SDSPAGE凝胶电泳2
sds-page电泳的基本原理
SDS-PAGE电泳是一种常用的蛋白质分析技术，通过电泳分离蛋白质样品的方法得到了广泛的应用。
本文将着重介绍SDS-PAGE电泳的基本原理。
一、SDS-PAGE电泳的概念SDS-PAGE是一种已经被广泛应用的蛋白质分离技术，它的全称是聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis）。
这种电泳技术利用聚丙烯酰胺凝胶作为分离介质，通过直流电场将蛋白质样品分离出不同电荷和大小的蛋白质成分。
二、SDS-PAGE电泳的原理1. 聚丙烯酰胺凝胶SDS-PAGE电泳中所使用的凝胶是由聚丙烯酰胺构成的。
聚丙烯酰胺凝胶具有一定的孔隙结构，可以根据蛋白质的大小和电荷来调整孔隙的大小，从而实现不同大小的蛋白质的分离。
2. SDS处理SDS是指月桂基硫酸钠，它是一种阴离子表面活性剂。
在SDS-PAGE 电泳中，将样品中的蛋白质经过SDS处理后，蛋白质表面都会均匀地吸附一定数量的SDS分子，并且使蛋白质呈负电荷。
这样，所有的蛋白质分子都会带有类似的电荷密度，可以消除蛋白质的本身的电荷特性，使蛋白质在电场作用下只受到电场力的作用，而不受到其他因素干扰。
3. 蛋白质分离将经过SDS处理的蛋白质样品加载到聚丙烯酰胺凝胶上，然后通过电泳进行分离。
经电泳分离后，蛋白质会根据其大小和电荷迁移到不同位置，从而使不同的蛋白质分离开来。
三、SDS-PAGE电泳的应用SDS-PAGE电泳技术在生物化学和分子生物学研究领域应用广泛。
它可以用于研究蛋白质的分子量、纯度和比例，也可以用于检测蛋白质的存在和表达水平，同时还可以用于鉴定蛋白质的异构体等。
四、SDS-PAGE电泳的发展SDS-PAGE电泳技术自问世以来，经过不断的改进和完善，在蛋白质分离和分析领域一直处于领先地位。
未来，随着科学技术的不断进步，SDS-PAGE电泳技术也将会迎来新的发展，并在更广泛的领域得到应用。
SDS-PAGE蛋白凝胶电泳
SDS Triton Tween EDTA DTT -巯基
-X100 20,60,80
乙醇
BCA 5% 5% 5%
10mM 1mM 1mM
Bradf 0.1% 0.1% 0.06% ord
SDS-PAGE蛋白凝胶电泳
5mM 1M
✓
凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面。 SDS-PAGE蛋白凝胶电泳
❖制备浓缩胶(浓缩胶)
插入样品梳
加入浓缩胶溶 液 pH 6.8
样梳需一次平稳插入,梳 口处不得有气泡,梳底需 水平。
分离胶 pH 8.8
SDS-PAGE蛋白凝胶电泳
样品处理
Sample buffer
1. SDS
2. - mercaptoethSanaoml ple buffer
实验原理
• 分子筛效应
pH6.8ຫໍສະໝຸດ 5%pH8.810%
Gly- Gly-
Gly-Gly-
Gly-Gly-
CGl-y- CGl-y-CGl-y- CGl-y-CGl-y-CGll-y- CGl-lyC-Gl-lCyl-G- ly-
主要离子
氯离子 甘氨酸离子(pI5.97) 蛋白质离子
甘氨酸解离增加 无快慢离子 Pr-根据分子量运动 分子筛效应
实验原理
• 浓缩效应
pH6.8
Pr-
Gly- Gly-
Cl- Cl- Cl-
Pr-
Gly- Gly-
Cl- Cl- Cl-
Pr-
Gly- Gly-
Cl- Cl-Cl-
主要离子
氯离子 甘氨酸离子(pI5.97) 蛋白质离子
pH8.8
快慢离子的产生 高的电压梯度 Pr-运动加速
SDS-PAGE分析
百泰派克生物科技
SDS-PAGE分析
SDS-PAGE（sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis）十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳是Ulrich K. Laemmli开发的一种不连续电泳
系统，常用于分离和鉴定分子量在250 kDa之内的蛋白质混合物。
十二烷基硫酸钠（SDS，也称为十二烷基硫酸钠）和聚丙烯酰胺凝胶的联合使用可以消除结构和电
