尊、鲍其琛 一、实验目的和要求（必填） 二、实验容和原理（必填） 三、实验材料与试剂（必填） 四、实验器材与仪器（必填） 五、操作方法和实验步骤（必填） 六、实验数据记录和处理 七、实验结果与分析（必填） 八、讨论、心得一、实验目的和要求1、学习离子交换层析的基本原理；2、学习离子交换层析分离蛋白质的基本方法和技术；3、学习蔗糖酶活性检测的基本原理和方法。
二、实验容和原理（1）实验原理 1、离子交换层析：以离子交换剂为固定相，液体为流动相进行。
离子交换剂与水溶液中离子或离子化合物的反应主要以离子交换方式进行，或者借助离子交换剂上电荷基团对溶液中离子或离子化合物的吸附作用进行。
这些过程都是可逆的。
在某一pH 值的溶液中，不同的蛋白质所带的电荷存在差异，因而与离子交换剂的亲和力就有区别。
当洗脱液的pH 改变或者盐的离子强度逐渐提高时，使某一种蛋白质的电荷被中和，与离子交换剂的亲和力降低，不同的蛋白质按所带电荷的强弱逐一被洗脱下来，达到分离的目的。
离子交换剂是由基质、电荷基团（或功能基团）和反离子构成。
基质 电荷基团 反离子 电荷基团反离子电荷基团反离子基质基质—＋—＋＋可逆交换可逆交换＋＋溶液中的离子（交联纤维素、交联葡聚糖、交联琼脂糖)— ——阳离子交阴离子交换剂专业： 农业资源与环境姓名： 李佳怡学号： 3130100246 日期： 2015.5.19地点： 生物实验中心310装订线由于蔗糖酶的pI偏酸性,所以在pH7.3 缓冲液的环境中，粗分离纯化样品蔗糖酶带负电荷，因此我们用阴离子交换剂达到分离蔗糖酶的目的。
2、酶活力检测(定性检测）蔗糖酶（β-D-呋喃型果糖苷-果糖水解酶EC 3.2.1.26），能催化非还原性双糖（蔗糖）裂解，将蔗糖水解为等量的葡萄糖和果糖。
生化实验报告-离子交换柱层析分离纯化蔗糖酶
实验报告一、实验目的和要求 三、实验材料和主要仪器 五、实验数据记录和处理 七、实验讨论和心得二、实验内容和原理 四、实验方法和步骤 六、实验结果和分析一、实验目的和要求1、学习离子交换层析的基本原理2、学习离子交换层析分离蛋白质的基本方法和技术3、学习蔗糖酶活性检测的基本原理和方法二、实验内容和原理1、离子交换层析由于蔗糖酶的pI 偏酸性,所以在pH7.3 缓冲液的环境中，粗分离纯化样品蔗糖酶带负电荷，因此我们用阴离子交换剂可以先与蔗糖酶样品可逆交换吸附，然后通过用盐离子强度逐渐提高的洗脱液，使蔗糖酶和其他杂蛋白质的电荷被中和，与离子交换剂的亲和力降低，把不同的蛋白质按所带电荷的强弱逐一被洗脱下来，从而达到分离蔗糖酶的目的。
2、酶活力检测蔗糖酶是一种水解酶，它能蔗糖水解为等量的葡萄糖和果糖（还原糖）。
（50℃水解） 3.5－二硝基水杨酸与还原糖共热被还原成棕红色的氨基化合物，在一定范围内还原糖的量和反应液的颜色深度成正比。
（100℃显色）三、实验材料和主要仪器1、实验材料蔗糖酶粗分离纯化（溶解即为样品Ⅲ） 2、实验试剂⑴ DEAE-Sepharose Fast Flow⑵ 20mmol/L Tris-HCl pH7.3 缓冲液⑶ 20mmol/L Tris-HCl （1mol/L NaCl ）pH7.3缓冲液 ⑷ 0.2mol/L 乙酸缓冲液，pH4.5 ⑸ 5%蔗糖溶液⑹ 3，5-二硝基水杨酸试剂 3、实验仪器（1）高速冷冻离心机（2）层析柱（φ1.0×20㎝ ）(1支/组）（3）ÄKTA TM start（1套/组）（4）部分收集器及收集试管（4ml/管）（1台/组）（5）－20℃冰箱（保存样品用）（6）微量移液枪 200ul、1000ul（7）1.5ml离心管（留样品Ⅲ和样品Ⅳ用）（8）7ml离心管（留样品Ⅳ用）（9）恒温水浴（50℃、100℃）（10）试管、移液管、试管架等四、实验方法和步骤1、仪器连接（1）接通各仪器电源，将A,B泵头分别放置A，B两个溶液瓶中。
