效应面法优化蒙花苷水解工艺及其水解物的醛糖还原酶抑制活性研究

效应面法优化蒙花苷水解工艺及其水解物的醛糖还原酶抑制活性研究作者：王娇许浚张铁军来源：《中国中药杂志》2014年第11期[摘要] 目的：用效应面法对蒙花苷的水解工艺进行优化，通过醛糖还原酶模型研究其水解物金合欢素醛糖还原酶的抑制活性。

方法：建立水解物金合欢素体外生物酶模型，通过测定NADPH的荧光吸收，计算水解物金合欢素对醛糖还原酶的抑制率，从而得到水解物的醛糖还原酶抑制活性的IC50的平均值。

在蒙花苷水解工艺中采用效应面法优化水解工艺，并对结果进行预测分析。

结果：水解物金合欢素醛糖还原酶抑制活性，其IC50的平均值为2.74 mg·L-1。

优选的水解工艺为水解时间7.4 h，硫酸甲醇0.54 mol·L-1，固液比3∶1。

结论：水解物金合欢素具有比蒙花苷较好的醛糖还原酶抑制活性。

优选的蒙花苷水解工艺简便，预测性良好。

[关键词] 蒙花苷；效应面分析法；金合欢素；醛糖还原酶抑制剂[收稿日期] 2013-12-09[通信作者] 张铁军，Tel：（022）23006848，E-mail：tiezhang4@[作者简介] 王娇，硕士研究生，Tel：（022）23006843，E-mail：taoqibaojiaojiao369@糖尿病慢性并发症是严重影响患者生命质量的全身性病变，糖尿病视网膜病变是发病率较高的一种糖尿病慢性并发症。

醛糖还原酶抑制剂是通过抑制醛糖还原酶的活性，间接抑制多元醇通路的一类延缓和阻断糖尿病并发症的药物[1-2]。

近年来从植物提取出的具有抑制醛糖还原酶活性的化合物主要有黄酮类化合物。

蒙花苷为菊科植物野菊花Chrysanthemum indicum L.的主要天然黄酮类成分[3]。

近年来国内外研究表明，蒙花苷对大鼠晶状体的醛糖还原酶（AR）有抑制活性[4]。

本实验室前期研究表明，蒙花苷属于低溶解度，透过性较差的药物[5]。

药物比表面积和脂溶性对药物体内吸收有重要的促进作用，因此通过去糖基化增加蒙花苷的比表面积和脂溶性，对蒙花苷进行结构修饰。

效应面法具有试验次数少，精确度高，应用方便的特点，该设计方法可以很好地应用于药学领域[6]。

本研究以蒙花苷水解率为指标，运用效应面法进行蒙花苷水解工艺优化。

选用经典的非细胞模型[7-9]，评价醛糖还原酶在水解物金合欢素干预下的变化。

1 材料Lab Alliance高效液相色谱仪（SeriesⅡ一元泵系统，Lab Alliance色谱工作站）；AB204-N电子天平（瑞士METTLER TOLEDO公司）；HS-3120超声波清洗器（奥特赛恩斯机器有限公司）；DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器（巩义市英峪高科仪器厂）。

蒙花苷对照品（实验室自制，经HPLC归一法检测纯度>97%），金合欢素（中国食品药品检定研究院）；甲醇（色谱醇，天津市康科德科技有限公司）；冰醋酸（色谱醇，天津市康科德科技有限公司）；其他试剂均为分析醇。

Wister大鼠，雄性，天津市山川红实验动物技术有限公司，动物合格证号SCXK（津）2009-0001。

2 方法与结果2.1 含量测定2.1.1 色谱条件流动相乙腈-水-冰醋酸（40∶59∶1）；体积流量1 mL·min-1；检测波长326 nm；进样量10 μL；柱温30 ℃。

2.1.2 标准曲线的绘制分别精密称取蒙花苷和金合欢素对照品5.35，11.00 mg，置于100 mL量瓶中，加甲醇溶解至刻度，作为蒙花苷对照品储备液和金合欢素对照品储备液。

采用逐级稀释法用甲醇配置成不同浓度的蒙花苷对照品溶液和金合欢素对照品溶液，摇匀，按照2.1.1项下色谱条件进行测定，记录蒙花苷色谱峰面积及金合欢素色谱峰面积。

以蒙花苷对照品溶液质量浓度为横坐标（X L），峰面积积分值为纵坐标（Y L）进行线性回归，得回归方程为Y L=7X L-373.742，R2=0.999 2，线性范围0.1～52.9 mg·L-1；以金合欢素对照品溶液质量浓度为横坐标（X A），峰面积积分值为纵坐标（Y A）进行线性回归，得回归方程为Y A=7X A-4 828.128，R2=0.999 0，线性范围2.2～110.0 mg·L-1。

2.1.3 水解率的计算蒙花苷水解率=金合欢素峰面积/（金合欢素峰面积+蒙花苷峰面积）×100%。

2.2 单因素试验设计2.2.1 水解时间称取6份蒙花苷，按固液比1∶1，加入相应0.45 mol·L-1硫酸甲醇，搅拌加热，水解温度95 ℃，水解时间分别设为4，5，6，7，8，9 h，放冷，取上清液测定蒙花苷水解率，结果见图1，可知最适水解时间为7 h。

2.2.2 酸浓度称取6份蒙花苷，按固液比1∶1，分别加入0.15，0.3，0.45，0.6，0.75 mol·L-1硫酸甲醇，搅拌加热，水解温度95 ℃，水解时间7 h，放冷，取上清液测蒙花苷水解率，结果见图2，可知最适酸浓度0.45 mol·L-1。