荷的影响，使蛋白质仅根据其分子量的差异进行分离，常用于复杂蛋白质混合物的高分辨率分离实验。
SDS-PAGE又称1D SDS-PAGE（一维凝胶电泳），根据蛋白质的相对分子量大小实现
蛋白质的分离，与高分子量蛋白质相比，较低分子量的分子在凝胶中迁移得更快。
因此，电泳结束后高分子质量的蛋白质仍然靠近点样孔。
在1D SDS-PAGE的基础上发展起来的2D SDS-PAGE（二维凝胶电泳）根据蛋白质的等电点和分子质量两个属
性对其进行分离，在2D凝胶电泳中，蛋白质先在固定pH梯度上进行第一维分离，再使用垂直或水平聚丙烯酰胺凝胶电泳进行二维分离，这种分离方法大大提高了蛋白质的分辨率。
SDS-PAGE已广泛应用于蛋白质样品纯度的评估、蛋白质表达的评估、蛋白质的免疫化学鉴定以及定量鉴定等。
百泰派克生物科技使用Bio-Rad Mini-PROTEAN® Tetra凝胶系统，提供基于1D和
2D的 SDS-PAGE分析服务技术包裹，用于多种蛋白质组学分析，包括蛋白质分子量测定、蛋白质鉴定、样品纯度分析、二硫键鉴定以及蛋白质定量等，欢迎免费咨询。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳PAGE测定蛋白质分子量
02 实验材料
所需的试剂和溶液
丙烯酰胺（AA）：用于制备凝胶，是聚合反应 的单体。
甲叉双丙烯酰胺（MBA）：交联剂，增加凝胶 的交联度。
N,N,N',N'-四甲基乙二胺（TEMED）：催化剂， 加速交联聚合反应。
所需的试剂和溶液
过硫酸铵（APS）
引发剂，产生自由基，引发聚合反应。
SDS
十二烷基硫酸钠，用于变性蛋白质并促使其 带负电荷。
发展新型分离技术
随着生物技术的不断发展，可以发展新型的蛋白质分离技术， 如二维电泳、毛细管电泳等，以提高蛋白质分离的分辨率和准
确性。
应用多维度分析
在后续实验中，可以将SDS-PAGE与其他蛋白质分析技术相结 合，如质谱技术、免疫学检测等，进行多维度分析，更全面地
了解蛋白质的性质和功能。
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白质带负电荷，从而在电场中向正极移动。
聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质，能够根据蛋白质分子量的不同
03
对其进行分离。
蛋白质的分子量测定
通过比较标准蛋白的迁移率和已知分 子量的标准蛋白，可以大致测定出待 测蛋白质的分子量。
蛋白质的迁移率与其分子量的对数成 反比，因此可以通过计算待测蛋白与 标准蛋白的相对迁移率来推算其分子 量。
甘氨酸
作为分子量标准品。
Tris-HCl缓冲液
维持电泳过程中的pH值稳定。
所需的仪器和设备
电源
为电泳提供电力。
凝胶板
放置凝胶的框架。
垂直电泳槽
提供电泳所需的基 本结构。
移液器
精确添加试剂和溶 液。
紫外透射仪
检测蛋白质条带。
实验前的准备事项
清洗电泳槽和相关器具，确保无残留物。 准备好所需的试剂和溶液，并确保其在有效期内。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）CHANG X C[实验目的]（1）掌握SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳原理。
（2）SDS-聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳的操作技术。
[实验原理]电泳是指带电颗粒在电场的作用下发生迁移的过程。
许多重要的生物分子，如氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等都具有可电离基团，它们在某个特定的pH值下可以带正电或负电，在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷极性相反的电极方向移动。
电泳技术就是利用在电场的作用下，由于待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而对样品进行分离、鉴定或提纯的技术。
