蔗糖酶的分离提纯讲解
酵母蔗糖酶的分离、纯化及酶动力学分析 -1
安徽农业大学 生命科学学院 2017年11月
自溶
蔗 糖 酶 分 离 纯 化
抽提 1.监测蔗糖酶活性变化 --DNS试剂法 乙醇分级 2.监测蛋白浓度变化 --考马斯亮蓝G250染色法 透析 脱盐
纯度和产量 计算
蔗糖酶 动力学 分析
米氏常数Km的测定 pH对酶活性的影响
9.7
7.37
3.53
3.操作步骤
自行设计实验方案！！！！
以反应pH为横坐标，绘制pH～酶活性曲线，并分析本实 验条件下该酶的最适pH范围。
实验报告的要求
一、实验报告组成 1.实验目的 2.实验原理 3.实验步骤 4.注意事项 5.实验结果、分析与讨论
（1）交代清楚所有数据来源，所有数据的计算过程，注意图 表的绘制，等。 （2）针对图表针对性的进行分析。
加水mL数
9
8
7
6
3.操作步骤
管号 蔗糖终浓度 [S]mmol/L 1/[S] V 1/V [S]/V
1
2
3
4
用二种方法作图： （1）倒数作图法：1/V为纵坐标，1/[S]为横坐标，由直线在横轴上的交点为 －1/Km，计算得Km； （2）[S]/V对[S]作图，以[S]/V为纵坐标，以[S]为横坐标，由直线在横轴上的 交点为-Km。
分离、纯化操作步骤
4.纯度和产量
提纯的目的，不仅在于得到一定量的酶,而且要求得到不会或尽量少含其他 杂蛋白的酶制品。在纯化过程中，除了要测定一定体积或一定重量的酶制剂中 含有多少活力单位外，还需要测定酶制剂的纯度。酶的纯度用比活力表示。
酵母蔗糖酶分离纯化效果计算
留样 体积 /mL 蛋白质浓度 （mg/mL） 总蛋白 活力 总活力 比活力 （mg） （U/mL） （U） （U/mg） 纯化 倍数 产量 （回收率）
蔗糖酶的分离提取及活力测定
6 2.4
1.2
0.8
3.0
7 2.8
1.4
0.6
3.0
3、蔗糖酶的活力测定：
①.蔗糖酶活力的规定：在本实验条件下，每3min释 放1mg还原糖所需的酶量定义为一个酶活力单位。 ②.操作： 取两支试管分别加入
液适当稀释过的酶液2ml，一支中加入0.5ml 1mol/L的 NaOH，摇匀，使酶失活（做对照），另一支做测定管； 把两支试管和5%的蔗糖溶液都放在35℃水浴中预热恒 温；上述两试管中分别加入2ml 5%的蔗糖液，并准
我们用的菌体（微生物）细胞破壁方法是：自 溶法，即将菌体放在适当的pH值和温度下，利用 组织细胞自身的酶系将细胞壁破坏，使细胞内的 物质释放出来。
自溶时需加少量防腐剂，以防外界细菌污染。
自溶法的缺点是时间较长。
2）抽提：
抽提（或叫萃取）是将已破碎细胞壁的材料 置于一定的条件及溶剂中，使被提取物释放出来 的过程。
一、目的要求
1.学习掌握3，5-二硝基水杨酸比色定糖 的原理和方法； 2.学习酶蛋白分离提取的原理； 3.学习掌握细胞破壁及抽提技术； 4.学习掌握酶活力测定及其计算的方法。
二、实验原理
1、3，5-二硝基水杨酸比色定糖的原理
强碱性溶液中
1）DNS试剂+ D-葡萄糖 沸水浴中 氨基化合物
氨基化合物
（还原糖）
沸（水棕浴红中色）
3）在一定范围内，还原糖的量与反应液的颜色强度成一
定比例关系，所以可用DNS比色法测定还原糖的含量。
4）在一定条件下，蔗糖酶催化反应产生D-葡萄糖的量一
定。所以，可用DNS比色定糖法测定蔗糖酶的活力。
3、蔗糖酶分离提取的原理
