克雷伯脂肪酶产生菌产酶条件优化及其粗酶性质研究
江苏农业科学２０１０年第４期 ・－——３５５－－——
谭有将，谢小燕，王群，等．克雷伯脂肪酶产生菌产酶条件优化及其粗酶性质研究［Ｊ］．江苏农业科学，２０１０（４）：３５５—３５７
克雷伯脂肪酶产生菌产酶条件优化及其粗酶Ｉ生质研究
谭有将，谢小燕，王群，陈 芳，高剑锋
（石河子大学生命科学学院，新疆石河子８３２００３）
摘要：对本实验室分离的１株产脂肪酶克雷伯氏菌Ａ２（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｓｐ．Ａ２）的产酶条件进行优化，并对其粗酶性质
进行初步的研究，为该酶的进一步开发利用奠定一定基础。该菌的最佳产酶培养基为（ｍ／Ｖ）：蛋白胨１．０％，ＭｇＳＯ ・
７Ｈ２Ｏ ０．０５％，Ｋ２ＨＰＯ４ １．０％，ＫＨ２ＰＯ４ ０．４５％，２．０％的菜籽油。发酵条件：ｐＨ值６．５～７．５，２８℃，２００ ｒ／ｍｉｎ摇床振荡
培养３ ｄ。酶学性质表明：该酶的最佳催化温度和最适催化ｐＨ值分别为４０℃和ｐＨ值８．０，该酶的热稳定性较差，在
６０℃保温１ ｈ时丧失５０％的活性。Ｍｇ ，ｃａ“和Ｋ 能刺激该酶的活性，而低浓度的ＥＤＴＡ和ＳＤＳ对该酶有明显的抑
制作用。
关键词：克雷伯氏菌；脂肪酶；酶学性质
中图分类号：Ｑ８１４．９ 文献标志码：Ａ 文章编号：１００２—１３０２（２０１０）０４—０３５５—０３
脂肪酶（１ｉｐａｓｅ，ＥＣ ３．１．１．３）是一类能水解脂肪的酶类， 能在有机溶剂中催化酯合、酯交换等一系列反应，因而在轻 工、化工、医药、食品等行业具有应用和潜在的应用前景…。
脂肪酶的来源非常广泛，在动物组织、植物的种子都有报道。
而微生物中的脂肪酶由于来源广泛，种类繁多，易于分离、纯 化且适于工业化生产而越来越受到了人们的重视 。 。因
此，寻找和分离能产生新型脂肪酶的微生物菌种成为当前脂
肪酶研究领域的热点之一，如徐同成等 从南极假丝酵母中
克隆表达了脂肪酶Ａ，张萌等 在内蒙古锡林浩特地区盐湖
菌种样品分离获得１株嗜盐脂肪酶高产菌并对其酶学性质做
了研究。本实验室从山东的油田分离鉴定了１株产脂肪酶的
克雷伯菌，现就其产酶条件及其酶性质做报道，以丰富脂肪酶 的来源及为该酶的进一步开发利用奠定基础。
１材料和方法
１．１ 菌种
克雷伯氏菌Ａ２（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｓｐ．Ａ２）分离自山东东营油田
附近，由本实验室保存。
１．２培养基及产酶条件优化
种子培养基：蛋白胨１０．０ ｇ／Ｌ，酵母膏５．０ ｇ／Ｌ，ＮａＣ１
１０．０ ｇ／Ｌ。发酵培养基：蛋白胨１０．０ ｇ／Ｌ，ＭｇＳＯ ・７Ｈ Ｏ
０．５ ｇ／Ｌ，Ｋ２ＨＰＯ １０ ｇ／Ｌ，ＫＨ ＰＯ ４．５ ｇ／Ｌ，菜籽油１０ Ｌ，ｐＨ
值为自然。
发酵条件：挑选单克隆菌落接种到种子培养基中，３Ｏ ｑＣ、
２００ ｒ／ｍｉｎ摇床培养过夜。按１．Ｏ％的接种量接种到５０ ｍＬ的
发酵培养瓶（２５０ ｍＬ三角瓶）中，３Ｏ ｏＣ、２００ ｒ／ｍｉｎ摇床培养
收稿日期：２００９—１１—１６ 基金项目：教育部促进与美洲、大洋洲地区科研合作与高层次人才培 养项目（编号：２００６ＪＣ１０）。 作者简介：谭有将（１９８５一），男，广西人，硕士研究生，主要从事生物
化学与分子生物学。Ｅ—ｍａｉｌ：ｔａｎ￣ｌ１１１＠１６３．ｃｏｍ。 通信作者：高剑锋，男，教授，博士生导师，主要从事生物化工和新能 源的相关研究。Ｅ—ｍａｉｌ：ｊｉａｎｆｅｎｇｇ＠ｓｈｚｕ．ｅｄｕ．ｃｎ。 ７２ ｈ。 １．３粗酶制备及其酶活测定
将发酵好的培养基经４℃、１０ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心５ ｍｉｎ，倒掉 上清液，收集到菌体，用ｐＨ值７．０的ＰＢＳ溶液重悬菌体。重
悬的菌体在冰上，用功率为３００—４００ Ｗ、间隔为２ ｓ的超声波
破碎１ ｍｉｎ，即制得粗酶液。用于酶性质研究的粗酶还要进一
步用冷冻干燥剂冷冻干燥为粉末状，然后溶于一定量的无菌
去离子水中。 酶活性测定按照文献［３］进行。脂肪酶活性定义为：在
测定条件下，每１ ｍｉｎ释放出１ Ｎｍｏｌ脂肪酸的酶量定义为１
个酶活单位（ｕ）。相对酶活是指在实验中所测得的酶活力值
与最高酶活力值的百分比。
２结果与分析
２．１ 酶的优化 ２．１．１不同碳源对产酶的影响将种子液接种到以葡萄糖、
