Pacbio 第三代测序仪
PacBio RS II第三代单分子实时测序
2014-04
PacBio RS II单分子实时测序系统具有超常读长、组装结 果高准确度、可检测碱基修饰等优势特点，可广泛应用 于基因组测序、甲基化测序、全长转录本测序等项目。 详见：/zh-
CN/hanyumarketing/e3/e3.html
➢ 应区域，孔外过多游离核苷酸单体依然留在黑暗中，从而实现将背景降到最低。相 机以15ms速度快速扫描整个阵列，检测特异性结合到DNA片断上的荧光碱基。
➢ 此外，PacBio RS II测序可以通过检存在修饰，则通过聚合酶时的速度会减慢，相 邻两峰之间的距离增大，可以通过这个来之间检测甲基化等信息。
PacBio RS II样本准备要求
一、测序所需样品量
所需的测序样品的量会根据SMARTBell模板制备时插入片段的大小不同 而不同。根据样品的提取质量，在片段化以及检测浓度的过程中，大 概会有20%的样品损失。因此，请确保有足够的起始DNA样品从而可以 进行后续的流程。
二、样品要求
1. DNA样品纯度：260/280比值接近1.8，260/230比值为2.0~2.2
或高碱性条件下(PH <6或>9)和UV环境下。
5. 确保样品不含有不溶的物质，RNA，螯合剂（如EDTA），二价金属阳离子（如Mg2+），
变性剂（如胍盐，苯酚）或去污剂（SDS，Triton-X 100）。
三、样品储存和运输要求
1. DNA样品可溶解于Tris缓冲液中（如10mM Tris，PH为7.0~8.0）或无核酸酶的水中，样品
➢ 测相邻两个碱基之间的测序时间，来检测一些碱基修饰情况，如果碱基
PacBio RSII 测序优势
• NGS读长在35-700bp 之间，而PacBio RS II 平均测序读长能得到
picbio三代测序原理
p i c b i o三代测序原理集团标准化工作小组 [Q8QX9QT-X8QQB8Q8-NQ8QJ8-M8QMN]三代测序之PacBio SMRT技术全解析2017-05-11 11:29 来源:气温回升，天气渐暖，花儿开了一簇又一簇~在这美好的季节里，我们准备聊点新话题。
今天小编要来和你分享：PacBio SMRT测序那些事儿~测序技术在近几年中又有里程碑的发展，Pacific Biosciences公司成功推出商业化的第三代测序仪平台，让三代测序正式走入我们的视线。
与前两代相比，第三代测序有什么不同呢今天小编带大家详细了解测序界新宠-PacBio SMRT 测序平台。
PacBio SMRT测序原理Pacific Biosciences公司研发的单分子实时测序系统（Single Molecule Real Time，SMRT）应用了边合成边测序的原理，并以SMRT芯片为测序载体。
基本原理如下：聚合酶捕获文库DNA序列，锚定在零模波导孔底部4种不同荧光标记的dNTP随机进入零模波导孔底部荧光dNTP被激光照射，发出荧光，检测荧光荧光dNTP与DNA模板的碱基匹配，在酶的作用下合成一个碱基统计荧光信号存在时间长短，区分匹配碱基与游离碱基，获得DNA序列酶反应过程中，一方面使链延伸，另一方面使dNTP上的荧光基团脱落聚合反应持续进行，测序同时持续进行PacBio SMRT测序原理PacBio SMRT的单分子测序和超长读长是如何实现的我们重点看一下该技术的两点关键创新：分别是零模波导孔（zero-mode waveguides, ZMWs）和荧光标记在核苷酸焦磷酸链上（Phospholinked nucleotides）。
SMRT Cell含有纳米级的零模波导孔，每个ZMW都能够包含一个DNA聚合酶及一条DNA样品链进行单分子测序，并实时检测插入碱基的荧光信号。
ZMW是一个直径只有10~50 nm的孔，当激光打在ZMW底部时，只能照亮很小的区域，DNA聚合酶就被固定在这个区域。
picbio三代测序原理
三代测序之PacBio SMRT技术全解析2017-05-11 11:29 来源:基因谷技术气温回升，天气渐暖，花儿开了一簇又一簇~在这美好的季节里，我们准备聊点新话题。
今天小编要来和你分享：PacBio SMRT测序那些事儿~测序技术在近几年中又有里程碑的发展，Pacific Biosciences公司成功推出商业化的第三代测序仪平台，让三代测序正式走入我们的视线。