1）细胞破壁：就酶在生物体内的分布，可分为 胞内酶和胞外酶，蔗糖酶系胞内酶。提取胞内酶 时，要破碎组织和细胞，然后用一定的溶液提取， 得到的材料称为无细胞抽提液。材料不同，破壁 的方法也不同。
实验六酵母蔗糖酶的提取及纯化
实验六酵母蔗糖酶的提取及纯化实验六酵母蔗糖酶的提取及纯化原理蔗糖酶（invertase ）（β—D —呋喃果糖苷果糖⽔解酶）（fructofuranoside fructohydrolase ）（EC.3.2.1.26）特异地催化⾮还原糖中的α—呋喃果糖苷键⽔解，具有相对专⼀性。
不仅能催化蔗糖⽔解⽣成葡萄糖和果糖，也能催化棉⼦糖⽔解，⽣成密⼆糖和果糖。
每⽔解1mol 蔗糖，就⽣成2mol 还原糖。
还原糖的测定有多种⽅法，本实验采⽤Nelson ⽐⾊法测定还原糖量，由此可得知蔗糖⽔解的速度。
在研究酶的性质、作⽤、反应动⼒学等问题时都需要使⽤⾼度纯化的酶制剂以避免⼲扰。
酶的提纯⼯作往往要求多种分离⽅法交替应⽤，才能得到较为满⾜的效果。
常⽤的提纯⽅法有盐析、有机溶剂沉淀、选择性变性、离⼦交换层析、凝胶过滤、亲和层析等。
酶蛋⽩在分离提纯过程中易变性失活，为能获得尽可能⾼的产率和纯度，在提纯操作中要始终注意保持酶的活性如在低温下操作等，这样才能收到较好的分离效果。
啤酒酵母中，蔗糖酶含量丰富。
本实验⽤新鲜啤酒酵母为原料，通过破碎细胞，热处理，⼄醇沉淀，柱层析等步骤提取蔗糖酶，并对其性质进⾏测定。
⼀、蔗糖酶的提取与部分纯化（⼀）实验⽬的学习酶的提取和纯化⽅法，掌握各步骤的实验原理，并为后续实验提供⼀定量的蔗糖酶。
（⼆）实验原理（略）（三）实验仪器、材料及试剂仪器1. ⾼速冷冻离⼼机、恒温⽔浴箱、－20℃冰箱2. 电⼦天平、研钵（＞200ml ）、制冰机、50ml 烧杯3. 离⼼管（2ml ，10ml ，30ml 或50ml ）、移液器（1000ul ）或滴管、量筒材料及试剂1. 市售鲜啤酒酵母（低温保存）2. ⽯英砂（海沙）、甲苯（使⽤前预冷到0℃以下）3. 95%⼄醇（预冷－20℃）、去离⼦⽔（使⽤前冷⾄4℃左右）4. Tris-HCl （pH7.3）缓冲液（四）操作步骤 1. 提取＋ H 2O 蔗糖酶O HH O（1）将市售鲜啤酒酵母2000 rpm，离⼼10 min，除去⼤量⽔分。
实验操作指导书：蔗糖酶的提取与部分纯化
（一）蔗糖酶的提取与部分纯化一、实验目的：学习酶的纯化方法，并为动力学实验提供一定量的蔗糖酶。
二、试剂：1. 啤酒酵母2. 二氧化硅3. 甲苯（使用前预冷到0℃以下）4. 去离子水（使用前冷至4℃左右）5. 冰块、食盐6. 1N乙酸7. 95%乙醇三、仪器：1. 研钵1个2. 离心管3个3. 滴管3个4. 量筒50ml 1个5. 水浴锅1个6. 恒温水浴7. 烧杯100ml 2个8. 广泛pH试纸9. 高速冷冻离心机四、操作步骤：1. 提取（1）准备一个冰浴，将研钵稳妥放入冰浴中。
（2）称取5g干啤酒酵母和20g湿啤酒酵母，称20mg蜗牛酶及适量（约10g）二氧化硅，放入研钵中。
二氧化硅要予先研细。
（3）量取预冷的甲苯30ml缓慢加入酵母中，边加边研磨成糊状，约需60分钟。
研磨时用显微镜检查研磨的效果，至酵母细胞大部分研碎。
（4）缓慢加入预冷的40ml去离子水，每次加2ml左右，边加边研磨，至少用30分钟。
以便将蔗糖酶充分转入水相。
（5）将混合物转入两个离心管中，平衡后，用高速冷离心机离心，4℃，10000rpm，10min。