电泳过程必须在一种支持介质中进行。
最初的支持介质是滤纸、醋酸纤维素膜和硅胶，这些介质适合于分离小分子物质，操作简单、方便。
但对于复杂的生物大分子则分离效果较差。
凝胶作为支持介质的引入大大促进了电泳技术的发展，使电泳技术成为分析蛋白质、核酸等生物大分子的重要手段之一。
最初使用的凝胶是淀粉凝胶，但目前使用得最多的是琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶。
蛋白质电泳主要使用聚丙烯酰胺凝胶。
聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis，简称PAGE）分为“连续系统”和“不连续系统”两种电泳系统，在本实验中选用不连续系统。
“不连续系统”最大的优点在于大大提高了样品分离的分辨率。
这种电泳的主要特点是：①使用两种不同浓度的凝胶系统；②配制两种凝胶的缓冲溶液成分及pH不同，并且与电泳槽中电泳缓冲液的成分、pH也不相同。
在本实验中，电泳凝胶分为两层：上层胶为低浓度的大孔胶，称为浓缩胶或成层胶，配制此层胶的缓冲液是Tris-HCl，pH6.7；下层胶则是高浓度的小孔胶，称为分离胶或电泳胶，成胶的缓冲液是Tris-HCl，pH8.9；电泳槽中的电极缓冲液则是Tris-甘氨酸，pH8.3。
可见，凝胶浓度、成胶成分、pH与电泳缓冲系统各不相同，形成了一个不连续系统。
SDS-PAGE(SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳)原理
N.N-亚甲基双丙烯酰胺（甲叉）（N,N’-methylene bis acrylamide）
N.N-亚甲基双丙烯酰胺，别名MBA，双叫N.N-甲叉双丙烯酰胺，次甲基双丙烯酰胺， N.N-甲撑双丙烯酰胺。是一种白色晶体粉末，无味，吸湿性极小。遇高温或强光则 自交联，微溶于水、乙醇。
丙烯酰胺单体和交联剂N1 N′-亚甲基双丙烯酰胺在催化剂的作用下聚合成含有酰胺 基侧链的脂肪族长链。相邻的两个链通过亚甲基桥交联起来就形成三维网状结构的 聚丙烯酰胺凝胶。
.
TEMED (N,N,N',N'-四甲基二乙胺 )
产品简介：
Ø TEMED即N,N,N‘,N’-Tetramethylethylenediamine，中文名为 N,N,N‘,N’-四甲基二乙胺。分子式为(CH3)2NCH2CH2N(CH3)2， 分子量为 116.20。
Ø 进口分装，用于配制PAGE胶等。TEMED通过催化过硫酸铵形成自由基 而加速丙烯酰胺与双丙烯酰胺的聚合。
过硫酸铵属于非易燃品，但由于能释放氧而有助燃作用，因此必须在一定条件下 储存。首先必须存放在干燥、密闭的容器中，其次应避免阳光直射、热源、潮湿等不 利因素。另外，一些杂质如脏物、铁锈、少量金属以及还原剂可能引起过硫酸铵的分 解，在存放和使用过程中也必须注意。由于潮湿的过硫酸铵粉末及其水溶液有漂白和 轻微的腐蚀作用，因此使用过程中应避免眼睛、皮肤和衣物直接与其接触。
N, N -亚甲基双丙烯酰胺又名甲撑双丙烯酰胺 , 英文缩写名 MBA, 为白色或浅黄色 粉末状结晶 , 毒性低 , 对皮肤无刺激 , 无神经毒性 , 溶于水及乙醇、丙酮等有机溶剂。 在它的结构中具有两个相同且非常活泼的反应性官能团 , 可作为交联剂 ,能将线性高 分子迅速转变为体型高分子 , 制备吸水性聚合物 , 还可与各种离子型单体发生聚合 反应 ,使其在石油开采以及医药、水处理等行业具有广泛用途。
实验二聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-PAGE鉴定免疫球蛋白
将制备好的凝胶放入电泳槽，加入电泳缓冲液， 拨除梳子。用微量移液器点样。 5、电泳
样品在浓缩胶时，低电压（60~80V，起始电流不超过10~15mA）， 进入分离胶后，提高电压（100~200V，电流不超过30mA），当 指示剂溴酚蓝前沿距离胶1~2mm，终止电泳。最好在低温下进行。
6、染色与脱色
2、在一塑料盒里加入少量转膜液，将滤纸与胶浸泡 于其中5-10min；PVDF膜浸入甲醇中2min