与前两代相比，第三代测序有什么不同呢？今天小编带大家详细了解测序界新宠-PacBio SMRT测序平台。
PacBio SMRT测序原理Pacific Biosciences公司研发的单分子实时测序系统（Single Molecule Real Time，SMRT）应用了边合成边测序的原理，并以SMRT芯片为测序载体。
基本原理如下：聚合酶捕获文库DNA序列，锚定在零模波导孔底部4种不同荧光标记的dNTP随机进入零模波导孔底部荧光dNTP被激光照射，发出荧光，检测荧光荧光dNTP与DNA模板的碱基匹配，在酶的作用下合成一个碱基统计荧光信号存在时间长短，区分匹配碱基与游离碱基，获得DNA序列酶反应过程中，一方面使链延伸，另一方面使dNTP上的荧光基团脱落聚合反应持续进行，测序同时持续进行PacBio SMRT测序原理PacBio SMRT的单分子测序和超长读长是如何实现的？我们重点看一下该技术的两点关键创新：分别是零模波导孔（zero-mode waveguides, ZMWs）和荧光标记在核苷酸焦磷酸链上（Phospholinked nucleotides）。
SMRT Cell含有纳米级的零模波导孔，每个ZMW都能够包含一个DNA聚合酶及一条DNA样品链进行单分子测序，并实时检测插入碱基的荧光信号。
ZMW是一个直径只有10~50 nm的孔，当激光打在ZMW底部时，只能照亮很小的区域，DNA聚合酶就被固定在这个区域。
只有在这个区域内，碱基携带的荧光基团被激活从而被检测到，大幅地降低了背景荧光干扰。
pacbio三代测序原理
pacbio三代测序原理随着生物学的发展，对于基因组的研究和分析也越来越重要。
在基因组研究中，测序是必不可少的一步。
测序技术的发展使得人们能够更加深入地了解基因组和生物学的本质。
PacBio三代测序技术是近年来新兴的一种测序技术，其原理和流程与传统的二代测序有很大的不同。
本文将详细介绍PacBio三代测序的原理和流程。
PacBio三代测序是基于单分子实时测序技术的。
其使用的测序仪是PacBio RS II或Sequel，这些测序仪能够实现单分子实时测序。
与传统的二代测序技术不同，PacBio三代测序能够在单个分子水平上进行测序，因此无需进行PCR扩增和文库构建等步骤，从而避免了PCR扩增引入的偏差和文库构建过程中的损失。
此外，PacBio三代测序还具有长读长优势，能够产生数千到数万的bp长的reads，从而大大提高了测序的准确性和覆盖度。
PacBio三代测序的原理是基于SMRT（Single Molecule Real Time）技术，该技术基于荧光信号实现单分子实时测序。
具体来说，PacBio 测序仪利用荧光标记的四种不同核苷酸（A、T、C、G）在DNA合成过程中的释放来进行测序。
当DNA合成时，DNA聚合酶会在荧光标记的核苷酸加入到新合成的链中时释放荧光信号。
这些荧光信号被PacBio 测序仪捕获并转化为序列信息。
由于荧光标记的核苷酸释放荧光信号的速度是非常快的，因此PacBio测序仪可以实时监测DNA合成的过程，从而实现单分子实时测序。
PacBio三代测序的流程主要分为三个步骤：样品准备、测序反应和数据分析。
首先，需要从样品中提取DNA，并将其质量和浓度进行检测。
接下来，将DNA片段直接加入到PacBio测序仪中，不需要进行PCR扩增和文库构建等步骤。
在测序反应中，PacBio测序仪会将荧光标记的核苷酸加入到新合成的DNA链中，并实时监测荧光信号。
最后，将测序得到的数据进行分析，包括序列拼接、错误校正和注释等步骤，从而得到高质量的基因组序列。
pacbio sequencing原理
pacbio sequencing原理PacBio测序（Pacific Biosciences sequencing）是一种第三代测序技术，采用了单分子实时测序（Single Molecule Real-Time Sequencing，SMRT）技术原理。
本文将介绍PacBio测序的原理和工作流程，并讨论其优势和应用。
PacBio测序的原理是基于DNA聚合酶的活性。
在测序过程中，DNA模板被固定在一个单个的微小孔中，该孔被称为SMRT细胞。
然后，DNA聚合酶从DNA模板的单链上开始合成新的DNA链。
DNA聚合酶在添加新的核苷酸时会释放出一个荧光信号，这个信号会被检测器记录下来。
PacBio测序的工作流程包括样本准备、测序反应、数据分析和结果解读。