如果中间白色的脂肪层厚，说明研磨效果良好。
用滴管吸出上层有机相。
（6）用滴管小心地取出脂肪层下面的水相，转入另一个清洁的离心管中，4℃，10000rpm，离心10min。
（7）将清液转入量筒，量出体积，留出1.5ml测定酶活力及蛋白含量。
剩余部分转入清洁离心管中。
（8）用广泛pH试纸检查清液pH，用1N乙酸将pH调至5.0，称为“粗级分I”。
2. 热处理（1）予先将恒温水浴调到50℃，将盛有粗级分I的离心管稳妥地放入水浴中，50℃下保温30分钟，在保温过程中不断轻摇离心管。
（2）取出离心管，于冰浴中迅速冷却，用4℃，10000rpm，离心10min。
（3）将上清液转入量筒，量出体积，留出1.5ml测定酶活力及蛋白质含量（称为“热级分II”）。
3. 乙醇沉淀将热级分II转入小烧杯中，放入冰盐浴（没有水的碎冰撒入少量食盐），逐滴加入等体积预冷至－20℃的95%乙醇，同时轻轻搅拌，共需30分钟，再在冰盐浴中放置10分钟，以沉淀完全。
蔗糖酶的提取和纯化步骤
色1小时。
10. 脱色：回收染色液，凝胶板先用水漂洗数次，再用脱色液脱色，直 到蛋白质区带清晰。确定目的蛋白条带位置，估算分子量，比较不
同纯化过程对杂蛋白去除状况。
※剥胶时要小心，保持胶完好无损，染色要充分。
低分子量标准蛋白试剂盒:
•
低分子量标准蛋白： 兔磷酸化酶B 牛血清白蛋白
MW=97,400 MW=66,200
②以1号管为参比调零，记录光密度值A650，以标准液的浓度为横坐 标， A650值为纵坐标，画出工作曲线。
蛋白含量测定的计算
Pr (mg/ml)=
A650值对应的µ g数(Pr)×10-3 ×稀释倍数 Pr溶液的ml数
BSA标准液 250 µ g/ml
SDS-PAGE电泳实验过程
1. 准备玻璃板：将玻璃板用蒸馏水洗净晾干(实验室前后的空调
蔗糖酶米氏常数的测定操作方法
1）将离子交换柱层析得的E3稀释(pH4.6 HAC缓冲液)至20U/mL，共16ml。 2）取试管8支，按0--7编号，0为对照管。 3）按表 1将蔗糖液、醋酸缓冲液分别加入试管中，于35℃水浴中保温（使 温度平衡，以下同）10min。
4）取约16ml酶液，放入同一水浴中保温约10min。
Buffer
10%SDS 10%Ap TEMED
6、样品预处理：
低分子量蛋白Mark,E1,E2,E3,E4,牛血清白蛋 白。 （1）低分子量蛋白Mark、牛血清白蛋白和E4的样品 由实验室提供。
（2）E1,E2,E3,E4分别取20µ l，再加入20µ l 2倍 (2X)样品缓冲液，在沸水中煮3分钟(本次实验1个 E3、E4-1和E4-2由实验室提供)，点动离心除沉淀。
线的时候，将电流改为20mA （如果同时电泳两块胶，电流恒定在
蔗糖酶的提取、分离、纯化及活性检测
蔗糖酶的提取、分离、纯化及活性检测摘要随着分子生物学的发展，不论对酶分子本身作用机制的研究还是其他研究，越来越需要纯度更高的酶制剂，这就要求我们熟悉酶提纯的一般操作步骤及酶的提纯及活力测定等重要的生物实验技术。
本次实验主要通过提取啤酒酵母中的蔗糖酶并经过两次纯化测定其活力与Km。
在实验过程中用乙醇分级分离法，DEAE-Cellulose柱层析，分子筛（凝胶过滤）层析提取纯化蔗糖酶。
在实验过程中，虽然我们很努力,但由于我们对实验的程序不熟悉，因此在实验的一些过程中有一些明显的操作失误，使得实验的最后测定结果与理论值有一定出入。