蔗糖、可溶性淀粉、橄榄油、大豆油和菜籽油为唯一碳源的发
酵培养基上培养３ ｄ，观察不同碳源对产酶的影响，结果如表
１所示。从表１可以看出，以有机碳源为唯一碳源时，脂肪酶 的产量比无机碳源高出许多。其中以大豆油和菜籽油为唯一
碳源时，酶产量最高。因为菜籽油在新疆较容易获得，所以以
后采用菜籽油发酵。
表１不同碳源对产酶的影响
注：培养基（ｍ／Ｖ）为（ＮＨ４）２ＳＯ４ １．Ｏ％，ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．０５％
Ｋ２ＨＰＯ４ １．０％，ＫＨ２ＰＯ４ ０．４５％，１．Ｏ％的各种碳源。ｐＨ为自然
３０℃、２００ ｒ／ｍｉｎ摇床振荡培养３ ｄ。
２．１．２ 不同碳源浓度对产酶的影响 以１．０％的
（ＮＨ ） ｓＯ 为唯一氮源，在培养基中添加不同浓度的菜籽 油，培养发酵３ ｄ，
观察它对产酶的影响，结果如图１所示。从 ．－——３５６－－—— 江苏农业科学２０１０年第４期
４．０ —３．５ ３．０
Ｏ．５ Ｏ 菜籽油浓度（％） 图ｌ 不同浓度的菜籽油对产酶的影响
注：培养基（ｍ／Ｖ）为（ＮＨ ）２ＳＯ １．０％，ＭｇＳＯ４－７Ｈ２０ ０．０５％，
Ｋ ＨＰＯ １．０％，ＫＨ２ＰＯ４ ０．４５％，不同浓度的菜籽油。ｐＨ值自然，
３Ｏ℃、２００ ｒ／ｒａｉｎ摇床振荡培养３ ｄ。
图１可以看出：在较低的菜籽油浓度时，菌体生长缓慢，产酶
量不高；但是当高浓度的菜籽油浓度时，同样会抑制脂肪酶的
产量；菜籽油浓度在２．０％时，脂肪酶的产量最高。
２．１．３ 不同氮源对产酶的影响 以２．０％的菜籽油为唯一 碳源，在发酵培养基中分别加入１．０％的（ＮＨ ） ＳＯ 、
ＮＨ４ＮＯ 、蛋白胨、酵母粉、玉米粉等不同的氮源，发酵培养
３ ｄ，观察对产酶的影响。从结果（表２）可以看出，用蛋白胨
发酵时脂肪酶产量最高。
表２不同氮源对产酶的影响
项目 氮源（１．Ｏ％）
蛋白胨 酵母粉ＮＨ４ＮＯ３（ＮＨ４）２ＳＯ４玉米粉 酶活性（ｕ） ５．２０ ４．１０ ２．１０ ３．００ ３．７０ 注：培养基（，ｎ／Ｖ）为菜籽油２．０％，ｌ￣ＩｇＳ ・７Ｈ２０ ０．０５％，
Ｋ２ＨＰＯ４ １．Ｏ％，ＫＩｔ２ＰＯ４ ０．４５％，１．Ｏ％的各种氮源。ｐＨ自然，３０℃、 ２００ ｒ／＇ｍｉｎ摇床振荡培养３ ｄ。
２．１．４不同氮源浓度对产酶的影响 以２．０％的菜籽油为
唯一碳源，在培养基中分别添加不同浓度的蛋白胨，发酵培养
３ ｄ，观察其对产酶的影响，结果如图２所示。从图２可以看
出，不同浓度的蛋白胨对产酶也有一定的影响，蛋白胨浓度为
１．Ｏ％时其产酶效果最佳。
蛋白胨浓度（％） 图２ 不同蛋白胨浓度对酶活的影响
注：培养基（ｍ／Ｖ）为菜籽油２．０％，Ｍｇｓｏ ・７Ｈ ０ ０．０５％
Ｋ ＨＰ １．Ｏ％，ＫＩｔ ＰＯ ０．４５％，不同浓度的蛋白胨。ｐＨ值自然
３０ 、２００ ｒ／ｒａｉｎ摇床振荡培养３ ｄ。
２．１．５ 不同初始ｐＨ值对产酶的影响 在最佳碳源和氮源
浓度下研究不同初始ｐＨ值对产酶的影响，结果如图３所示。 从图３中可以看出：不同的ｐＨ值对菌体的生长有很大影响，
同时也影响了脂肪酶的产量；ｐＨ值７．５时，产酶量达到最大，
为６．２３ Ｕ／ｍＬ。 ２．１．６不同温度对产酶的影响温度影响着细菌的分裂繁 ７ ６ Ｓ ５
４ 蜒３ 鞋２
１ ０ ４．５ ５．５ ６．５ ７．０ ７．５ ８．０ ８．５ ９．５ ｐＨ值 图３：￣Ｎｐｎ值对产酶的影响
注：培养基（ｍ／Ｖ）为菜籽油２．Ｏ％，Ｍｇｓ ・７Ｈ２Ｏ ０．０５％， Ｋ２ＨＰＯ １．０％，ＫＨ：ＰＯ ０．４５％，１ ０％的蛋白胨。不同的ｐＨ值下
３Ｏ℃、２００ ｒ／ｍｉｎ摇床振荡培养３ ｄ。
ｓ
藿
温度（℃） 图４ 不同温度对产酶的影响
注：培养基（ｍ／Ｖ）为菜籽油２．０％，Ｍｇｓｏ ・７Ｈ２０ ０．０５％，
Ｋ ＨＰＯ １．Ｏ％，ＫＨ２ＰＯ ０．４５％，１．Ｏ％的蛋白胨。ｐＨ值７．５、不同的
温度下２００ ｒ／ｍｉｎ摇床振荡培养３ ｄ。
殖，同时也是影响脂肪酶产量的重要因素。我们测定了不同
温度下，Ａ２菌株的脂肪酶产量。结果（图４）可以看出，和大
多数产脂肪酶菌株一样，Ａ２菌株在温度为２８—３０℃之间的
产脂肪酶含量最高，到达７．２３ Ｕ／ｍＬ。
２．２粗酶性质的研究
在最佳发酵条件下发酵３ ｄ，发酵液经４℃离心收集菌
体。菌体经超声波破碎后，于冷冻（一５０℃）真空干燥机干燥
