黑曲霉固态生产木聚糖酶发酵条件的优化

2009年第4期中国酿造总第205期··麸皮108.4070％麸皮和30％玉米芯98.7730％麸皮和70％玉米芯83.42表1碳源对产酶的影响试验Table 1.Effects of different carbon source on xylanase production碳源酶活/（U ·g -1）木聚糖酶是一类能够特异性降解木聚糖的酶类，以内切方式水解木聚糖分子中的J3-1，4糖苷键，其水解产物主要为木二糖与木二糖以上的寡聚木糖，也有少量的木糖和阿拉伯糖。

同自然界中五碳糖的循环相联系，在能量循环中占有重要地位。

本试验就木聚糖酶固态发酵培养基的优化进行了论述，以推动木聚糖酶固态发酵过程技术水平的发展，找出最适发酵培养基，从而为木聚糖酶的工业生产提供参考。

1材料和方法1.1材料菌种黑曲霉（Aspergillus niger ）。

培养基：麸皮，0.5%KH 2PO 4，0.5%MgSO 4·7H 2O ，含水量以手捏培养基感觉有水但不滴水为准。

1.2木聚糖酶酶活定义、分析测定方法木聚糖酶酶活力国际单位定义为标准反应条件下，每分钟生成1.0μmol 木糖所需要的酶量（以木聚糖为底物）为1个酶活单位。

酶活检测采用DNS 染色法。

2结果与分析2.1碳源对产酶的影响试验考虑到基础产酶培养基麸皮中淀粉含量较多，灭菌后容易结块影响培养基的透气性，所以在基础培养基添加30％和70％玉米芯做碳源试验，观察其对产酶的影响，结果见表1。

从表1可以看出，添加大颗粒的玉米芯后改善了培养基的通气量，但玉米芯加大用量后酶活反而降低，因此玉米芯的添加量不宜太大，应以70％麸皮和30％玉米芯为宜。

2.2氮源添加量对产酶的影响在基础产酶培养基中分别添加2％、3％、4%（NH 4）2SO 4，观察其对产酶的影响，30℃培养3d 测定酶活，结果见图1。

由图1可知，（NH 4）2SO 4添加量偏低，菌丝生长缓慢，添加量过大，菌丝旺盛生长但孢子产量少，在基础产酶培养基中添加3％（NH 4）2SO 4比较合适。

2.3磷酸盐添加量对产酶的影响黑曲霉固态生产木聚糖酶发酵条件的优化闫振丽，程杰渊，杨付伟，汤清源，张海涛（河南天冠企业集团有限公司，河南南阳473000）摘要：研究固体培养条件下培养基中碳源、氮源、磷酸盐、水分、Mg 2+、微量金属盐Mn 2+及添加表面活性剂对黑曲霉生产木聚糖酶的影响。

并运用正交试验对以上4个因素进行处理。

经过单因子及正交试验，确立了产酶的最适培养基配方：麸皮，（NH 4）2SO 44%，KH 2PO 40.75%，Mg 2SO 4.7H 2O 1.0%，聚丙二醇0.10%，自来水70%，pH 自然。

关键词：木聚糖酶；黑曲霉；优化；发酵条件中图分类号：TQ464.8文献标识码：A文章编号：0254-5071（2009）04-0099-03Optimization of solid-state fermentation conditions of xylanase by Aspergillus nigerYAN Zhenli,CHENG Jieyuan,YANG Fuwei,TANG Qingyuan,ZHANG Haitao(Henan Tianguan Group Co.,Ltd.,Nanyang 473000,China)Abstract ：Effects of carbon source,nitrogen source,phosphate,water,Mg 2+,Mn 2+and surfactant on the production of xylanase by Aspergillus niger were investigated in this study.The optimal fermentation conditions were obtained by single factor experiment and orthogonal experiment as followed:wheat bran,（NH 4）2SO 44%，KH 2PO 40.75%，Mg 2SO 4·7H 2O 1.0%，polypropylene glycol 0.10%,water 70%and natural pH.Key words:xylanase;Aspergillus niger ;optimization;fermentation condition收稿日期：2008-10-24基金项目：国家科技支撑项目（2007BAD66B01）作者简介：阎振丽（1971-），女，河南南阳人，工程师，主要从事酶制剂发酵方面的研究工作。

（NH 4）2SO 4/%图1氮源对酶活力的影响Figure 1.Effects of different nitrogen source on xylanaseproduction1601401201008060402001234酶活/（U ·g -1)经验交流99China Brewing2009No.4SerialNo.205··表3培养温度对产酶的影响Table 3.Effect of temperature on xylanase production 酶活/（U ·g -1）143.21154.04培养温度恒定29℃0h~36h ，29℃；36h 后27℃表2添加微量金属盐Mn +对产酶的影响Table 2.Effect of MnSO 4on xylanase production 0.000.050.10酶活/（U ·g -1）113.20165.42122.69M nSO 4添加量/％酶活/（U ·g -1）KH 2PO 4/%图2磷酸二氢钾添加量对产酶的影响Figure 2.Effect of KH 2PO 4concenration on xylanase production1401201008060402000.50.75 1.0 1.251.5在优化培养基中分别添加0.5％、0.75％、1.0％、1.25％、1.5%KH 2PO 4，观察其对产酶的影响，结果见图2。