关键词啤酒酵母蔗糖酶乙醇分级分离 DEAE-Cellulose柱层析分子筛层析Km前言生物体内所发生的一切化学反应，几乎都是在专一性酶的催化下进行的，因此酶的研究对了解生命活动的规律以及生命本质的阐述具有十分重要的意义。
随着分子生物学的发展，不论对酶分子本身作用机制的研究以及分子生物学其他重要课题的研究都越来越多地需要使用作用专一，纯度高的酶制剂。
这就要求人们建立各种方法，以便从各种生物来源的材料中分离提纯酶。
由于酶本身也是蛋白质，因此酶分离提存的方法大体上与蛋白质纯化方法相同，一般来说，没有一种固定的方法，而往往根据实验者所要分离提纯酶的取材以及酶本身的物理﹑化学及生物学性质来确定分离提纯方法。
各种酶的纯化通常有五个阶段：①材料的选择与预处理；②细胞破碎；③抽提；④纯化；⑤浓缩﹑干燥及保存。
酶分离纯化成功与否的重要标志：一是要有较高的收率；二是达到所要求的纯度，这两个指标通常是矛盾的，可根据需要来有所侧重，一般来说，好的方法与步骤应该是简单易行，最终的酶制剂有较高的收率和纯度。
就单独的每种分离提纯的方法而言，有盐析法、有机溶剂分级法、调PH分级沉淀法、选择变性法、吸附法、层析法（纸层析、薄板层析、柱层析等）。
其中盐析法是用于蛋白质和酶分离提纯的最早而且最广泛的一种方法，该方法是根据蛋白质和酶在一定浓度的溶液中溶解度的降低程度的不同而达到彼此分离的方法盐析法常用的中性盐有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等，其中用得最多的是硫酸铵，因为它具有温度系数小而溶解度大的优点。
蔗糖酶的提取过程的原理
蔗糖酶的提取过程的原理蔗糖酶是一种重要的酶类物质，其作用是分解蔗糖，将其转化为葡萄糖和果糖等单糖。
蔗糖酶现已被广泛应用于工业和食品加工等领域，因此对于蔗糖酶的提取过程和原理的研究十分重要。
蔗糖酶的提取原理：蔗糖酶主要是存在于细胞内的酶类物质，在提取过程中需要破碎细胞壁、细胞膜等障碍物，使酶类物质释放出来。
因此，蔗糖酶的提取过程可步骤分为细胞破碎、酶的提取、分离纯化等环节。
细胞破碎细胞破碎是蔗糖酶提取的第一步，其目的是将细胞壁、细胞膜等保护层破碎，以便获得高含量的酶液。
细胞破碎主要有三种方法：物理方法、生物方法、化学方法。
物理方法：包括高压破碎法、超声波破碎法、微波破碎法等技术，其中高压破碎法是最为常用的破碎方法，可通过高压融合，将含有酶的细胞破裂。
生物方法：是利用生物体内酶的辅助作用，通过胰蛋白酶等酶的介入，使细胞膜被破坏，从而释放出酶来。
化学方法：通过化学物质对生物组织进行不同程度的破坏，使细胞膜等基本单位出现裂缝，酶液就可以自由地流出。
酶的提取酶的提取是蔗糖酶提取过程的第二步，其目的是从破碎的细胞内提取蔗糖酶。
酶的提取常用的方法有：水解法、溶剂法、膜过滤法等技术。
水解法：是指通过水解反应从生物物质中分离有用成分的方法。
例如，将蔗糖酶浸泡在50温水中，持续2小时左右，使蔗糖酶转化成有利于提取的热变性酶。
溶剂法：即将蔗糖酶和溶剂混合，应用分离纯化技术获得有用的酶液。
溶剂法有界面法、反相分配法、油相萃取法、溶液萃取法等。
膜过滤法：是利用一定的压力，将蔗糖酶溶液通过一定孔径大小的膜片，将酶体分离纯化出来。
分离纯化分离和纯化是蔗糖酶提取过程中的最后一步，其目的是获得高纯度和高活性的酶液。