后，用无菌的去离子水做适当稀释，此即为用于酶学性质研究
的粗酶液。 ２．２．１ 酶的最适作用温度 在不同温度下测定脂肪酶的催
化活性，结果（图５）可见：脂肪酶的最佳催化温度为４ｏ℃，在 ４０—５Ｏ℃之间保留有较高的催化活性。
一
一
艇 逝 簧 靶
温度（℃） 图５ 酶的最佳催化温度
２．２．２酶的最适作用ｐＨ值将酶置于不同的ｐＨ值（４．０—
１０．０）下观察不同ｐＨ值条件对酶催化活性的影响。结果（图
６）可以看出，该脂肪酶对ｐＨ很敏感，在低ｐＨ值条件（４．０—
７．０）和高ｐＨ值条件（８．５—１０．０）下酶的催化活性都不高，而
在中度偏碱（７．０～８．０）时酶保有较高的催化活性。
谭有将等：克雷伯脂肪酶产生菌产酶条件优化及其粗酶性质研究 一３５７一
，、 、．，
媳 龌
ｐＨ值 图６ 酶的最佳催化ｐＨ值条件
２．２．３ 酶的热稳定性研究将一定量的酶液置于４０～８０℃ 的温度中保温１ ｈ，以未经处理的酶液作为对照，观察温度对
酶的稳定性的影响（图７）。结果表明该酶的热稳定性较差，
在６０℃的时就只剩下了５０％的酶活，在８０℃保温１ｈ后该
酶完全失去活力。
一 一 塑 嫂 落 莨 １Ｏ０
８Ｏ
６０
４０
２Ｏ
Ｏ
温度（℃） 图７酶的热稳定性研究
２．２．４各种离子及螯合剂对酶的影响据报道，脂肪酶活性
的维持需要金属离子，有的脂肪酶在经透析去除离子后，发生
了不可逆转变性。本研究将冷冻干燥的酶用去离子水溶解
后，以橄榄油乳化液：去离子水（５：４）为基本的催化底物。
将各种离子或螯合剂加入到基本催化底物中以研究对酶活性
的影响，结果（表３）表明Ｍｇ“、ｃａ“和Ｋ 等金属离子对酶
活性具有刺激作用，其他金属离子不影响该酶的活性，而ＥＤ— ＴＡ和ＳＤＳ等螯合剂对酶活性具有抑制作用。
表３ 不同离子和螯合剂对酶活性的影响
催化条件：ｐＩ４值７．５，各种不同的添加剂，温度４Ｏ℃，催化时间 １０ ｍｉｎ。 ・ ３讨论
目前报道的大多数细菌脂肪酶多为胞外酶 ｊ，而胞内酶
的报道在国内外很少见。本实验室２００８年自山东东营油田
附近分离了１株高产胞内脂肪酶的克雷伯菌Ａ２（ＫｌｅｂｓｉｅＵａ ｓｐ Ａ２）。这是我国首次从克雷伯菌属中分离到产脂肪酶的菌
株，本研究对该菌株的产酶条件进行优化，并对其粗酶性质做
了初步的探索，以期为该酶的进一步开发利用奠定基础。
研究发现，Ａ２菌株在以葡萄糖等通常被认为是速效碳源 作为唯一碳源时，菌体生长缓慢，脂肪酶产量也不高。而在以 菜籽油等油脂类作为唯一碳源时，菌体生长迅速，且脂肪酶产
1,3-丙二醇的研究进展
1,3-丙二醇的研究进展
摘 要:作为合成许多缩聚物单体的1,3-丙二醇（1,3-propanediol,1,3-PDO）是本世纪具有广阔市场潜力的化工原料，在化工、医药、食品等领域具有广泛的应用。目前，1,3-丙二醇主要由化学法生产，但化学法消耗了不可再生的有限资源，并造成了环境污染。近年来，生物转化法以其利用可再生资源、对环境友好等特点日益受到人们的重视。介绍了1,3-丙二醇氧化还原酶在1,3-PDO生产菌代谢途径中的作用，着重综述了PDOR的基因克隆表达情况及1,3-PDO生物法生产中工程菌的研究进展。同时对1,3-PDO生物法生产中下游分离和中试研究进行了的介绍，并展望了生物法生产1,3-PDO的前景。
关键词：1,3-丙二醇；1,3-丙二醇氧化还原酶；克隆表达；发酵法；下游分离
Abstract: As a monomer for polycondensations to produce polyesters, polyethers and
polyurethanes, 1, 3-PDO is an essential chemical material with a prosperous market
potential in this century and has been widely used in the fields of chemical industry,
medicine, food and so on. Presently, 1,3-PDO is mainly produced by chemical routes，which consume unrenewable feedstock and pollute the environment．Bioconversion is