首先，需要从待测样本中提取DNA，并对其进行质量检测和纯化。
然后，将纯化的DNA片段连接到SMRT细胞中，形成DNA 片段库。
接下来，将SMRT细胞放入PacBio测序仪中进行测序反应。
在测序反应中，DNA聚合酶会逐个加入核苷酸，并记录下荧光信号。
这个过程是实时进行的，所以可以获得实时的测序数据。
一旦测序完成，就可以进行数据分析。
PacBio测序产生的数据量较大，需要进行数据过滤和校正。
数据过滤可以去除低质量的测序数据，提高测序结果的准确性。
数据校正可以修正由于DNA聚合酶的错误引入的测序错误。
校正后的数据可以被用来进行序列组装和变异检测等进一步分析。
PacBio测序相比传统的二代测序技术有许多优势。
首先，PacBio 测序可以产生较长的读长，通常在10 kb以上，这使得对基因组结构和复杂变异的研究更加方便。
其次，PacBio测序的错误率较低，尤其是在相同覆盖度下，比二代测序技术更准确。
此外，PacBio测序可以直接检测DNA的甲基化状态，有助于研究表观遗传学。
PacBio测序在许多领域都有广泛的应用。
在基因组学研究中，PacBio测序可以用于基因组组装、变异检测和结构变异分析等。
第三代PacBio测序技术的测序原理和读长
第三代PacBio测序技术的测序原理和读长针对PacBio单分⼦测序——第三代测序技术的测序原理和读长DNA基因测序技术从上世纪70年代起，历经三代技术后，⽬前已发展成为⼀项相对成熟的⽣物产业。
测序技术的应⽤也扩展到了⽣物、医学、制药、健康、农林、园艺、花卉、环保、法医等许多领域，并成为⼀项与我们⾐⾷住⾏密切相关的⾼技术产业。
据最新统计，2012年全球基因测序市场的产值已超过百亿，按最近⼏年增长速度，预计2017年市场产值将加倍。
因此可以说，基因测序在我国⽣物科技领域具有⾮常重要的战略意义。
“第三代测序技术”的研发已有近⼗年时间，商业化的第三代测序仪上市也有三年,⽬前，国内对Pacbio单分⼦测序研究也有了最新进展：⼀，中科院药植所采⽤PacBio单分⼦测序揭⽰丹参叶绿体DNA修饰之间复杂的相互作⽤：编码及⾮编码RNA的表达2014年6⽉10⽇，中科院药⽤植物研究所（IMPLAD）刘昶团队在《PLOS ONE》杂志上发表了利⽤PacBio测序技术揭⽰丹参（Salvia miltiorrhiza）叶绿体DNA修饰之间复杂相互作⽤的相关⽂章，该⽂章报道了丹参叶绿体中编码及⾮编码RNA的表达情况。
这也是国内PacBio第三代测序⽤户在国际性杂志发表的第⼀篇⽂章。
丹参是最⼴泛使⽤的药⽤植物之⼀。
作为基于叶绿体基因⼯程⼿段开发使丹参活性成分过表达⽅法的第⼀步，该研究团队从基因组，转录组，和碱基修饰三⽅⾯对丹参叶绿体进⾏了分析。
先从新鲜叶⽚中提取总基因组DNA和RNA，然后进⾏链特异性RNA测序和PacBio 公司的单分⼦实时（Single-Molecule Real-Time, SMRT）测序分析。
实验先是将RNA测序得到的reads mapping到基因组，使该研究⼩组确定了80个蛋⽩质编码基因的相对表达⽔平。
此外，还明确了19个多顺反⼦转录单元和136个假定反义和基因间⾮编码RNA（ncRNA）基因。
三代测序适配的要求
三代测序适配的要求三代测序适配器设计指南简介三代测序技术（如PacBio和Oxford Nanopore）需要专门设计的适配器以连接到目标DNA片段。
这些适配器在测序过程中发挥着至关重要的作用，对确保高质量和准确的数据至关重要。
适配器设计原则适配器的设计应遵循以下原则：稳定性：适配器应稳定连接到目标DNA片段而不脱落。
特异性：适配器应仅与目标DNA片段结合，避免非特异性结合。
兼容性：适配器应与所使用的三代测序平台兼容。
流动性：适配器应具有最佳的流动性，以促进测序过程。
低自发荧光：适配器应具有极低的自发荧光，以避免干扰测序信号。
适配器序列设计适配器的序列设计应考虑以下因素：随机性：适配器序列应具有随机性，以减少PCR扩增期间的偏好性扩增。
GC含量：适配器应具有中等GC含量（40-60%），以优化测序信号。
末端钝化：适配器末端应钝化，以防止非特异性结合和PCR延伸。
长度：适配器长度通常为20-30个碱基，以提供足够的特异性和稳定性。
锚定序列适配器中包含锚定序列，即通过三代测序仪上的互补序列识别的短序列。
锚定序列应具有以下特性：高特异性：锚定序列应与仪器上的互补序列高度互补，以确保稳定结合。