常用的分离和纯化技术有：离子交换层析法、凝胶过滤层析法、亲和色谱法等。
其，默认是将酶液溶液经某些方法处理后，将酶从其他的杂质中过滤出来，其中离子交换层析法是最为常用的手段。
在这种方法下，蔗糖酶分子通过吸附原理与活性生物载体进行相互作用，去除杂质，实现酶活性的提高和纯度的提高。
蔗糖酶的分离提纯
蔗糖酶的分离提纯【实验目的】1．了解蔗糖酶分离提纯的方法。
2．掌握离心技术、电泳技术、层析技术、膜分离技术和分光光度法。
【实验原理】蔗糖酶[Ec 3．2．1．26]习惯命名β--D--Fructofuranosidase 系统命名：β--D —Fructofuranosideffructonydrolase 。
蔗糖酶是一种水解酶，能使蔗糖水解为果糖和葡萄糖。
它所催化的反应是：H OH OH H蔗糖+H OH OH H 葡萄糖 果糖蔗糖酶的分布相当广，在微生物、植物及动物中都有它的存在。
在微生物中，酵母中的含量很丰富。
在研究中用的最多的是面包酵母和啤酒酵母。
研究表明采用菌体自溶法破碎酵母细胞，采用乙醇分级和DEAE--纤维素柱层析两步分离提纯步骤，就可制备纯度较高的蔗糖酶制剂，而且收率也较好。
从酵母中制备蔗糖酶，材料来源十分方便，而且以自己提纯的酶制剂进行蔗糖酶的性质、动力学研究也十分方便。
【实验材料、仪器和试剂】 1．实验材料和试剂(1)0．2％葡萄糖标准液；(2)3，5-二硝基水杨酸试剂；(3)新鲜啤酒酵母； (4)甲苯；(5)乙酸钠；(6)稀乙酸溶液；(7)95％乙醇；(8)DEAE--纤维素；(9)0.5mol ／L NaOH ；(10)0.5mol ／L HCl ；(11)0.005mol ／L ，pH6.0的磷酸钠缓冲液；(12)含O.15mol ／L NaCl 的O.005mol ／L ，pH6.0的磷酸钠缓冲液；CH 2OHH OHHHOHCH 20H(13)5％蔗糖；(14)测定蛋白质浓度试剂；(15)聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂2．仪器(1)恒温水浴；(2)烧杯、量筒、移液管、容量瓶、玻棒；(3)冰盐浴；(4)离心机；(5)721型分光光度计；(6)柱层析装置；(7)天平；(8)pH计；(9)滴管、试管和血糖管；(10)秒表【方法】一、葡萄糖浓度标准曲线的制作1．取10支血糖管，按下表加入0．2％葡萄糖溶液、水及3，5一二硝基水杨上述试剂混匀后，在沸水浴中加热5min，取出立即冷却，以蒸馏水稀释至25mL，摇匀，于540nm测光密度。
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蔗糖酶的分离提纯【实验目的】1．了解蔗糖酶分离提纯的方法。
2．掌握离心技术、电泳技术、层析技术、膜分离技术和分光光度法。
【实验原理】蔗糖酶[Ec 3．2．1．26]习惯命名β--D--Fructofuranosidase 系统命名：β--D —Fructofuranosideffructonydrolase 。
蔗糖酶是一种水解酶，能使蔗糖水解为果糖和葡萄糖。
它所催化的反应是：H OH OH H蔗糖+H OH OH H 葡萄糖 果糖蔗糖酶的分布相当广，在微生物、植物及动物中都有它的存在。
在微生物中，酵母中的含量很丰富。
在研究中用的最多的是面包酵母和啤酒酵母。