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实验报告课程名称：生物化学实验（甲） 指导老师： 成绩：__________________ 同组学生姓名：一、实验目的和要求（必填） 二、实验内容和原理（必填） 三、实验材料与试剂（必填） 四、实验器材与仪器（必填） 五、操作方法和实验步骤（必填） 六、实验数据记录和处理 七、实验结果与分析（必填） 八、讨论、心得离子交换柱层析分离纯化蔗糖酶一、实验目的和要求：1、学习离子交换层析的基本原理；2、学习离子交换层析分离蛋白质的基本方法和技术；3、学习蔗糖酶活性检测的基本原理和方法。
二、实验内容和原理：1、离子交换层析（Ion Exchange Chromatography 简称为IEC ）离子交换层析是常用的层析方法之一。
它是以离子交换剂为固定相，根据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。
离子交换剂与流动相中离子或离子化合物的反应主要以离子交换方式进行，或者借助离子交换剂上电荷基团对溶液中离子或离子化合物的吸附作用进行。
这些过程都是可逆的。
在某一pH 值的溶液中，不同的蛋白质所带的电荷存在差异，因而与离子交换剂的亲和力就有区别。
当洗脱液的pH 改变或者盐的离子强度逐渐提高时，使某一种蛋白质的电荷被中和，与离子交换剂的亲和力降低，不同的蛋白质按所带电荷的强弱逐一被洗脱下来，达到分离的目的。
离子交换剂是由基质、电荷基团（或功能基团）和反离子构成。
基质————电荷基团————反离子专业：姓名： 学号： 日期： 地点：装订线溶液中的离子或离子化合物阳离子交换剂基质—+ 《==可逆交换==》+阴离子交换剂基质+ —《==可逆交换==》—由于蔗糖酶的pI偏酸性,所以在pH7.3 缓冲液环境中，粗分离纯化样品蔗糖酶带负电荷，因此我们用阴离子交换剂可以先与蔗糖酶样品可逆交换吸附，然后通过用盐离子强度逐渐提高的洗脱液，使蔗糖酶和其他杂蛋白质的电荷被中和，与离子交换剂的亲和力降低，把不同的蛋白质按所带电荷的强弱逐一被洗脱下来，从而达到分离蔗糖酶的目的。
2、酶活力检测(定性检测）蔗糖酶（β-D-呋喃型果糖苷-果糖水解酶EC 3.2.1.26），是一种水解酶。
它能催化非还原性双糖（蔗糖）的1,2－糖苷键裂解，将蔗糖水解为等量的葡萄糖和果糖（还原糖）。
因此，每水解1mol蔗糖，就能生成2mol还原糖。
还原糖的测定有多种方法，如采用3.5－二硝基水杨酸法，其原理是 3.5－二硝基水杨酸与还原糖共热被还原成棕红色的氨基化合物，在一定范围内还原糖的量和反应液的颜色深度成正比。
本实验在离子交换层析分离纯化的过程中，对分离纯化样品采用 3.5－二硝基水杨酸法来初步判定样品中还原糖含量的多少，由此来确定并收集蔗糖酶纯化样品。
三、实验材料与试剂：1、实验材料蔗糖酶粗分离纯化样品Ⅲ2、实验试剂⑴DEAE-Sepharose Fast Flow (弱碱性阴离子交换剂)；⑵20mmol/L Tris-HCl pH7.3 缓冲液；⑶20mmol/L Tris-HCl，（1mol/L NaCl）pH7.3缓冲液(学生自配）；⑷0.2mol/L乙酸缓冲液，pH4.5 ；⑸5%蔗糖溶液；⑹3，5-二硝基水杨酸试剂甲液：溶解6.9g 结晶酚于15.2ml 10％NaOH溶液中，并用水稀释至69ml,在此溶液中加6.9g亚硫酸氢钠。
