MTH1与乳腺肿瘤的相关性研究

MTH1与乳腺肿瘤的相关性研究乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，随着经济的不断发展，生活水平的不断提高，乳腺癌（breast cancer）发病率逐年增长，发病率一直处于上升趋势，2012年，全球约有170万例乳腺癌新发病例和52.19万例乳腺癌死亡病例[1]。

中国乳腺癌发病率以每年3%的水平持续增长，一些大城市的乳腺癌发病率已经居于女性恶性肿瘤首位[2]。

肿瘤细胞在不断复制过程中会产生大量活性氧族（ROS），而ROS可导致NTP氧化，DNA复制过程中用到NTP，如果氧化的NTP渗入到DNA中，合成出来的核酸会导致基因组不稳定[3-4]，会导致基因突变，这是所有癌症分子的基础部分，这是一种破坏性的损伤，导致突变及细胞死亡[5-7]。

研究表明，恶性肿瘤需要高效MTH1，防止dNTPs被氧化后掺入DNA，导致损伤和细胞死亡，提示该蛋白可作为抗癌治疗的靶标[8-9]。

本文旨在研究良、恶乳腺肿瘤组织细胞实质与间质中MTH1表达的差异性及不同状态下乳腺恶性肿瘤细胞激素受体（HR）、人表皮生长因子受体2（HER-2）、淋巴结有无转移及Ki-67组织细胞中MTH1之间的差异，为乳腺癌临床治疗提供新的思路。

1 材料与方法1.1 材料选取2014年5月～2015年7月新乡市中心医院乳腺肿瘤组织蜡块及部分相应组织57例，所有标本均经病理科证实，其中包含37例乳腺恶性肿瘤组织蜡块（髓样癌2例、浸润性导管癌25、小叶癌3例、导管原位癌6例及胸壁复发乳腺癌1例）和20例乳腺良性肿瘤（乳腺腺病7例、乳腺纤维腺瘤7例、乳腺叶状肿瘤6例）。

1.2 主要仪器与试剂顯微镜（德国，蔡司公司）；LEICA免疫组化仪[德国，徕卡显微系统（上海）贸易有限公司]；β-actin一抗（武汉博士德有限公司）；MTH1一抗（美国abcam）；二抗HBR标记羊抗兔IgG （南京诺唯赞生物科技有限公司）；辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗（南京诺唯赞生物科技有限公司）；组织蛋白提取试剂盒（迈新生物技术开发公司）；S-P试剂盒（迈新生物技术开发公司）；DAB显色试剂盒（迈新生物技术开发公司）；化学发光凝胶成像仪（美国，ProteinSimple）。

1.3 免疫组织化学方法①切片厚度3 μm；②脱蜡，将切片浸于二甲苯中2次，每次10 min，100%乙醇5 min、95%乙醇5 min、90%乙醇5 min、85%乙醇5 min，自来水冲洗，PBS洗2次均5 min；③修复液（1∶50），高压进行修复，出气后90 s，冷却，3%过氧化氢溶液室温浸泡8 min，PBS洗3次，每次5 min；④滴加一抗（abcam单克隆MTH1，工作浓度（1∶100）50 μL，4℃冰箱过夜，恢复室温37℃，PBS洗3次，每次5 min；⑤滴加二抗HBR标记羊抗兔IgG（工作浓度1∶500）50 μL，30 min，PBS洗3次，每次5 min；⑥用DAB显色试剂盒显色，显色6 min后，充分水洗；中性树脂封片，盖上盖玻片。