研究表明采用菌体自溶法破碎酵母细胞，采用乙醇分级和DEAE--纤维素柱层析两步分离提纯步骤，就可制备纯度较高的蔗糖酶制剂，而且收率也较好。
从酵母中制备蔗糖酶，材料来源十分方便，而且以自己提纯的酶制剂进行蔗糖酶的性质、动力学研究也十分方便。
【实验材料、仪器和试剂】 1．实验材料和试剂(1)0．2％葡萄糖标准液；(2)3，5-二硝基水杨酸试剂；(3)新鲜啤酒酵母； (4)甲苯；(5)乙酸钠；(6)稀乙酸溶液；(7)95％乙醇；(8)DEAE--纤维素；(9)0.5mol ／L NaOH ；(10)0.5mol ／L HCl ；(11)0.005mol ／L ，pH6.0的磷酸钠缓冲液；(12)含O.15mol ／L NaCl 的O.005mol ／L ，pH6.0的磷酸钠缓冲液；CH 2OHH OHHHOHCH 20H(13)5％蔗糖；(14)测定蛋白质浓度试剂；(15)聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂2．仪器(1)恒温水浴；(2)烧杯、量筒、移液管、容量瓶、玻棒；(3)冰盐浴；(4)离心机；(5)721型分光光度计；(6)柱层析装置；(7)天平；(8)pH计；(9)滴管、试管和血糖管；(10)秒表【方法】一、葡萄糖浓度标准曲线的制作1．取10支血糖管，按下表加入0．2％葡萄糖溶液、水及3，5一二硝基水杨上述试剂混匀后，在沸水浴中加热5min，取出立即冷却，以蒸馏水稀释至25mL，摇匀，于540nm测光密度。
2．以葡萄糖含量(mg)为横坐标，以光密度值为纵坐标绘制标准曲线。
二、蔗糖酶的分离提纯1．蔗糖酶粗品的制备(1)自溶称取10克干酵母，放在200mL的烧杯中，加30mL蒸馏水搅成糊状，再加入1.5克乙酸钠。
然后在35℃水浴中搅拌30min，此时会观察到菌体自溶的现象。
(2)提取及粗酶的制备往上述自溶液中加60mL蒸馏水，将烧杯用表面皿或玻璃纸盖好，于35℃保温过夜。
第二天，将自溶液于4500r／min离心20min。
取出离心管，小心将上清液倒入烧杯中，弃沉淀。
得到的上清液就是无细胞抽提液，即粗酶液（E1）。
量出粗酶液体积，记录。
取2mL作为待测活力和蛋白浓度的样品（4℃保存）。
2．乙醇分级将粗酶液用稀醋酸调pH至4.5。
(1)32％乙醇饱和度按下面的公式算出使粗酶液的乙醇浓度达32％时所需乙醇体积。
X 1/（V+X1）=O.32式中X1为所需乙醇体积，V为粗酶液的体积。
然后再按X1／0.95换算出使乙醇浓度(按体积)达32％时所需95％乙醇的体积。
把粗酶液和量好体积的95％乙醇在冰盐浴中预冷(0～2℃)。
小心缓慢滴加乙醇，同时不断搅拌，一定注意不要使乙醇局部过浓，否则会引起酶变性失活。
在滴加乙醇过程中，酶液渐渐变混浊，滴加结束后，于3000r／min离心5min。
上清转移到另一烧杯中待用，弃去沉淀。
(2)47.5％的乙醇饱和度按下式算出使酶液乙醇浓度达47．5％时所需乙醇的量X2/(V+X2)=0.475式中X2为所需乙醇体积，V为粗酶体积。
再按X2／0.95算出需95％乙醇的体积。
按下式可算出使乙醇浓度达47．5％时所需补加的95％乙醇体积。
X2/0.95- X1/0.95=使乙醇浓度达47．5％时需补加的95％乙醇体积按前述方法，继续补加乙醇，使乙醇浓度达47.5％于3000r／min离心3min，弃去上清会得少量沉淀。