3、制备“夹心饼”：（膜可比滤纸稍大，防止短路） 提起滤纸平放在盒盖上，用洁净15ml离心管压走多 余的buffer，以不滴水为宜，平铺在半干转印槽上， 再将湿润的膜（实验室统一剪角标记）放在该层滤纸 上；接下来将已切角的胶平铺在膜上，在最上层再铺 上滤纸并压走多余液体。
四肽链结构
所有Ig的基本单位都是四条肽链的对称结构。两条重 链（H）和两条轻链（L）。
三、试剂与器材
1、30%的丙烯酰胺
2、10%SDS 3、TEMED 4、10%过硫酸铵
5、5xSDS-PAGE电泳缓冲液
6、浓缩胶缓冲液（PH6.8）
6.0 g Tris , 48mL 1mol/L HCl,加水至100ml.
4、转膜：（半干转）（PVDF膜0.22UM） 半干转移中，一般恒流（1-1.5mA/cm2，60-90min），
恒压的话15v 60分钟就可以了。 5、关闭电源，用镊子夹取PVDF膜，转移到塑料盒中，加入
5%脱脂奶粉4℃封闭过夜。 6、弃去封闭液，用TBST洗膜3次，每次5min 7、加入一抗，室温平缓摇动2h； 8、废弃液体用TBST洗膜3次，每次5min； 9、加入二抗，室温下孵育1h； 10、废弃液体用TBST洗膜3次，每次5min； 11、显色 在DAB中显色约10-30min，待蛋白质带的颜色
实验二SDSPAGE凝胶电泳
兔磷酸化酶B
MW=97,400
牛血清白蛋白
MW=66,200
兔肌动蛋白
MW=43,000
牛碳酸酐酶
MW=31,000
胰蛋白酶抑制剂
MW=20,100
鸡蛋清溶菌酶
MW=14,400
置-20℃保存，使用前室温融化，沸ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ浴中加热3-
5分钟后上样。
（13）样品：兔血清
２. 聚胶前准备
(1) 配制10％过硫酸铵溶液(需每天新鲜配 制)。 (2) 将单体储存液、缓冲液、水按照一定比 例配制成凝胶溶液。 (3) 将灌胶装置准备好。 (4) 待凝胶溶液平衡至室温(23~25℃)后，真 空脱气15 min。
分离范围
SDS聚丙烯酰胺凝胶的有效分离范围取决于用于灌胶的聚 丙烯酰胺的浓度和交联度。在没有交联剂的情况下聚合的 丙烯酰胺形成毫无价值的粘稠溶液，而经双丙烯酰胺交联 后凝胶的刚性和抗张强度都有所增加，并形成SDS-蛋白质 复合物必须通过的小孔。这些小孔的孔径随 “双丙烯酰 胺～丙烯酰胺” 比率的增加而变小，比率接近 1：20 时孔 径 达 到 最 小 值 。 SDS 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 大 多 按 “ 双 丙 烯 酰 胺～丙烯酰胺”为1：29 配制，试验表明它能分离大小相 差只有3% 的蛋白质。
实验二
SDS-PAGE凝胶电泳
SDS-PAGE凝胶电泳
实验原理 实验步骤 注意事项 SDS-PAGE的优点 SDS-PAGE的缺点 实验常见问题及处理 小技巧
实验原理
源起 基本原理 分类 分离范围
1967年由Shapiro建立。 1969年由Weber和Osborn进一步完善。
吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白 质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左 右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室 温下1h内保持稳定。该法是1976年Bradford建立，试剂配 制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，可测定微克级蛋 白质含量，测定蛋白质浓度范围为0～1000μg／mL，是一 种常用的微量蛋白质快速测定方法。
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（1０）脱色液： 冰乙酸75ml，甲醇50ml，加蒸馏水 定容至1000ml （1１）电极缓冲液 （内含0.1%SDS，0.05mol/LTris0.384mol/L甘氨酸缓冲液pH8.3）：称 Tris6.0g，甘氨酸28.8g，加入SDS1g， 加蒸馏水使其溶解后定容至1000ml
２.