重复性：锚定序列应重复存在于适配器中，以提高测序过程中识别的可能性。
无交叉反应：锚定序列不应与其他适配器或目标DNA中的序列交叉反应。
连接方法适配器可以采用以下方法连接到目标DNA：钝端连接：使用T4 DNA连接酶将钝化适配器末端连接到平端DNA片段。
黏性末端连接：使用T4 DNA连接酶将含有黏性末端的适配器连接到具有互补黏性末端的DNA片段。
优化适配器设计适配器设计可以通过以下方法进行优化：湿实验室验证：对不同设计的适配器进行实验验证，以评估其性能。
计算模拟：使用计算模拟工具预测适配器的稳定性和特异性。
数据库搜索：扫描数据库以识别潜在的交叉反应序列。
结论三代测序适配器是测序过程中的关键组成部分。
通过遵循这些设计原则，可以定制适配器以满足特定研究需求，从而获得高质量和准确的测序数据。
pacbio三代测序原理
pacbio三代测序原理随着基因组学的发展，测序技术也在不断地进步和完善。
其中，第三代测序技术因其高通量、高准确性、长读长等优势，被越来越多的科研人员所关注和使用。
PacBio三代测序技术是目前最先进的单分子实时测序技术之一。
本文将介绍PacBio三代测序的原理、优势和应用。
一、PacBio三代测序原理PacBio三代测序技术主要基于SMRT（Single Molecule Real Time）技术，其基本原理是将DNA分子固定在聚合酶上，通过单分子实时监测DNA聚合酶的扩增过程，从而实现对DNA序列的测定。
具体过程如下：1. DNA样本制备：将DNA样本进行适当处理，使其适合于PacBio 测序。
2. DNA聚合酶固定：将DNA聚合酶固定在透明的聚合酶盘上，并在盘底部加入荧光素和底物。
3. DNA扩增：加入DNA样本，DNA聚合酶开始扩增，同时荧光素也被释放出来。
4. 荧光检测：荧光素被激发后会发出荧光信号，通过摄像头实时捕捉荧光信号，记录DNA聚合酶扩增的过程。
5. 数据分析：通过计算机处理荧光信号，得到DNA序列信息。
由于PacBio三代测序技术采用单分子实时监测技术，因此其读长可以达到10kb以上，比第二代测序技术要长得多。
此外，PacBio三代测序技术还可以实现单分子级别的准确性，能够准确地检测到DNA序列中的各种变异。
二、PacBio三代测序优势1. 长读长：PacBio三代测序技术的读长可以达到10kb以上，比第二代测序技术要长得多。
这使得PacBio三代测序技术可以检测到更多的基因组结构变异和复杂序列。
2. 高准确性：PacBio三代测序技术可以实现单分子级别的准确性，能够准确地检测到DNA序列中的各种变异。
3. 高通量：PacBio三代测序技术可以在短时间内完成大量的测序工作，提高了测序效率和产出量。
4. 适用范围广：PacBio三代测序技术可以用于各种样本类型的测序，包括基因组、转录组、表观基因组等。
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第三代测序-单分子实时测序
一，PacBio RS平台介绍
二，PacBio RS测序仪系统服务领域
1，动植物复杂基因组测序
2，真菌基因组完成图
3，细菌基因组完成图
4，BAC克隆完成图
5，从头组装（DE Novo Assembly）
三，天津生物芯片提供的PACBIO RS系统测序方案
四，PacBio RS测序仪系统优势
五，PacBio RS测序仪系统原理
一，PacBio RS平台介绍
PacBio RS测序仪系统是太平洋生物技术公司（Pacific Biosciences）基于单分子实时（SMRT）测序技术的第三代测序平台，可以在一天内完成从样品制备到测序和读取序列的全过程。
天津生物芯片利用PacBio RS测序仪系统全面解决了二代测序几大困扰：海量数据拼接难，变异检测假阳性高，稀有突变被淹没，高GC含量区域无法跨越，高度片段无法准确测定等，得到高质量，完整的数据信息，为合作伙伴提供优质的基因组组装，目标区域测序，碱基修饰检测等技术服务。
二，PacBio RS测序仪系统服务领域
1，动植物复杂基因组测序
(1)杂合基因组：杂合基因组主要指杂合率高于0.5%的二倍体基因组，如大部分水产类和昆虫等；
(2)高重复基因组：主要指重复序列比例高于50%的二倍体基因组，大部分林木；
(3)超大基因组：基因组大小大于3G，甚至是10G以上的物种，如两栖类，部分林木；
(4)多倍体基因组：如四倍体、六倍体植物等。