乙液：称取255克酒石酸钾钠加到300ml 10%NaOH溶液中，再加入800ml 1%3,5-二硝基水杨酸溶液.甲,乙二溶液相混合即得黄色试剂,贮于棕色瓶中备用,在室温放置7-10天以后使用。
四、实验器材与仪器：1、高速冷冻离心机；2、层析柱（φ1.0×20㎝）(1支/组）；3、恒流泵（流速0.8～1ml/min）(10rpm)（1台/组）；4、梯度混合器(100ml梯度杯)（1套/组）；5、核酸蛋白检测仪（灵敏度0.5A）（1台/组）；6、记录仪（纸速：0.5mm/min；灵敏度：50mV）（1台/组）；7、部分收集器及收集试管（4ml/管）（1台/组）；8、铁架台、夹子（固定层析柱用）（1套/组）；9、－20℃冰箱（保存样品用）；10、微量移液枪200ul、1000ul；11、1.5ml离心管（留样品Ⅲ和样品Ⅳ用）；12、7ml离心管（留样品Ⅳ用）；13、恒温水浴（100℃）；14、试管、移液管、试管架等。
五、操作方法和实验步骤：1、离子交换剂准备：(实验室已准备好）DEAE—Sephadex，取适量DEAE—Sephadex，加入0.5mol/L NaOH溶液，轻轻搅拌，浸泡0.5小时，用玻璃砂漏斗抽滤，并用去离子水洗至近中性，抽干后，放入小烧杯中，加50ml 0.5 mol/L HCl, 搅匀，浸泡0.5小时，同上，用去离子水洗至近中性，（DEAE- Sepharose Fast Flow，用后务必回收）。
浸入20mmol/L Tris-HCl pH7.3 缓冲液中平衡备用。
2、样品处理：将乙醇沉淀的蔗糖酶蛋白样品充分溶解于15ml 20mmol/L Tris-HCl pH7.3 缓冲液；4℃15000r/min, 离心10分钟，收集样品上清液（样品Ⅲ）测量总体积(ml数），留取1ml （样品Ⅲ）用于蔗糖酶蛋白含量测定、蔗糖酶活力的测定以及用于SDS-PAGE分析；将其余样品（样品Ⅲ）作离子交换柱层析进一步分离纯化蔗糖酶(可先取50ul酶液做酶活力检测）。
3、纯化检测仪器连接：将梯度混合器(100ml梯度杯)，层析柱（φ1.0×20㎝），恒流泵(10rpm) （流速0.8～1ml/min），核酸蛋白检测仪（灵敏度0.5A），记录仪（纸速：0.5mm/min，50mV）、部分收集器（4～5 ml/管/5min）等按下图连接并设置好。
纯化检测仪器连接示意图：1、50ml 20mmol/L Tris-HCl，pH7.3缓冲液2、50ml 20mmol/L Tris-HCl，（1mol/L NaCl）pH7.3缓冲液4、装柱(层析柱规格1×20cm)、平衡：装柱前先调好流速0.8ml～1ml/min，然后将柱下端的出水口关闭，加进5ml（约1/3柱床体积）20 mmol/L Tris-HCl、pH7.3的缓冲液，然后将处理好的DEAE—Sepharose Fast Flow，轻轻搅匀（注意不能太稀，也不能太稠，刚好呈流质状态）沿玻棒靠近柱管壁慢慢连续加进柱内至层析柱上端。
注意不能带进气泡，待凝胶自然沉积离柱管上端约1-2cm 后松开层析柱出口，控制流速0.8ml～1ml/min；待柱内DEAE —Sepharose Fast Flow 凝胶沉降至稳定高度并分出水层后，吸去水层，用玻棒将沉降界面搅匀，再补加处理好的DEAE—Sepharose Fast Flow凝胶，直到凝胶沉降至稳定高度距层析柱上端约3cm处为止（这时须保持DEAE—Sepharose Fast Flow凝胶柱面平整）。