particularly attractive in that it typically uses renewable feedstock and does not generate
产蛋白酶菌的筛选及产酶条件优化
大庆师范学院
本科生毕业论文
蛋白酶产生菌培养条件的条件优化
院(部)、专业 生命科学学院 生物技术
研 究 方 向 微生物学
学 生 姓 名 朱琳
学 号 200901122598
指导教师姓名 张亦婷
2013年 06月 01日大庆师范学院本科生毕业论文
1 摘 要
采用大庆师范学院生命科学学院花园附近土壤、农田土壤及体育场附近土壤作为样品，并从中筛选分离并得到产蛋白酶能力较高的菌株，经过初步鉴定该菌株属芽孢杆菌。通过对其产酶条件进行优化，结果显示该菌产酶最佳碳源为质量浓度15g/L的乳糖，最佳氮源为质量浓度20g/L的尿素，最适初始pH值为6.5，最适发酵温度为35℃。
关键词：菌种筛选；鉴定；蛋白酶；条件优化
大庆师范学院本科生毕业论文
1 2 Abstract
The sewage treatment plant soil near east institute, soil and soil samples near
farms .Using milk hydrolysis circle screening model separating screening in high ability
get protease whr1 strains. Preliminary appraisal of the fungus belong to bacillus. After
the optimization of the condition, the capability of whr1 was improved, the optimal
condition is: carbon source is sucrose 15g/L; nitrogen source is Yeast extract 20g/L, the
脂肪酶特性与应用
饲料研究FEED RESEARCH NO.6,2011
5科学试验与研究
脂肪酶特性与应用
陈倩婷
广州博仕奥集团
饲料资源不足一直是我国养殖业面临的一个
大问题，在耕地和水资源严重紧缺的情况下，粮
食产量很难提高。我国动物生产中饲料转化率低，
猪、鸡和奶牛等的饲料转化率均比国际先进水平低
0.3 %~0.6 %，使饲料资源不足的问题更加严峻。饲
料用酶制剂的开发和应用极大的缓解了饲料资源的
不足，酶制剂在饲料工业中的有效应用使得饲料工
业和养殖业安全、高效、环保和可持续发展成为可能。
目前研究较多的饲用酶制剂有蛋白酶、甘露聚
糖酶、β-葡聚糖酶、木聚糖酶、纤维素酶及植酸
酶等。脂肪酶也是一种重要的酶制剂，它能够水解
脂肪（三脂酰甘油或三酰甘油）为一酰甘油、二酰
甘油和游离脂肪酸，最终产物是甘油和脂肪酸。
产物脂肪酸为动物体生长和繁殖提供能量，部
分中链脂肪酸能抑制肠道有害微生物，改善肠道菌
落环境，从而促进消化，起到类似抗生素的作用，
脂肪酶在常温常压下反应，反应条件温和，转化率
高，具有优良的立体选择性，不易产生副产物，避
免因化学催化法而带来的有害物质，不会造成环境
污染，因此，在食品、皮革、医药、饲料和洗涤剂
等许多工业领域中均有广泛的应用。
1 脂肪酶的特性
1.1 脂肪酶的来源
脂肪酶按其来源主要分为3类：1）动物源性
脂肪酶，如：猪和牛等胰脂肪酶提取物；2）植物
源脂肪酶，如：蓖麻籽和油菜等；3）微生物源性
脂肪酶。由于微生物种类多、繁殖快且易发生遗传
变异，具有比动植物更广的作用pH、作用温度范
围及底物专一性，且微生物来源的脂肪酶一般都是
分泌性的胞外酶，所以，微生物脂肪酶是主要的研
究对象。产微生物脂肪酶菌种的研究主要集中在真菌包括，根霉、黑曲霉、镰孢霉、红曲霉、黄曲霉、
毛霉、犁头霉、须霉、白地霉、核盘菌、青霉和木霉；
其次是细菌，如：假单胞菌、枯草芽抱杆菌、大肠
杆菌工程菌、无色杆菌、小球菌、发光杆菌、黏质
赛氏杆菌、无色杆菌、非极端细菌和洋葱伯克霍尔德
一株产低温碱性脂肪酶菌株的发酵条件优化
第１９卷第４期 ２０１０年８月 激光生物学
ＡＣＴＡ ＬＡＳＥＲ Ｂ１０ＬＯＧＹ 报 ＳＩＮＩＣＡ Ｖ０ ．Ｉ９ Ｎ．，．４ Ａｕｇ．２０１０
ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００７－７１４６．２０１０．０４．０１９
一株产低温碱性脂肪酶菌株的发酵条件优化