选择五组及相应HE染色组织相，进行400倍的显微照相，经登录、编号、采集、分析、读取数据、最后存盘，显微照相。

1.4 蛋白印迹分析实验①将少量组织转移至玻璃匀浆器中并加入400 μL裂解液（含PMSF、酶抑制剂等）进行裂解，冰上匀浆至组织块消失。

②裂解30 min后，移至1.5 mL离心管中，4℃离心5 min，取上清进行分装，-20℃保存。

③进行Bradford比色法测定蛋白质浓度。

④以50 μg蛋白上样量进行上样。

⑤电泳（浓缩胶20 mA，分离胶35 mA）。

⑥转膜（200 mA 90 min）。

⑦转膜完毕后，室温封闭1.5 h。

⑧一抗孵育：加入稀释好的一抗，室温孵育1.5 h。

之后洗涤3次，每次5 min。

吸尽洗涤液后，再加入洗涤液洗涤，洗涤3次，每次5 min。

⑨二抗孵育：按照适当比例用Western 二抗稀释液稀释，HRP标记的二抗孵育2 h，洗涤3次，每次5 min，然后加发光液进行照相。

1.5 判定标准经三位观察者同时、独立、互相保密进行评分，结果取平均值。

阴性表达为细胞无染色或非特异染色。

阳性表达按染色强度分级：呈淡黄色计1分，呈较深褐色计2分，呈深褐色计3分；阳性范围分级：0%～ <25%计1分，25%～<50%计2分，50%～<75%计3分，75%～100%计4分。

上述两种评分相加2～3分计为弱阳性（+），4～5分计为中等阳性（++），6～7分计为强阳性（+++）。

1.6 统计学方法采用SPSS 19.0软件进行统计分析，计数资料采取χ2检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果2.1 在乳腺肿瘤细胞及不同状态乳腺恶性肿瘤细胞中MTH1的表达情况在乳腺肿瘤细胞及不同状态乳腺恶性肿瘤细胞中MTH1的表达情况见图1。

图1A～B实质及间质中免疫组化染色深度及染色细胞数目均明显弱于图1C～D。

图1E、F分别为Ki-67≤20%、Ki-67>20%的乳腺恶性肿瘤组织（HR阴性、HER2阴性，均无淋巴结转移，其他免疫指标一致），图1F实质、间质中免疫组化染色深度均明显高于图1E。

图1G、H分别为HER-2（-）、HER-2（+～+++）的乳腺恶性肿瘤组织（HR阴性、Ki-67，均无淋巴结转移，其他免疫指标一致），图1H实质、间质中免疫组化染色深度均明显高于图1G。

A为乳腺纤维腺瘤组织，B为乳腺纤维腺病组织，C为浸润性小叶癌组织，D～H为乳腺浸润性导管癌组织。

右下角小图为相应标本HE染色图1 在乳腺肿瘤细胞及不同状态乳腺恶性肿瘤细胞中MTH1的表达情况（20×20）2.2 MTH1在不同状态下的表达情况MTH1在乳腺肿瘤组织实质及间质中含量，恶性肿瘤均明显高于良性肿瘤，差异有统计学意义（P < 0.05）。

MTH1在有和无淋巴结转移的恶性肿瘤组织中的含量差异无统计学意义（P > 0.05）。

MTH1在HR阳性和阴性的恶性肿瘤组织中的含量差异无统计学意义（P > 0.05）。

MTH1在乳腺恶性肿瘤实质及间质中的含量，Ki-67>20%组明显高于Ki-67≤20%组，HER-2（+～+++）组明显高于HER-2（-）组，差异均有统计学意义（P < 0.05）。

见表1～2。

2.3 MTH1在乳腺肿瘤细胞及不同状态下恶性肿瘤细胞中的蛋白表达情况乳腺恶性肿瘤组织MTH1表达明显高于良性肿瘤组织。

MTH1在有和无淋巴结转移的恶性肿瘤组织中的含量没有差异。

MTH1在HR阳性和阴性的恶性肿瘤组织中的含量没有差异。

MTH1在乳腺恶性肿瘤实质及间质中的含量，Ki-67>20%组明显高于Ki-67≤20%组，HER-2（+～+++）组明显高于HER-2（-）组，差异显著。

见图2。

3 讨论近年来研究认识到，间质在肿瘤的发生、发展过程中起着重要作用，肿瘤的发生、发展并非由上皮或间质单方面决定，而是由两者相互作用所构成的肿瘤-宿主微环境的平衡状态所决定[10-11]。