用20 mmol/L Tris-HCl、pH7.3的缓冲液连通层析柱，进行柱平衡，直到流出液与缓冲液的pH一致。
5、加样：停止加入20mmol/L Tris-HCl pH7.3 缓冲液。
待缓冲液液面与胶体表面相切时，恒流泵停止工作。
用胶头滴管缓慢将蔗糖酶蛋白样品溶液（样品Ⅲ）加入层析柱中，注意顺着柱壁滴加，尽可能保持胶面平整。
打开恒流泵，使样品溶液进入胶体，待样品溶液完全进入胶体后，用少量洗脱缓冲液将残余在层析柱壁上端的样品洗下，并完全进入胶体后，再加洗脱缓冲液至一定高度。
6、洗脱：方法1——梯度洗脱法：加样后，用20mmol/L Tris-HCl pH7.3 缓冲液进行平衡，洗脱流速为0.8ml～1ml/min，洗去未被DEAE —Sepharose Fast Flow凝胶吸附的杂蛋白，待层析柱流出液在核酸蛋白检测仪上绘出的基线稳定，用20mmol/L Tris-HCl pH7.3 缓冲液NaCl梯度洗脱（浓度为0-1mol/L NaCl ），层析柱联上梯度混合器，混合器中分别为50ml 0.05mol/L Tris-HCl pH7.3缓冲液和50ml含1mol/L NaCl的0.05ml/L Tris-HCl pH7.3缓冲液。
洗脱流速为0.8～1ml/min，每4ml接一管，洗脱至缓冲溶液流完为止。
跟踪测定各管的蔗糖酶活力，将蔗糖酶活力高的若干管酶液集中，测量总体积（ml数）（样品Ⅳ），并留样用于蔗糖酶蛋白含量测定、蔗糖酶活力测定、SDS-PAGE分析、酶的基本性质实验和用于“用正交法测定几种因素对蔗糖酶活性的影响”（半自主性设计实验），样品－20℃低温保存备用。
方法2、一步洗脱法：上样后，用20mmol/L Tris-HCl pH7.3 缓冲液进行平衡，洗脱流速为0.8ml～1ml/min，洗去DEAE－Sepharose Fast Flow未吸附的杂蛋白，待层析柱流出液在核酸蛋白检测仪上绘出的基线稳定。
用0.15mol/LNaCl 20mmol/L Tris-HCl pH7.3 缓冲液继续洗脱被吸附的蔗糖酶蛋白，洗脱流速为0.8ml～1ml/min，4ml/管/5min，直至待层析柱流出液在核酸蛋白检测仪上绘出的基线稳定。
测定各接收管的蔗糖酶活力，将蔗糖酶活力高的若干管酶液集中，量出总体积（ml数）（样品Ⅳ），并留样用于蔗糖酶蛋白含量测定、蔗糖酶活力测定和SDS-PAGE分析以及用于“用正交法测定几种因素对蔗糖酶活性的影响”（半自主性设计实验），样品－20℃低温保存备用。
7、蔗糖酶活力检测空白对照样品管0.2mol/L乙酸缓冲液，pH=4.5 0.5ml 0.5ml5%蔗糖溶液0.5ml 0.5ml蒸馏水 1.0ml 0.9ml分离纯化样品溶液/ 0.1ml50℃水浴10分钟3,5-二硝基水杨酸 1.0ml 1.0ml100℃水浴5分钟蒸馏水5ml 5ml观察颜色收集活力高的蔗糖酶液，测量总体积(ml数) （样品Ⅳ），-20℃保存备用，用于蔗糖酶蛋白含量测定、蔗糖酶活力测定和SDS-PAGE分析以及用于用正交法测定几种因素对蔗糖酶活性的影响（限定性设计实验）。
六、实验数据记录和处理：七、实验结果与分析：八、讨论、心得：1. 本实验所用的弱碱性阴离子交换剂（DEAE-Sepharose Fast Flow）价格昂贵，实验过程中要注意，不要外撒，不要浪费。
2. 在连接纯化检测仪器时要注意先后顺序，制作层析柱时柱下端的旋钮一定要有膜覆盖，否则在分离纯化的过程中交换剂也会流下来。
3. 在装柱前要先把DEAE—Sephadex搅拌均匀，装柱时要避免DEAE—Sephadex露出缓冲液液面，防止干胶。