陈锋菊 ’
（湖南第一师范学院小教大专部，湖南长沙４１０００２）
摘 要：对一株产低温碱性脂肪酶细菌（Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ ｓｐ．ＢＪ１７）的发酵条件进行了优化，研究各种碳源及 氮源对产酶的影响，应用正交实验优化其发酵培养基组成。结果表明：最佳培养基组成为淀粉１２ ｇ／Ｌ，蛋白胨 １２ ｇ／Ｌ，酵母膏３ ｇ／Ｌ，酪蛋白２ Ｌ。最佳培养温度为２５℃，发酵时间为１６ ｈ。 关键词：低温脂肪酶；酶学性质；发酵条件；优化
中图分类号：Ｑ５５ 文献标识码：Ａ
文章编号：ｌ００７ １４６（２０１０）０４－０５１６－０５
Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ
ａ Ｌｏｗ－－Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ Ｌｉｐａｓｅ—Ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｓｔｒａｉｎ
ＣＨＥＮ Ｆｅｎｇ＿ｊｕ （Ｐｒｉｍａｒｙ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ，Ｈｕｎａｎ Ｆｉｒｓｈ Ｎｏｒｍａｌ ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｃｈａｎｇｓｈａ ４１０００２，Ｈｕｎａｎ，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ｐｓｅｕｄｏａｈｅｒｏｍｏｎａｓ ｓｐ．ＢＪ１７ ｗｅｒｅ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ．Ｔｈｅ ｏｐｔｉ・ ｍａｎ ｍｅｄｉｕｍ（ｐｅｒ ｌｉｔｅｒ）ｗａｓ ｃｏｎｓｉｓｔｅｄ ｏｆ １２ ｇ ｓｔａｒｃｈ，１２ ｇ ｐｅｐｔｏｎｅ，３ ｇ ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ，２ ｇ ｃａｓｅｉｎ．Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｆｅｒｍｅｎ— ｔａｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ａｓ ｆｏｌｌｏｗｓ：ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ２５℃，ａｎｄ ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ １６ ｈ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｃｏｌｄ—ａｄａｐｔｅｄ ｌｉｐａｓｅ；ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｐｒｏｐｅ￣ｙ；ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ；ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ
生物柴油脂肪酶产生菌的筛选及培养条件研究
第２ｏ卷第１期 ２０１０年２月 茂名学院学报
ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＭＡＯＭ Ｇ ＵＮⅣＥＲＳｎＹ Ｖ０１．２０ Ｎｏ．１ Ｆｅｂ．２０ｏ９
生物柴油脂肪酶产生茵的筛选及培养条件研究
韩寒冰，李松佳，沈伟煌，彭翠苹，吴小梅
（茂名学院化学与生命科学学院，广东茂名５２５００ｏ）
摘要：从长期被脂肪油脂污染的土壤中分离得到能够以橄榄油为唯一碳源和能源的脂肪酶产生菌，通过在含有演．甲酚紫的 培养基培养筛选一株脂肪酶活力最强的菌株，经显微镜观察和生理生化实验，初步鉴定为巨大芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌａｃ ｍｅｇａｔｅｒｉ－ ｕｎ１）。在ｐＨ７．０，橄榄油浓度在８１２ｍｇ／Ｌ和以１．５％蛋白胨为氮源的培养条件下三天，脂肪酶的活力最大，达到１９．３Ｕ／ｍＬ。 关键词：脂肪酶菌；酶活力；生物柴油 中图分类号：Ｑ８１５ 文献标识码：Ａ 文章编号：１６７１—６５９０（２ｏ１Ｏ）０ｌ一００１２—０３