聚胶前准备
的激活剂，并且不能保证很好的重复性，充分去除
氧气可以用尽量少的激活剂得到最佳聚合效果。通
常在较好的真空度(＜125torr)脱气至少15 min 。
8. 凝胶添加剂：凝胶中常常加入SDS、
尿素、Triton X-100等添加剂。SDS加入
后不会对凝胶的聚合产生影响，但尿素会
使凝胶孔径变小，这一特性可用来分离小
５.指示剂成微笑符号（指示剂前沿呈现向下的 曲线形），由于电泳槽的装置不合适，尤其是 凝胶和玻璃板组成的“三明治”底部有气泡或 靠近隔片的凝胶聚合不完全．
６.凝胶时间不对．通常胶在30min内凝聚．如果
凝聚得太慢，可能是TEMED，AP试剂不够或
者失效．
7.出现“皱眉”（两边向下中间鼓起）
主要出现在蛋白质垂直电泳槽中，一般是两板
仅可以决定凝胶聚合的速度，也将影响凝胶的质量。 增加过硫酸铵或TEMED的用量，将使丙烯酰胺聚
合链长度缩短，凝胶会变得脆弱而失去应有的柔性。
二者多至一定程度时，聚合链长度过短，将不会形
成肉眼可见的凝胶，这些短链多聚物呈溶液状，只
是其粘度较聚合前高一些。
6. 温度的影响聚胶的最佳温度为23~25 ℃ ，
SDS-PAGE的缺点
2. 还有一些电荷异常和构象特殊的蛋白质（如 组蛋白F1），含有较大辅基的糖蛋白和含有二 硫键较多的蛋白质，以及一些结构蛋白（如胶原 蛋白）等，它们在SDS-凝胶系统中，电泳的迁 移率与分子量的对数不呈线性关系。因此，为了
测得真实和完整的蛋白质分子量，通常可采用多
种方法进行测定和相互验证。
带有相同的免疫学活性，在WB反应中可见其能
9.为什么溴酚蓝不能起到指示作用？ 在实验中常会遇到溴酚蓝已跑出板底， 但蛋白质却还未跑下来的现象。主要与 缓冲液和分离胶的浓度有关。处理办法： 更换正确pH值的Buffer；降低分离胶的 浓度。
SDS-PAGE的优点
设备简单
快速 分辨率和灵敏度高
12. 用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白
质相对分子量时，必须同时作标准曲线。不能 利用这次的标准曲线作为下次用。并且SDSPAGE测定分子量有10％误差，不可完全信任。
13. 有的蛋白质（如：电荷异常或结构异常的
蛋白质；带有较大辅基的蛋白质）不能采用该 法测相对分子量。
14. 有些蛋白质由亚基（如血红蛋白）或两条以上
分子蛋白质或多肽。
9. 聚胶时间：虽然应用过硫酸铵／TEMED催化后
灌胶15~20 min即可观察到凝胶的形成，但至少需 90 min才能保证95％以上的单链聚合成长短以及具
有合适的孔径大小。采用核黄素时聚胶时间需更长，
但它一般用于等电聚焦即根据蛋白质的电荷性质进 行分离，对孔径大小要求不高，因此不必等很长时 间(完全聚合需8 h)。
记不要喷了，这个过程大约20～30秒，在摇床上染色，这时可以去