2.2.3 固液比称取6份蒙花苷，分别按固液比1∶1，2∶1，3∶1，4∶1，5∶1，加入相应0.45 mol·L-1硫酸甲醇，搅拌加热，水解温度95 ℃，水解时间7 h，放冷，取上清液测蒙花苷水解率，结果见图3，可知最适物料比3∶1。

2.3 效应面试验设计2.3.1 试验设计根据Box-Benhnken中心组合实验设计原理[8]，结合单因素实验结果，选择对蒙花苷水解反应影响较大的酸浓度（X1）、固液比（X2）、水解时间（X3）3个因素作为考察因素，以水解率为响应值，采用3因素3水平的响应面实验设计，见表1。

2.3.2 效应面试验结果及数据分析多元二次模型方程的建立与检验：各试验点根据设计进行15次试验，以水解率Y为响应值，试验点设计及试验结果见表2。

采用Design-Expert 7.1.6软件对表2中实验数据进行多元回归拟合，得到蒙花苷水解的回归方程：Y=0.91+0.15X1+0.013X2+0.23X3-0.037X1X2-0.16X1X3+0.027X2X3-0.098X12-0.056X22-0.16X32。

对该模型进行方差分析，结果见表3。

结果显示所选用的二次回归模型具有高度的显著性（P效应面分析及优化：利用Design-Expert7.1.6软件对回归分析结果作相应的曲面图，见图4。

根据Box-Behnken实验所得结果及二次多项回归方程，利用Design Expert软件中的数据优化（numerical optimization）程序求得各因素最佳范围分别为水解时间6.8～7.6 h，硫酸甲醇0.48～0.56 mol·L-1，固液比2.8∶1～3.1∶1。

2.4 验证性试验依据二次多项回归方程，选取的最佳水解条件为水解时间7.4 h、硫酸甲醇0.54 mol·L-1、固液比3∶1，预测最优水解率79.64%。

为了验证优化结果的可靠性，在最佳水解条件下进行了3组试验，测得蒙花苷平均水解率为78.97%，RSD 0.90%，与预测值（79.64%）的偏差为0.8%，说明本实验建立的数学模型工艺稳定，重复性好，可见该模型能较好地预测实际水解情况。

2.5 水解物金合欢素对醛糖还原酶抑制活性研究2.5.1 醛糖还原酶的提取 Wistar大鼠颈椎脱臼处死，立即摘除眼球，分离晶状体（冰上进行）放入20 mL 10 mmol·L-1β-巯基乙醇[含有135 mmmol·L-1磷酸缓冲液（pH 7.0）]中，匀浆，4 ℃离心30 min，取上清液，-20 ℃保存。

2.5.2 反应体系的建立设立阳性对照组和阴性对照组，每组4个复孔。

反应体系中加入180 mmmol·L-1磷酸缓冲液（pH 7.0）225 μL，1.0 mmol·L-1硫酸锂溶液50 μL，10 mmmol·L-1DL-甘油醛溶液50 μL，阳性对照溶液（提取的酶溶液100 μL），阴性对照组加去离子水100 μL混合，30 ℃预热3 min，加入0.3 mmol·L-1 NADPH溶液50 μL，30 ℃反应30 min，加入0.5 mmol·L-1盐酸150 μL终止反应，各测试管分别加入10 mmmol·L-1咪唑（含6 mmol·L-1氢氧化钠溶液）10 μL，60 ℃反应20 min，室温放冷后于激发波长360 nm ，吸收波长460 nm检测荧光吸收度，见图5，阴性对照为NADPH在此反应体系中自身氧化变化趋势，阳性对照组中NADPH的荧光强度显著降低，说明AR的活性较强。

2.5.3 标准曲线的绘制 180 mmmol·L-1磷酸缓冲液（pH 7.0）2 450 μL，1.0 mmol·L-1硫酸锂溶液700 μL，10 mmmol·L-1 DL-甘油醛溶液700 μL，二甲基亚砜（DMSO）350 μL，提取的酶溶液1 400 μL和0.5 mmol·L-1的盐酸2 100 μL混合后取出600 μL，分别加入NADP溶液0，1，2，4，8，16 μmmol·L-1，各测试管分别加入10 mmmol·L-1咪唑（含6 mmol·L-1氢氧化钠溶液），60 ℃反应20 min，室温放冷后于激发波长360 nm，吸收波长460 nm检测荧光吸收度。

以NADP溶液浓度为横坐标，荧光强度为纵坐标，绘制标准曲线，计算得回归方程A=13.195C+57.062（r=0.998 9），线性范围为0～18 μmmol·L-1。

2.5.4 样品溶液的配置 180 mmmol·L-1磷酸缓冲液（pH 7.0）采用倍比稀释法分别将蒙花苷和金合欢素的DMSO溶液稀释成一定浓度，溶液在终浓度时所含DMSO体积相等且小于2.5%。

2.5.5 筛选方法按表5设置反应组，每个反应组中均加入提取的酶溶液50 μL，1.0 mmol·L-1硫酸锂溶液100 μL，180 mmol·L-1磷酸缓冲液（pH 7.0）225 μL。

2.5.6 实验结果按照下式计算有效组分各浓度的抑制率。

据各浓度的抑制率应用Origin Pro4.0软件计算出IC50。

抑制率=（A-B）/（A-C）×100%，式中，A为阴性对照组吸收度，B 为样品组吸收度，C为空白组吸收度。

由此计算的蒙花苷醛糖还原酶抑制活性的IC50的平均值为3.53 mg·L-1，金合欢素醛糖还原酶抑制活性的IC50的平均值为2.74 mg·L-1。