生物柴油具有无毒、能生物降解、不含芳香烃且含硫量很低、可以以任意比例与石油柴油混兑的特点。 开发生物柴油不仅有利于减小大量进口对我国的能源安全造成的威胁；还对实现经济可持续发展，推进能
源替代，减轻环境压力等具有深远的经济与社会效益。酶法制备生物柴油具有化学催化法不可比拟的优
越性，是工业化生产的发展方向…。生物柴油是由动植物油脂与醇经酯交换反应而得的脂肪酸单烷基酯，
最典型的生物柴油是脂肪酸甲酯。脂肪酶（“ｐａｓｅ，Ｅ Ｃ．３．１．１．３）是指分解或合成高级脂肪酸与丙三醇 形成甘油三酸酯酯酶，在催化合成生物柴油的研究中已获得应用【２Ｉ３】，但生产中酶的成本过高、甲醇和甘
油对酶的毒害作用这两大问题还未能得到根本性的解决，使得生物酶法一直不能在工业生产上得到推广 应用。因此，通过筛选或是利用基因工程技术对现有的脂肪酶产生菌进行改造，以获取催化活性更高、对
短链醇耐受能力更强的脂肪酶，深入研究脂肪酶的固定化方法和研究影响脂肪酶活性的条件，为实现工业 化生产提供依据。
脂肪酶
脂肪酶催化
药物合成
院系： 化工学院
班级： 2009级制药工程2班
学号： 20009650818
姓名： 李红霞
脂肪酶催化药物合成
摘要：将脂肪酶固定化可提高酶的选择性、稳定性等，已广泛应用于手性拆分等研究。常用的高分子固定化载体有聚丙烯酸多孔树脂及带功能基团的共聚物等。从脂肪酶结构的角度介绍其手性拆分机理，并具体讨论了一些商品化固定化脂肪酶在手性拆分中的应用及固定化载体材料对手性拆分的影响。
关键词：脂肪酶；酶催化；手性拆分；药物合成；应用
一、综述
脂肪酶（Triacylglycerol lipase E C3.1.1.3）是广泛存在的一种酶，在脂质代谢中发挥重要的作用。在油水界面上，脂肪酶催化三酰甘油的酯键水解，释放更少酯键的甘油酯或甘油及脂肪酸。脂肪酶结构有2个特点：(1) 脂肪酶都包括同源区段：His-X-Y-Gly-Z-Ser- W-Gly或Y-Gly-His-Ser-W-Gly (X、Y、W、Z是可变的氨基酸残基)；(2) 活性中心是丝氨酸残基，正常情况下受1个α-螺旋盖保护。脂肪酶的特性脂肪酶底物专一性酶的底物专一性取决于酶分子结构，脂肪酶分子由亲水、疏水两部分组成。活性中心靠近分子疏水端。不同来源的脂肪酶存在着结构上的差异，使得不同的来源的脂肪酶有不同的底物专一性。
1.1来源
脂肪酶广泛的存在于动植物和微生物中。植物中含脂肪酶较多的是油料作物的种子，如蓖麻籽、油菜籽，当油料种子发芽时，脂肪酶能与其他的酶协同发挥作用催化分解油脂类物质生成糖类，提供种子生根发芽所必需的养料和能量；动物体内含脂肪酶较多的是高等动物的胰脏和脂肪组织，在肠液中含有少量的脂肪酶，用于补充胰脂肪酶对脂肪消化的不足，在肉食动物的胃液中含有少量的丁酸甘油酯酶。在动物体内，各类脂肪酶控制着消化、吸收、脂肪重建和脂蛋白代谢等过程；细菌、真菌和酵母中的脂肪酶含量更为丰富(Pandey等)。由于微生物种类多、繁殖快、易发生遗传变异，具有比动植物更广的作用p H、作用温度范围以及底物专一性，且微生物来源的脂肪酶一般都是分泌性的胞外酶，适合于工业化大生产和获得高纯度样品，因此微生物脂肪酶是工业用脂肪酶的重要来源，并且在理论研究方面也具有重要的意义。
产蛋白酶菌的分离鉴定及产酶条件优化
产蛋白酶菌的分离鉴定及产酶条件优化
王鼎;余淼;付洋洋;郭春华;彭忠利;高彦华
【摘 要】This research isolated protease-producing strain from cattle
rumen,16 strains were selected by the casein hydrolysis bined
HE value and protease activity,a strain(named A18)with the mighest
activity of proteinase(415.82 U/mL)as the test strain.And it was identified
as Aspergillusoryzae by morphological observation and 18S rDNA
sequence analysis.We got the inoculation amount 4%,the optimum
