酵母蔗糖酶的提取分离纯化及其蛋白质浓度和酶活力测定(126)
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在酸性条件下，蔗糖酶催化蔗糖水解，生成葡萄糖和果糖。
葡萄糖、果糖和碱性铜试剂混合加热后被其氧化，二价铜
被还原成棕红色氧化亚铜沉淀。
氧化亚铜与磷钼酸作用生成蓝色溶液，其蓝色深度与还原
糖的量成正比，于650nm测定光吸收值。
三、试剂
碱性铜试剂
磷钼酸试剂
葡萄糖标准溶液
0.2mol/L蔗糖溶液
0.2mol/L乙酸缓冲液，pH4.9
离心去除酵母菌体而得到蔗糖酶溶液
加热去除热不稳定的杂蛋白
乙醇沉淀获得粗提酶。
三、实验材料、仪器和试剂
实验材料：安琪酵母
仪器和试剂:
研钵，离心管，滴管，量筒，恒温水浴锅，烧杯， 高速冷冻离心机， pH值试纸 二氧化硅，去离子水，冰，食盐，1mol/L乙酸， 95％乙醇.
四、操作步骤
提取
定。
分实验二：蔗糖酶各级分酶活力的测定 一、实验目的
掌握蔗糖酶活力测定方法
二、实验原理
蔗糖酶能催化非还原性双糖(蔗糖)的1,2-
糖苷键裂解，释放出等量的果糖和葡萄糖。每
摩尔蔗糖水解产生两摩尔还原糖，蔗糖的裂解
速率可以通过斐林试剂法测定还原糖的产生数
量来测定。
蔗糖 葡萄糖
果糖
蔗糖酶
+
斐林试剂法测还原糖含量灵敏度较高，其原理是：
分实验三：蔗糖酶各级分的蛋白含量测定 （G-250法）
实验目的 实验原理 仪器 试剂 方法 波长为595nm
1.标准曲线的制作（选用0.5cm比色皿 ）
乙醇沉淀
将粗酶液1转入小烧杯中，放入冰盐浴（碎冰、撒入少量 食盐），逐滴加入等体积-20℃预冷的95%乙醇，同时轻轻搅 拌，共需30min；再在冰盐浴中放置10 min，使沉淀完全。 4℃、 10000 rpm离心10min，弃上清，并滴干，记录为“醇级
分2”，用5mL去离子水溶解后用于蛋白质含量和酶活力的测
每分钟能催化1μmol蔗糖水解所需的酶量
比活力，每mg蔗糖酶所具有的酶活力单位
稀释后酶液的活力(按还原糖计算)： A650nm×0.2×2 E′= A’650nm×10×B
（μmol / min×mL）
式中： A650nm ──第2,3,4管所测A650 A′650nm──第6管所测A650 0.2 ── 第6管葡萄糖取样量 2 ── 标准葡萄糖浓度2mmol/L = 2μmol/ml 10 ──反应10min B ──每管加入酶液mL数 原始酶液的酶活力 E = (E′/2)×稀释倍数
分转入水相中。
（4）平衡，4℃、10000rpm离心10min （5）将上清液倒入量筒，量出体积并记录，转入清洁烧杯中。 （6）用pH试纸检查上清pH值，用1mol/L 乙酸将pH值调至5.0。 （7）将其置于50℃的水浴，经常缓慢搅拌，30min。 （8）于冰浴中迅速冷却，倒入100ml的离心管中，4℃，离心 10分钟。 （9）取上清液，量体积并记录，得粗酶液1，同时预留2.0 ml 测定用。
实验十
酵母蔗糖酶的提取、分离纯化及其 蛋白质浓度和酶活力测定
蔗糖酶催化底物蔗糖分解成葡萄糖和果糖 蔗糖酶在酵母细胞中存在着两种形式 :
存在于细胞膜外细胞壁中的高度糖基化的外蔗糖酶，其活 力占蔗糖酶活力的大部分，是含有50％（质量分数）糖成 分的糖蛋白，该酶是蔗糖酶的主要形式
存在于细胞膜内侧细胞质中的低糖基化的内蔗糖酶。
本实验提取纯化的主要是外蔗糖酶
酵母细胞结构图