将沉淀用10mL pH6.0的0.005mol／L磷酸钠缓冲液溶解，并对该液透析过夜或酌情缩短时间，中间换一次透析液。
离心，则得到进一步纯化的酶。
量出酶液体积，取出2mL，待测活力和蛋白浓度。
其他酶液准备上柱。
3．DEAE一纤维素柱层析(1)DEAE一纤维素处理在使用前，将市售的DEAE一纤维素按下述方法处理：用去离子水浸泡过夜，用浮选法除去过细部分，留下30min沉积部分，重复几次。
然后用0.5mol／L NaOH，水，0.5mol／L HCl，水，0.5mol／L NaOH，水，交替浸泡。
其中NaOH 浸泡2～4小时，HCl浸泡半小时，每次抽滤后用水洗至中性。
最后用0.005mol ／L，pH6．0的磷酸钠起始缓冲液平衡。
再生方法：用过的DEAE一纤维素可再生重复使用。
但要先用0.5mol／L NaOH+0.5mol／LNaCl浸泡后再按常规处理。
DEAE一纤维素离子型。
水：R--N(CH3)2+H20==eR—N+(CH3)2H·OH-HCI：R—N+(CH3)2HOH-+HCl=R—N+(CH3)2HCl-+H2NaOH：R—N+(CH3)2H·Cl-+NaOH=R—N+(CH3)2H·OH-+Na+(2)装柱本实验使用的层析柱规格为1．8cm(内径)×15cm(高)。
把柱子垂直固定好，可用一千锤校正，按柱层析原理部分所述方法，把DEAE 一纤维素装柱。
床高距柱顶2～3cm为宜。
用起始缓冲液洗柱，平衡过夜。
注意控制流速，防止柱流干。
(3)上样乙醇分级的酶液，经对起始缓冲液透析，离心后，按层析原理部分所述方法上样。
（注意：流速要尽量慢，使目的酶和DE52充分吸附）样品上完后，用起始缓冲液(130mL)洗柱。
流出液流出速度为4mL／5min左右。
(4)洗脱用含0.15mol／L NaCl的0.005mol／L pH6.0的磷酸钠缓冲液洗脱。
洗脱速度4mL／5min。
收集20管即可结束。
(3～4mL／管)。
每隔一管测定活力，确定酶活力峰位置，合并，量出体积。
测合并后制剂的活力和蛋白浓度。
三、蔗糖酶的活力及蛋白浓度测定1．蔗糖酶活力规定在本实验的条件下，每3min释放lmg还原糖所需的酶量定义为一个活力单位。
2．操作(1)样品的稀释取0.2mL无细胞抽提液(E1)用pH4.6，0.2mol／L NaAc缓冲液稀释40倍；取0.2mL乙醇分级酶液(E2)用上述缓冲液稀释80倍；DEAE--纤维素柱层析酶液(E3)根据情况稀释。
(2)反应取两支试管分别加入2mL稀释的酶液。
一支做对照，加0.5mL 1moL／L NaOH，摇匀，使酶失活；另一支做测定管。
然后把两支试管和5％的蔗糖溶液放在35~C 水浴中预热恒温。
分别取2mL 5％的蔗糖加入上述两试管中，并正确计算时间，3min于测定管中加入0.5mL1mol／L NaOH，摇匀，终止反应。
从反应混合物中取出0.5mL溶液放入血糖管中，加入3mL 3，5一二硝基水杨酸试剂和1.5mL水，摇匀。
于沸水浴中煮沸5min后立即用冷水冷却，加蒸馏水稀释到25mL刻度，摇匀，于540nm测光密度。
在葡萄糖标准曲线上找到所测光密度对应的葡萄糖含量，然后按下面活力计算公式计算酶活力。
3．酶活力计算公式蔗糖酶活力单位：葡萄糖毫克数×9×酶的稀释倍数式中9=4.5/0.5，因酶反应液的总体积是4.5mL，而用3，5一二硝基水杨酸试剂显色时仅取0.5mL。
4．蛋白浓度测定E1稀释20倍；E2稀释4倍；E3不稀释。