temperature 30 ℃,time 60 h through the single factor test.By the response
surface analysis(RSA)methods and repeated experiments,the optimal
fermentation conditions were determined as follows:inoculation quantity
4%,temperature 29 ℃, time 55 h.The highest enzyme activity reached
527.57 U/mL,which increased by 22.6% than before optimization.%本试验菌源取自肉牛瘤胃液,首先用酪蛋白水解圈法初选出16株产蛋白酶菌株,综合HE值和蛋白酶活性,选出一株蛋白酶活性最高A18作为后续试验菌株,该菌株蛋白酶活为415.82 U/mL,通过形态和分子鉴定确定此菌株为米曲霉菌.单因素试验确定接种量为4%、培养温度为30℃、培养时间为60 h,通过响应面分析法及多次重复试验,得出接种量4%、温度29℃、时间55 h为其最佳产酶条件,最高酶活达527.57
脂肪酶及其在饲料工业中的应用研究进展
脂肪酶及其在饲料工业中的应用研究进展
刘德海;解复红;贾彬;权淑静;马焕
【摘 要】脂肪酶是一种重要的工业用酶,在食品、化工、纸浆、饲料工业等领域广泛应用,脂肪酶主要来源是微生物脂肪酶.对脂肪酶的来源、性质、生产、检测及在饲料工业中的应用研究进行了概述.%Lipase is a kind of important enzyme for
industry application. It is widely used in food, chemistry, paper and feed
industry. It is the major source in production of lipase by microbial
fermentation. This paper summarized the source, character, producing,
detection and application in feed of lipases.
【期刊名称】《河南科学》
【年(卷),期】2012(030)007
【总页数】4页(P878-881)
【关键词】脂肪酶;应用;饲料工业
【作 者】刘德海;解复红;贾彬;权淑静;马焕
【作者单位】河南省科学院生物研究所有限公司,郑州450008;河南省工业酶工程技术研究中心,郑州450008
【正文语种】中 文
【中图分类】Q556+.2
脂肪酶又称甘油酯水解酶，能够催化天然底物油脂的分解，生成脂肪酸、甘油和甘油单酯或二酯.脂肪酶是一类特殊的酯键水解酶，其天然底物是生物产生的天然油脂，是最早被研究的酶类之一，作用于异相系统，即在油水界面上水解脂肪酸甘油酯，而且只有当底物以微粒、小聚合分散状态或成乳化颗粒时，脂肪酶对底物水解才有显著的催化作用.自1834年兔胰脂肪酶活性的报道至今，有关脂肪酶的研究已存在上百年的历史[1]，20世纪初国外科研人员首次发现了微生物脂肪酶，我国脂肪酶的研究有40多年的历史，20世纪60年代才有报道，1967年，中国科学院微生物研究所筛选得到一株解脂假丝酵母（Candida Lipolytica）As2.1203，并于1969年制成酶制剂投放市场[2]；20世纪70年代末我国开始碱性脂肪酶的研究，施巧勤（1981）[3]国内首次报道了有关碱性脂肪酶生产菌（Penicillium
海洋细菌Sphingomonas_sp._Q2产琼胶酶发酵条件优化、酶学性质及降解产物研究
钱洗谦，乔乐克，张洪锋，等. 海洋细菌Sphingomonas sp. Q2产琼胶酶发酵条件优化、酶学性质及降解产物研究[J]. 食品工业科技，2023，44（18）：139−146. doi: 10.13386/j.issn1002-0306.2022090058QIAN Xiqian, QIAO Leke, ZHANG Hongfeng, et al. Optimization of Fermentation Conditions, Enzymatic Properties and DegradationProducts of Agarase Produced by Marine Bacterium Sphingomonas sp. Q2[J]. Science and Technology of Food Industry, 2023, 44(18):139−146. (in Chinese with English abstract). doi: 10.13386/j.issn1002-0306.2022090058 · 生物工程 ·