恶性肿瘤组织是酸性乏氧的环境，这样的微环境能够显著激活，活性氧的产生，而活性氧的产生则会对DNA、RNA、蛋白质和脂类造成氧化性损伤，进而影响细胞的正常功能。

MTH1是癌细胞生存中必不可少的分子，敲除MTH1会导致HELA细胞RNA氧化明显增高[12]。

因此，MTH1选择性清除活性氧，保证了肿瘤细胞的正常增殖，而正常细胞不依赖于MTH1的功能维持生存。

因此，针对MTH1靶向治疗癌症并不影響正常细胞的功能[13]。

目前已发现克唑替尼（Crizotinib）的对应异构体能抗击MTH1，临床表现很好。

许多人类癌症细胞中均检测到MTH1，如肺癌、肾癌[14]。

乳腺癌细胞中含有MTH1已被证实[15]。

本研究通过免疫组化方法及Western bolt分析20例乳腺良性组织及37例乳腺恶性肿瘤组织实质及间质中MTH1的含量差异。

乳腺恶性肿瘤组织中MTH1含量明显高于乳腺良性组织，同时本研究也表明了在HER-2（+～+++）及Ki-67>20%的恶性肿瘤中MTH1的含量明显高于HER-2（-）及Ki-67≤20%的恶性肿瘤。

这些结果可能是由于癌细胞的代谢活动要比正常细胞快，因此癌细胞更需要解决这些活性氧物质的高水平问题。

这些高水平活性氧物质不仅对DNA或RAN造成损伤，而且也会对细胞中核苷三磷酸混合物造成危害，会产生氧化的DNA碱基，而这些氧化的DNA碱基则会错误地整合到DNA和RNA中，导致细胞死亡[16-17]。

由于MTH1可以选择性地将氧化的核苷从NTP混合物中清除，来缓解这一问题，使恶性肿瘤细胞可以不断增殖[18-19]。

另外，在Ki-67>20%和HER-2（+～+++）组含量尤为明显。

然而Ki-67>20%、HER-2阳性往往肿瘤恶性程度高，容易复发转移，Ki-67>20%、HER-2阳性又是乳腺癌预后的独立指标，从而提示MTH1含量越高肿瘤预后越差。

淋巴结有无转移两组差异无统计学意义，可能是由于淋巴结转移与肿瘤发现的早晚关系更为密切；而HR阳性和HR阴性两组差异无统计学意义，可能为抽样误差所致。

综上所述，MTH1可以修复肿瘤细胞在不断增殖过程中被氧化的核苷酸，从而减少肿瘤细胞在不断增殖中，核苷酸被氧化所导致核酸的不稳定性，致使恶性肿瘤细胞可以不断增殖。

理论上阻断该途径，可以很大程度地抑制肿瘤的增殖。

在临床上我们可以针对MTH1蛋白给予靶向治疗，抑制乳腺癌实质及间质的无限增殖，从而达到治疗乳腺癌的目的。

[参考文献][1] Torre L，Bray F，Siegel R，et al. Global cancer statistics，2012 [J]. CA cancer J Clin，2015，65（2）：87-108.[2] Fan L，Strasser-Weippl K，Li JJ，et al. Breast cancer in China [J]. Lancet Oncol，2014，15（7）：e279-e289.[3] Sonntag CV. Free-radical-induced DNA damage and its repair [J]. Springer Berlin，2006，10（19）：12-19.[4] Dizdaroglu M，Jaruga P. Mechanisms of free radical-induced damage to DNA [J]. Free Radical Res，2012，4（6）：382-419.[5] Friedberg EC，Walker GC，Schultz W，et al. DNA Repair and Mutagenesis [J]. ASM，2006，12（56）：2-8.[6] Vogelstein B，Kinzler KW. The Genetic Basis of Human Cancer [M]. New York：McGraw-Hill，1998.[7] Friedberg EC. DNA damage and repair [J]. Nature，2003， 4（21）：436-440.[8] Huber KV，Salah E，Radic B. Stereospecific targeting of MTH1by（S）-crizotinib as an anticancer strateg [J]. Nature，2014，5（9）：222-227.。