酶是生物体内具有催化活性的物质，可据酶蛋 白的结构和性质来选择分离提纯方法和含量测 定。 酶的分离提纯是为了提高纯度（或比活力）及 收率；依据其性质（分子大小、溶解度、电荷、 吸附等）进行分离; 同时用测定酶活力的方法了 解酶的去向、衡量酶提纯的程度和得率。
分子上不同电荷的引力，降低其溶解度，因此
使之发生沉淀反应。如把溶液的pH 值调节到该 蛋白质的等电点时，则沉淀更完善。 在室温条件下，有机溶剂沉淀所得蛋白质往 往已发生变性。 若在低温条件下进行沉淀，则 变性作用进行缓慢。
利用机械法（二氧化硅研磨）破碎酵母细胞壁
采用预冷的去离子水溶解破壁后释放出来的蔗糖酶
蛋白质的沉淀
蛋白质从溶液中以固体状态析出的现象
作用机Hale Waihona Puke Baidu主要是破坏了蛋白质水化膜或蛋白 质所带的电荷
主要沉淀方法：
盐沉淀蛋白质——盐析
重金属盐沉淀蛋白质 某些酸类沉淀蛋白质 有机溶剂沉淀蛋白质
乙醇、甲醇、丙酮等有机溶剂可破坏蛋白质
的水化层，使蛋白质的溶解度下降；另一方面
有机溶剂能降低溶液的介电常数，增加蛋白质
本实验由四个分实验组成：
蔗糖酶的提取与初步纯化 蔗糖酶各级分酶蛋白质浓度的测定 蔗糖酶各级分酶活力的测定 离子交换柱层析纯化蔗糖酶
分实验一：蔗糖酶的提取与初步纯化
一、实验目的
学习蔗糖酶分离提取的原理
学习掌握细胞破壁、有机溶剂沉淀蛋白质的原理
与操作
二、实验原理 细胞破碎的方法
高压匀浆破碎法（homogenization） 机械法 振荡珠击破碎法 (Skaking Bead)
四、仪器
试管、试管架、移液管、分光光度计、
比色杯、水浴锅等
五、酶活力测定的步骤
1.粗酶液1 ，醇级分2 酶活力测定
（1）首先用去离子水稀释粗酶液1： 2000倍， 醇级分2： 5000、10000倍，（可取0.1mL加入
25ml刻度试管，定容25mL，即稀释250倍）
(波长：650nm)
一个酶活力单位Units定义为在给定的实验条件下，
（1）准备冰浴，将研钵稳妥放入冰浴中 （2）称取3g干酵母粉和5g 二氧化硅(石英砂)，放入研钵中 （3）用量筒量取30mL预冷的去离子水，先加5ml左右研磨 （若不够每次用滴管再加2mL左右水）， 边加边研磨成糊状 （至少用30 min），然后转移到100mL离心管中,最后用剩余 的水洗净研钵中的物质并转移到离心管中，以便将蔗糖酶充
高速搅拌珠研磨破碎法（fine grinding）
超声波破碎法（ultrasonication） 渗透压冲击破碎法（osmotic shock） 冻融破碎法（freezing and thawing）
非机械法
酶溶破碎法（enzyme lysis） 化学破碎法（chemical treatment）
去垢剂破碎法（detergents）
葡萄糖、果糖和碱性铜试剂混合加热后被其氧化，二价铜
被还原成棕红色氧化亚铜沉淀。
氧化亚铜与磷钼酸作用生成蓝色溶液，其蓝色深度与还原
糖的量成正比，于650nm测定光吸收值。
三、试剂
碱性铜试剂
磷钼酸试剂
葡萄糖标准溶液
0.2mol/L蔗糖溶液
0.2mol/L乙酸缓冲液，pH4.9
离心去除酵母菌体而得到蔗糖酶溶液
加热去除热不稳定的杂蛋白
乙醇沉淀获得粗提酶。
三、实验材料、仪器和试剂
实验材料：安琪酵母
仪器和试剂:
研钵，离心管，滴管，量筒，恒温水浴锅，烧杯， 高速冷冻离心机， pH值试纸 二氧化硅，去离子水，冰，食盐，1mol/L乙酸， 95％乙醇.