海洋细菌Sphingomonas sp. Q2产琼胶酶发酵
条件优化、酶学性质及降解产物研究
钱洗谦1，乔乐克2，张洪锋3，江晓路4，王 鹏1，张京良2,4, *（1.中国海洋大学食品科学与工程学院，山东青岛 266003；2.青岛海洋生物医药研究院，山东青岛 266100；3.青岛海莱美生物科技有限公司，山东青岛 266400；4.中国海洋大学医药学院，山东青岛 266003）
摘 要：本研究旨在对从江蓠中筛选获得的Sphingomonas sp. Q2菌株产琼胶酶能力条件进行优化并对其酶学性质及降解产物进行研究。通过响应面法对发酵条件进行优化，采用硫酸铵沉淀、离子交换层析和凝胶层析等方法对发酵所得酶液进行纯化并对纯化后的酶液进行酶学性质研究。发酵优化结果表明该菌株产琼胶酶的最佳培养基组成为：琼脂4.42 g/L、磷酸氢二钾1.30 g/L、氯化钠10.51 g/L。优化后的酶活力为1085.71 U/mL，较优化前提高了1.58倍。纯化后的琼胶酶比活为112048.82 U/mg，纯化倍数为7倍，回收率为48.04%。酶学性质结果表明该酶最适反应温度为40 ℃，最适pH为6.5，且在最适温度下保存8 h，酶活仍保持在90%以上。MS和13C-NMR结果表明，该琼胶酶的降解产物主要为新琼四糖。该琼胶酶具有良好的热稳定性及较高的酶活力，为琼胶寡糖的开发制备提供了基础。关键词：Sphingomonas sp. Q2，琼胶酶，发酵优化，分离纯化，酶学性质，降解产物
YAG激光诱变选育产低温脂肪酶罗伦隐球酵母及产酶条件优化
第ｌｌ期（总第２２２期） №ｌｌ（ｓｅｒｉａｌ Ｉ￣２２２） 福建轻纺 ２００７年１１月 Ｕ ＆Ｔｅｘｔｉｌ。ｅ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ ｏｆ Ｆｕｊｉ￣ｍ ＮＯＶ．２００７
ＹＡＧ激光诱变选育产低温脂肪酶罗伦隐球酵母及产酶条件优化
章文贤，蒋咏梅，施巧琴，吴松刚
（福建师范大学生命科学学院，福建福州３５０００７）
摘要：对产低温脂肪酶的罗伦隐球酵母进行ＹＡＧ激光诱变育种，并对突变株Ｙ一１ｌ的产酶条件
进行优化。得到其最佳发酵条件为：豆饼粉３．０％，麸皮１．０％，（ＮＨ ＰＯ ０．５％，Ｍ ０４‘ ７Ｈ２００．０５％，ＣａＣ１ ２．２Ｈ２Ｏ０．１％，初始ｐＨ５．５，发酵温度２８℃，发酵时间３２ｈ，酶活可达到 ３５．６Ｕ／ｍｌ。比原始菌株提出来高了１．５倍。 关键词：ＹＡＧ激光；低温脂肪酶；罗伦隐球酵母；菌种选育
中图分类号：ＴＱ９２５ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００７—５５０Ｘ（２００７）１１—０００１—０６
脂肪酶（ＥＣ３．１－１３）是工业酶制剂中重要的酶类。广泛应用于食品加工、轻工产品脱脂、洗涤 剂、制药、造纸工业等领域 １． ，但是脂肪酶的应用往往受酶本身性质所局限。因此寻找具有特殊性
质的脂肪酶具有重要的意义。低温脂肪酶具有酶的活化能和反应最适温度较低的优势，在工业应 用中可以节约能源和保护环境。具有低温活性脂肪酶已成为酶学应用研究新的热点Ⅲ 。在已建立
的极端环境脂肪酶菌种库的基础上 ，对一株产低温酸性脂肪酶的罗伦隐球酵母进行ＹＡＧ激光诱 变选育，并对其产酶条件进行优化。
１材料和方法
１．１ 菌种 从取自青海鸟岛的土样中筛选得到，编号Ｌ１１２，经中国科学院微生物研究所鉴定为罗伦隐球
￣（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｕｒｅｎｔｉｉ（Ｋｕｆｆｅｒａｔｈ）Ｃ．Ｅ．Ｓｋｉｎｎｅｒ））。 １．２仪器 ＹＡＧ激光器（华中理工大学，ＺＳＭ—Ｉ型，１０６０ｒｉｍ，０—７ｏｗ），光纤输出。 １．３培养基 １．３．１斜面培养基：ＰＤＡ培养基。 １．３＿２分离培养基（％）：葡萄糖２．０，Ｋ２ＨＰ０４＂３Ｈ２００．６，（ＮＨ ｈｓｏ ０．１，Ｍ Ｏ４・７Ｈ２Ｏ０．０５