处理胶板，电泳槽，台面，待收拾干净后染色也就结束了（不要觉 得染色时间太短了，已经足够了，太长了脱色也麻烦），此过程大 约需要3～5min；回收染液，用自来水清洗几次胶，再加入适量自来 水，放入微波炉中煮沸，条件与染色时一致，摇床脱色，此时你就 可以做其他试验了， 3～5min后可以再换一次清水，煮沸脱色，我 的经验是一次用水脱色就可以看到Marker条带了，两次以后就可以 清析的看到你的结果了，如果觉得结果不错可以留存备用，再加入 脱色液，脱干净了就行了。
(1) 配制10％过硫酸铵溶液(需每天新 鲜配制)。 (2) 将单体储存液、缓冲液、水按照 一定比例配制成凝胶溶液。 (3) 将灌胶装置准备好。 (4) 待凝胶溶液平衡至室温(23~25℃) 后，真空脱气15 min。
３．不连续系统下层分离胶的聚合
在10 ml凝胶溶液中加入10％过硫酸铵50 μl
电泳后的凝胶经考马斯亮蓝 染色、脱色后的凝胶照片
７.结果处理
测量并计算分子量
蛋白质的分子量与它的电泳迁移有一定关系式，经37种蛋 白的测定得到以下的关系式
Mw ＝ K(10－bm)
lgMw = lgK－bm = K1－bm 其中MW是蛋白质分子量；K和K1为常数
(1)
(2)
b为斜率， m是电泳迁移率，实际使用的是相对迁移率 mR 。 mR=dpr/dBPB
SDS-PAGE凝胶电泳
SDS-PAGE凝胶电泳
实验原理 实验步骤 注意事项 SDS-PAGE的优点 SDS-PAGE的缺点 实验常见问题及处理 小技巧
实验步骤
１．试剂配制
(1) 30%丙烯酰胺（Acr）：称Acr30g，甲叉双 丙烯酰胺（Bis）0.8g，加蒸馏水至100ml，过 滤后置棕色瓶中。 4℃，1～2月 （2）10%SDS（十二烷基磺酸钠） （3）1.5mol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.8)： 称取Tris 18.2g, 加入50ml水,用1mol/L盐 酸调pH8.8,最后用蒸馏水定容至100ml。
2： 电泳条件的选则
电泳不采用先低压再高压的常用方法，每次
都是上样后直接采用200V恒压电泳，一般Bio
－Rad的胶板，39min即可跑到头，电泳结果
一点都没有影响。
3： 染色与脱色
分子克隆上介绍的方法耗时太长，现在用Crystal的方法已经相当快 了，稍做改动：染色时加入染液后，在微波炉中煮沸一次即可，切
需要注意灌胶前单体溶液(通常置于4℃冰箱)及玻璃 板或管(有时从烘箱取出)也要平衡至此温度。由于 溶液在抽真空时仍维持较低温度，需待其升至室温 后再脱气，另外升温后脱去氧气的速度较低温时快。
7. 氧气的影响氧气会与被激活的单体自由基作
用抑制聚合过程，因此需在加激活剂前对单体溶液 脱气。如果省去这一步骤，凝胶仍能聚合但需更多
凝胶聚合的速度可以通过紫外吸收检测，由
于丙烯酰胺中的双键在260nm有吸收，聚合后
双键消失，光吸收减低。将凝胶溶液倒入石英比
色杯中，可观察到20~30 min后光吸收读数开始 下降，至80 min以后趋于稳定，说明聚合完成。
５．电泳
将聚合好的凝胶板安置于电泳槽中，
上样，选择适当的电压进行电泳。
垂直板 电泳装置
加样
样品迁 移方向
水平式电泳装置
电泳缓冲液
凝胶