Bradford法测蛋白浓度(见附注1)四、酶纯度鉴定聚丙烯酰胺凝胶电泳法鉴定E1、E2和E3的纯度。
【结果的处理】附实验1Bradford法测定蛋白质含量【实验目的】掌握考马斯亮蓝G250法测定蛋白质含量的原理和方法。
【实验原理】在蛋白质的分离、纯化过程中，往往需要有一种快速、灵敏的方法对蛋白质进行定量测定。
近年来被广为采用的Bradford法满足了人们的需要。
本方法采用考马斯亮蓝G250(Coomassilebrilliant blue，G250，简称CBB—G250)作为染色物质。
依其存在形式不同可表现为红色和蓝色，当CBB—G250单独存在时为红色；当其与蛋白质结合后，其颜色变为蓝色。
蓝色的深浅与溶液中的蛋白质含量(0～1000µg/mL)成正比，故可用于测定蛋白质含量。
该方法快速、重复性好、干扰因素少，CBB—G250在2分钟内即可完全与蛋白结合，并在l小时内保持稳定，该反应几乎不受钠、钾等阳离子干扰，更不受蔗糖等碳水化合物的于扰。
但较高浓度的十二烷基硫酸钠，Triton x一100等对其有干扰，此影响可通过选择适当的对照来消除。
【实验仪器与试剂】1．仪器(1)台称(2)721分光光度计(3)容量瓶(4)刻度试管和吸量管2．试剂(1)考马斯亮蓝G250溶液：称取CBB-一G250 lOOmg溶于50mL 95％的乙醇溶液中，然后加入100mL 85％的磷酸，最后加蒸馏水定容至1000mL。
(2)标准蛋白质溶液(100μg/mL)：精确称取100mg牛血清白蛋白，用0.9％氯化钠溶液定容至1000mL。
(3)生理盐水【实验操作】1．制作标准曲线取6支试管，按下表操作混匀，放置2min，于595nm处比色，记录光密度值(OD值)。
以蛋白质含量为横坐标，光密度值(OD值)为纵坐标，绘制标准曲线。
2．样品测定取2只试管，按下表操作：混匀，放置2min，于595nm处比色，查标准曲线，求得蛋白质含量。
注：样品用生理盐水稀释。
附实验2聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定酶的纯度【实验目的】掌握垂直板型聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作方法和原理。
【实验原理】聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺(Acr)和交联剂甲叉双丙烯酰胺(Bis)在催化剂作用下，聚合交联而成的三维网状结构的高分子聚合物，其网孔大小可由凝胶浓度加以调节。
因此用聚丙烯酰胺凝胶作为电泳支持物时，被分离物质由于所载电荷及其分子大小和形状的差异，在电场作用下以及凝胶网孔的“分子筛”作用下产生不同的移动速度而互相分离。
所以此方法具有电荷效应和“分子筛”效应的双重特性。
因为这一方法具有设备简单、操作方便、时间短、样品用量少、不易扩散等优点，所以它是鉴定酶和分离蛋白质的有力工具。
【实验仪器与试剂】1．仪器(1)SCR型稳流稳压电泳仪(2)垂直板电泳槽及附件(3) 10mL注射器、100μL、10μL移液器(4)微量注射器、烧杯、移液管(5)真空泵2．试剂(1) pH8.9 Tris-HCl缓冲液（1号）：称取Tris 36.6g，lmol／L HCl 48 mL，TEMED 0.23mL，加重蒸馏水定容至100mL。