四、操作步骤
提取
定。
分实验二：蔗糖酶各级分酶活力的测定 一、实验目的
掌握蔗糖酶活力测定方法
二、实验原理
蔗糖酶能催化非还原性双糖(蔗糖)的1,2-
糖苷键裂解，释放出等量的果糖和葡萄糖。每
摩尔蔗糖水解产生两摩尔还原糖，蔗糖的裂解
速率可以通过斐林试剂法测定还原糖的产生数
量来测定。
蔗糖 葡萄糖
果糖
蔗糖酶
+
斐林试剂法测还原糖含量灵敏度较高，其原理是：
分实验三：蔗糖酶各级分的蛋白含量测定 （G-250法）
实验目的 实验原理 仪器 试剂 方法 波长为595nm
1.标准曲线的制作（选用0.5cm比色皿 ）
乙醇沉淀
将粗酶液1转入小烧杯中，放入冰盐浴（碎冰、撒入少量 食盐），逐滴加入等体积-20℃预冷的95%乙醇，同时轻轻搅 拌，共需30min；再在冰盐浴中放置10 min，使沉淀完全。 4℃、 10000 rpm离心10min，弃上清，并滴干，记录为“醇级
分2”，用5mL去离子水溶解后用于蛋白质含量和酶活力的测
每分钟能催化1μmol蔗糖水解所需的酶量
比活力，每mg蔗糖酶所具有的酶活力单位
稀释后酶液的活力(按还原糖计算)： A650nm×0.2×2 E′= A’650nm×10×B
（μmol / min×mL）
式中： A650nm ──第2,3,4管所测A650 A′650nm──第6管所测A650 0.2 ── 第6管葡萄糖取样量 2 ── 标准葡萄糖浓度2mmol/L = 2μmol/ml 10 ──反应10min B ──每管加入酶液mL数 原始酶液的酶活力 E = (E′/2)×稀释倍数
分转入水相中。
（4）平衡，4℃、10000rpm离心10min （5）将上清液倒入量筒，量出体积并记录，转入清洁烧杯中。 （6）用pH试纸检查上清pH值，用1mol/L 乙酸将pH值调至5.0。 （7）将其置于50℃的水浴，经常缓慢搅拌，30min。 （8）于冰浴中迅速冷却，倒入100ml的离心管中，4℃，离心 10分钟。 （9）取上清液，量体积并记录，得粗酶液1，同时预留2.0 ml 测定用。
实验十
酵母蔗糖酶的提取、分离纯化及其 蛋白质浓度和酶活力测定
蔗糖酶催化底物蔗糖分解成葡萄糖和果糖 蔗糖酶在酵母细胞中存在着两种形式 :
存在于细胞膜外细胞壁中的高度糖基化的外蔗糖酶，其活 力占蔗糖酶活力的大部分，是含有50％（质量分数）糖成 分的糖蛋白，该酶是蔗糖酶的主要形式
存在于细胞膜内侧细胞质中的低糖基化的内蔗糖酶。
本实验提取纯化的主要是外蔗糖酶
酵母细胞结构图
酶是生物体内具有催化活性的物质，可据酶蛋 白的结构和性质来选择分离提纯方法和含量测 定。 酶的分离提纯是为了提高纯度（或比活力）及 收率；依据其性质（分子大小、溶解度、电荷、 吸附等）进行分离; 同时用测定酶活力的方法了 解酶的去向、衡量酶提纯的程度和得率。
分子上不同电荷的引力，降低其溶解度，因此
使之发生沉淀反应。如把溶液的pH 值调节到该 蛋白质的等电点时，则沉淀更完善。 在室温条件下，有机溶剂沉淀所得蛋白质往 往已发生变性。 若在低温条件下进行沉淀，则 变性作用进行缓慢。
利用机械法（二氧化硅研磨）破碎酵母细胞壁
采用预冷的去离子水溶解破壁后释放出来的蔗糖酶
蛋白质的沉淀
蛋白质从溶液中以固体状态析出的现象
作用机Hale Waihona Puke Baidu主要是破坏了蛋白质水化膜或蛋白 质所带的电荷
主要沉淀方法：
盐沉淀蛋白质——盐析
重金属盐沉淀蛋白质 某些酸类沉淀蛋白质 有机溶剂沉淀蛋白质
乙醇、甲醇、丙酮等有机溶剂可破坏蛋白质
的水化层，使蛋白质的溶解度下降；另一方面
有机溶剂能降低溶液的介电常数，增加蛋白质
本实验由四个分实验组成：
蔗糖酶的提取与初步纯化 蔗糖酶各级分酶蛋白质浓度的测定 蔗糖酶各级分酶活力的测定 离子交换柱层析纯化蔗糖酶
分实验一：蔗糖酶的提取与初步纯化
一、实验目的
学习蔗糖酶分离提取的原理
学习掌握细胞破壁、有机溶剂沉淀蛋白质的原理
与操作
二、实验原理 细胞破碎的方法
高压匀浆破碎法（homogenization） 机械法 振荡珠击破碎法 (Skaking Bead)
四、仪器
试管、试管架、移液管、分光光度计、
比色杯、水浴锅等
五、酶活力测定的步骤
1.粗酶液1 ，醇级分2 酶活力测定
（1）首先用去离子水稀释粗酶液1： 2000倍， 醇级分2： 5000、10000倍，（可取0.1mL加入
25ml刻度试管，定容25mL，即稀释250倍）
(波长：650nm)
一个酶活力单位Units定义为在给定的实验条件下，
（1）准备冰浴，将研钵稳妥放入冰浴中 （2）称取3g干酵母粉和5g 二氧化硅(石英砂)，放入研钵中 （3）用量筒量取30mL预冷的去离子水，先加5ml左右研磨 （若不够每次用滴管再加2mL左右水）， 边加边研磨成糊状 （至少用30 min），然后转移到100mL离心管中,最后用剩余 的水洗净研钵中的物质并转移到离心管中，以便将蔗糖酶充
高速搅拌珠研磨破碎法（fine grinding）
超声波破碎法（ultrasonication） 渗透压冲击破碎法（osmotic shock） 冻融破碎法（freezing and thawing）
非机械法
酶溶破碎法（enzyme lysis） 化学破碎法（chemical treatment）
去垢剂破碎法（detergents）