电泳过程中分子迁移的规律，小分子 走在前头，大分子滞后。电泳凝胶相 当于凝胶过滤中的一个带孔胶粒。
大分子
混合样品 电泳 电泳方向 带孔胶
小分子
按分子 大小分离
６．染色和脱色
电泳完毕需通过染色和脱色评定其结果的优 劣，此外根据不同的研究目的，也可将凝胶直接 进行放射自显影及电印迹。
４．不连续系统中的上层浓缩胶 和连续系统凝胶的聚合
连续系统只含一种凝胶，它和不连续
系统中的浓缩胶具有相同之处，即在其液 面处与空气相接触，因此激活剂的含量应 相应地增加，在10m1凝胶溶液中加入10 ％过硫酸铵50 μl (最终浓度0.05％)， TEMED原液10 μl (最终浓度0.1％)。
同前将激活剂混合均匀，但摇动溶液时不要 摇得过于剧烈以免引入过多的氧气。 吸去不连 续系统中下层分离胶上的水分，以连续平稳的 液流注入凝胶溶液，然后小心插入梳子并注意 不得在齿尖留有气泡。 静置90 min以上以保证 完全聚合。 如果在聚胶过程中发现一道道纹线， 即凝胶不均匀，可能是聚合速度太快或激活剂 未充分混合导致局部浓度过高。
电泳 缓冲液
加在槽中的经 SDS处理的样品
夹在两块玻璃 板之间的凝胶 电泳 缓冲液
电源
分子量大
分子量小
在一定的凝胶浓度下，
标准蛋白分子量
多肽链分子量的对数与
多肽链的相对迁移率成 线性关系，所以可以通
过标准曲线求未知多肽
链分子量。 未 知 蛋 白
相对迁移率
实验注意事项
1： 电泳缓冲液的使用：
电泳缓冲液是完全可以回收再用的，但前提是每次
的内层缓冲液必须是新配的。每次在电泳完成后内外
层缓冲液一起回收到一个瓶里，作为下次的外层缓冲
液使用。就是配制新的缓冲液只作为内层使用（配制 1L可以用很久的），每次都用回收的缓冲液作外层， 效果一点都不差，即节省了试剂，又节省了时间。
肽链（α-胰凝乳蛋白酶）组成的，它们在巯基乙 醇和SDS的作用下解离成亚基或多条单肽链。因 此，对于这一类蛋白质，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电 泳法测定的只是它们的亚基或是单条肽链的相对 分子量。
15. 如果该电泳中出现拖尾、染色带的背景不清
晰等现象，可能是SDS不纯引起。
常见问题及处理办法
１．纹理和拖尾现象由于样品溶解不佳引
之间的底部间隙气泡未排除干净。处理办法： 可在两板间加入适量缓冲液，以排除气泡。
8.出现“鬼带”
如何处理？
“鬼带”就是在跑大分子构象复杂的蛋白质分 子时，常会出现在泳道顶端（有时在浓缩胶中） 的一些大分子未知条带或加样孔底部有沉淀，主 要由于还原剂在加热的过程中被氧化而失去活性， 致使原来被解离的蛋白质分子重新折叠结合和亚 基重新缔合，聚合成大分子，其分子量要比目标 条带大，有时不能进入分离胶。但它却于目标条
(最终浓度为0.05％)，TEMED原液5μl (最终浓度
为0.05％)。轻缓地摇动溶液(8~10下)，使激活剂
混合均匀。
将凝胶溶液平稳地注入两层玻璃板中(注意
要以连续平稳的液流从中间位置注入)，再在液面
上小心注入一层水或正丁醇(约2~3mm高)，以阻