图1 主要技术策略示意图
2，真菌基因组完成图
(1)适用于所有真菌菌株；
(2)尤其适合超高GC/超低GC真菌;
(3)其它用传统方法测序比较困难真菌；
(4)真菌基因组草图或精细图补洞。
3，细菌基因组完成图
(1)普通细菌快速完成图构建；
(2)尤其适合超高GC/超低GC细菌;
(3)其它用传统方法测序比较困难细菌菌株
通过采用第三代测序技术，直接进行细菌基因组的完成图绘制。
4，BAC克隆完成图
通过PacBio RS平台进行单分子实时测序，可以快速得到超长读长。
再加大测序深度，PacBio序列可以产生非常均一覆盖度，在大部分目标区域内，可以接近100%的覆盖度。
这种方式对于有超高GC含量、超低碱基复杂度等BAC克隆非常具有优势。
根据PacBio公司提供的Poster,由1Pacific Biosciences公司和University of Washington, Seattle对人类基因组一个约1.6Mb的片段，总共8个BAC克隆进行了PacBio测序，对比了Illmina测序，总体上得到了非常好的效果。
（见下图）
5，从头组装（DE Novo Assembly）
PacBio RS平台是目前唯一能完成完整基因组组装，结构测定和基因分型的微生物测序平台。
该平台可以用PacBio数据独立完成微生物基因组的完整拼
接，也可以将PacBio长读长数据和二代测序短读长数据进行混合拼接完成基因组。
三，天津生物芯片提供的PACBIO RS系统测序方案
PACBIO RS 系统可提供多种SMRT测序方案，如标准测序、环形比对测序、频闪测序，每种方法都利用了长片段读取的优势并结合SMRT bell模板形式（模板处理后形成的一个类似哑铃的结构）和单DNA 聚合酶原理。
1）标准测序：从插入片段的一端测到另一端，只测一次。
适合插入片段在
1-6Kb间。
主要应用于再测序和重头测序。
2）环形比对测序：从插入片段的一端测到另一端后，由于模板是哑铃状结构的，因此，继续测序将得到互补链的序列信息，从而可通过对插入片段的反复测序来获得高准确度的单分子测序结果。
适合插入片段在 250-500bp。
主要用于发现和确定稀有变异。
3）频闪测序：由于激光连续照射会对 DNA聚合酶活性造成一定影响，因此，可以通过将激光器按照一定间隔打开和关闭，获得相对标准测序来说更长时间的聚合酶活性。
这样可获得一系列分散的读取序列从而增加对超长插入片段的物理覆盖率。
适合长度高达 10K的插入片段。
主要用于结构变异的鉴定或者对复杂重复区域的拼接。
在每一种测序方案中，用户都可以调整参数，适合多种应用和项目类型。
这种灵活性也提供了分多个步骤解决一个问题的能力。
四，PacBio RS测序仪系统优势
采用PacBio RS 平台，进行单分子实时测序（single molecule, real-time SMRT）主要技术优势有：
1、超长的测序读长：平均测序读长能达到3，000至5，000碱基，最长的序列能达到20，000碱基；
2、极端的准确率：对基因组组装和基因组变异检测，可以最多达到99.999%的准确率；选用特殊测序模式，测序准确率可以在达到单个分子99%准确率的条件下，读长超过经典的Sanger测序法；
3、极度的敏感性：可以检测频率在0.1%的 minor variants；
4、直接检测广泛的碱基修饰：除了5-methylcytosine修饰以外，还可以检测N6-methyladenine, N4-methylcytosine, DNA氧化损伤以及其它碱基的修饰.
5、最小的GC偏向性（GC bias）：在极端高GC和极端低GC区域，可以轻松测定，从而保证序列的均匀覆盖度；
6、无PCR扩增偏向性：样本不需要进行PCR扩增，避免了覆盖度不均一和PCR artifacts.
五，PacBio RS测序仪系统原理
PacBio RS测序仪系统的关键优势是能够对单个DNA（脱氧核糖核酸）分子进行测序，而目前市场上的主流测序仪只能对分子群体进行平均测序。
单分子测序能对DNA中罕见的序列变异进行分析，也不需要在测序之前对DNA样本进行放大，因为放大过程可能引发错误，导致对某个DNA序列检测失败。
其工作原理是用一种聚合酶将DNA的复制限制在一个微小的间隙中，给各种碱基加上荧光示踪标记，当碱基合成DNA链时，这些荧光标记就会发出不同颜色的闪光，根据闪光颜色就可识别出不同的碱基。