从图2可以看出，KH 2PO 4的合理添加量应为0.75%。

分析其原因，磷酸盐不仅适合微生物生长、产酶对磷的要求，而且可以加强培养基的缓冲作用，以防止微生物代谢所产生的酸或碱对产酶的影响。

2.4Mg 2+对产酶的影响试验在优化培养基中分别添加0.5%、1.0%、1.5%、2.0%MgSO 4·7H 2O ，观察其对产酶的影响。

从图3可以看出，MgSO 4·7H 2O 的添加量<0.5%时，酶活提高比较显著；用量为0.5%~1.0%时，酶活提高不太明显，当添加量由1.0%提高为2.0%时反而抑制酶的产生，因此，MgSO 4·7H 2O 的合理添加量应该为0.5%~1.0%。

2.5微量金属盐Mn 2+对产酶的影响试验在优化培养基I 中分别添加0.00%、0.05%、0.10%MnSO 4，观察其对产酶的影响。

从表2可以看出，MnSO 4的添加量为0.00%~0.05%时，（Mn 2+对酶的激活促进作用）酶活提高比较显著；用量>0.05%时，过高浓度的Mn 2+反而抑制酶的产生，因此，MnSO 4的合理添加量应<0.05%。

2.6表面活性剂对产酶的影响试验选择4种表面活性剂：PEG4000、油酸钠、司盘和聚丙二醇，在优化培养基I 中添加量均为0、0.10%、0.15%、0.20%，观察其对产酶的影响，结果见图4。

从图4可以看出，添加表面活性剂后，增加了细胞膜的通透性和酶的运输，所以不论添加哪种表面活性剂均能不同程度地提高酶活。

从酶活高低和酶活稳定性看，添加聚丙二醇的效果更优于添加其他活性剂的效果，表面活性剂以添加聚丙二醇效果较好，添加量以0.10％~0.15%为佳。

2.7培养温度对产酶的影响优化培养基I 接种后分别在恒定29℃和36h 前培养箱温度29℃，36h 后27℃试验其对产酶的影响，培养至72h 测定酶活力，结果见表3。

从表3可以看出，36h 前培养箱温度29℃，36h 后27℃比恒定29℃酶活有了明显提高，可能是菌丝体布满培养基后降低培养温度有利于菌体产生孢子，使酶活有了明显提高。

2.8正交试验进一步优化培养基通过上述单因子试验，可以看出碳源确定后，氮源、磷酸盐、硫酸镁和聚丙二醇对产酶酶活均有较大的影响。

为此，运用正交试验对以上4个因素进行处理，采用L 9（34）正交表。

按下表安排试验，共做9个试验。

在基础产酶培养基中，除了改变以上4个因素之外，其他成分不变，接种孢子MgSO 4·7H 2O/%酶活/（U ·g -1)图3硫酸镁添加量+对产酶的影响Figure 3.Effect of MgSO 4concenration on xylanase production1401201008060402000.51.01.52.01901801701601501401300.050.100.150.200.25酶活/（U ·g -1)表面活性剂/%图4添加表面活性剂对产酶的影响Figure 4.Effect of surfactant concenration on xylanase productionPEG4000油酸钠司盘聚丙二醇项目ExperienceExchanges1002009年第4期中国酿造总第205期··表6优化培养基验证试验Table 6.Validation of orthogonal experiment for optimizing culture medium酶活/（U ·g -1）113.20165.42200.34项目基础培养基优化培养基I 最终优化培养基图5效应曲线图Figure 5.Graph of orthogonal experiment表5正交试验结果Table 5.Table of orthogonal experiment试验号A B C D 酶活/（U ·g -1）11111161.4621222151.5531333130.9442123148.4052231174.0862312130.9473132149.5483213147.2393321194.53K 1147.98153.13146.54176.69K 2151.14157.62164.83144.01K 3163.77152.14151.52142.19R15.795.4818.2934.50表4正交试验因素、水平设计表Table 4.Factors and levels of orthogonal experiment 120.500.500.10230.75 1.000.15341.001.500.20A BC D（NH 4）2SO 4/%KH 2PO 4/%M gSO 4·7H 2O/%聚丙二醇/%水平A 1A 2A 3B 1B 2B 3C 1C 2C 3D 1D 2D 3200190180170160150140130120110液1mL ，36h 前培养箱温度29℃，36h 后27℃培养至产酶高峰期第72h 测定酶活力，结果见表5。