产蛋白酶菌的筛选及产酶条件优化
蛋白酶产生菌的分离汇总讲解
蛋白酶产生菌的分离、活化选育、发酵及酶活力的测定许多细菌和霉菌产生蛋白酶，细菌中的芽孢杆菌是常见的蛋白酶产生菌。
本实验将土壤样品悬液加热处理，杀死非芽孢细菌及其它微生物后进行划线分离得到芽孢杆菌，将其接种到酪蛋白平板进行培养，根据酪蛋白平板的水解圈做初筛。
也可直接将细菌或霉菌接种到酪蛋白平板进行培养，分离筛选其它蛋白酶产生菌。
本实验主要包括：蛋白酶产生菌的分离纯化、产酶微生物菌种的选育、产酶微生物的发酵与酶活力的测定、蛋白酶产生菌的生长及生长曲线、培养基优化。
通过本实验项目，使学生学会从自然界中分离蛋白酶产生菌的方法，菌种的纯化技术、高产菌的选育技术；了解蛋白酶产生菌的生长情况，学会绘制其生长曲线；学会培养基优化的方法；了解蛋白酶的性质及蛋白酶的测定原理；掌握蛋白酶的发酵及酶活力测定方法。
1 实验材料1.1 实验样品校园内土壤样品1.2实验仪器与材料牛肉膏蛋白胨培养基平板、酪蛋白平板、无菌水（带玻璃珠）、芽孢染色液番红；显微镜、恒温水浴锅、酒精灯、接种针、游标卡尺、无菌移液管、无菌试管、血球计数板、试管、三角烧瓶、烧杯、量筒、，玻棒、电子天平、牛角匙、高压蒸汽灭菌锅、pH试纸（ pH 5．5—9．0）、棉花、牛皮纸、记号笔、麻绳、纱布、培养皿、胶头滴管、分光光度计（应符合GB9721的规定）等。
2实验方法与步骤 2.1 培养基的配制方法1.称量按培养基配方比例依次准确地称药品放入烧杯中。
2.溶化在上述烧杯中可先加入少于所需要的水量，用玻棒搅匀，然后，在石棉网上加热使其溶解。
待药品完全溶解后，补充水分到所需的总体积。
3.调pH4.分装按实验要求，可将配制的培养基分装入试管内或三角烧瓶内。
5．包扎塞好棉花的试管和锥形瓶应盖上厚纸用绳捆扎，用记号笔注明培养基名称、组别、日期。
6．灭菌将上述培养基以1.02kg/cm2（15磅/英寸2），121．3℃， 15-20min高压蒸汽灭菌。
如因特殊情况不能及时灭菌，则应放入冰箱内暂存。
β-葡萄糖苷酶产生菌的筛选及产酶条件优化
β-葡萄糖苷酶产生菌的筛选及产酶条件优化
陈显玲;苏龙
【期刊名称】《中国饲料》
【年(卷),期】2024()9
【摘要】本研究从实验室构建的微生物菌库中筛选获得1株β-葡萄糖苷酶产生菌株HHL,结合ITS序列分析方法鉴定其为米曲霉(Aspergillus oryzae)。
以β-葡萄糖苷酶酶活为考察指标,通过单因素试验及正交试验对其产酶条件进行优化。
结果显示:菌株HHL最优产酶条件为以改良察氏培养基为培养基,pH 6.0,接种量8%,培养温度35℃,培养时间144 h。
此条件下,产β-葡萄糖苷酶酶活为48.74 U/mL。
【总页数】5页(P60-64)
【作者】陈显玲;苏龙
【作者单位】广西科技师范学院食品与生化工程学院
【正文语种】中文
【中图分类】S816.7
【相关文献】
1.转半乳糖基β-半乳糖苷酶产生菌筛选鉴定、产酶条件优化及酶法制备乳果糖
2.产α-葡萄糖苷酶抑制剂乳酸菌的筛选及发酵条件优化
3.β-葡萄糖苷酶产生菌的筛选及其所产纤维素酶酶系组成分析
4.产β-葡萄糖苷酶菌株的筛选及产酶条件优化
5.一株产β-葡萄糖苷酶甘草内生菌的筛选、全基因组分析及产酶优化
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蛋白酶产生菌细菌的分离与鉴定
蛋白酶产生菌细菌的分离与优化一、研究背景及进展蛋白酶已广泛应用在皮革、毛皮、丝绸、医药、食品、酿造等方面。
皮革工业的脱毛和软化已大量利用蛋白酶，既节省时间，又改善劳动卫生条件。
蛋白酶还可用于蚕丝脱胶、肉类嫩化、酒类澄清。
临床上可作药用，如用胃蛋白酶治疗消化不良，用酸性蛋白酶治疗支气管炎，用惮性蛋白酶治疗脉管炎以及用胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶对外科化脓性创口的净化及胸腔间浆膜粘连的治疗。
加酶洗衣粉是洗涤剂中的新产品，含碱性蛋白酶，能去除衣物上的血渍和蛋白污物，但使用时注意不要接触皮肤，以免损伤皮肤表面的蛋白质，引起皮疹、湿疹等过敏现象。
二、实验方案1 材料与方法1.1 材料1.1.1 菌株B1 分离自污水河的土壤；B9 为B1 物理诱变后所得的菌株。
1.1.2 药品弹性蛋白、刚果红弹性蛋白 Sigma 公司产品。
1.2 培养基1.2.1 细菌富集培养基(% W/V)蛋白胨1.0，酵母膏0.5，NaCl 1.0，pH7.0，121℃灭菌20min。
1.2.2 初筛培养基(% W/V)弹性蛋白0.80，葡萄糖0.10，酵母膏0.10，K2HPO4 0.10，KH2PO4 0.05，MgSO4·7H2O 0.01，pH7.0，115℃灭菌30min。
1.2.3 发酵培养基(% W/V)干酪素3.00，葡萄糖4.00，玉米提取液0.1，K2HPO4，0.20，MgSO4·7H2O 0.01，pH7.0，11℃灭菌30min。
1.3 胞外弹性蛋白酶产生菌的筛选方法1.3.1 细菌富集培养称取土样1 g ，加入细菌富集培养基中，送摇床培养，150r/min，37℃培养48h。
同时做两个平行实验。
1.3.2 分离将富集土壤悬液按每级稀释10 倍的次序得到10－ 3、10 － 4、10 － 5 的系列稀释液，再依次分别从各稀释度试管中各吸取0.2ml 稀释液，加到相应的培养皿内，用涂棒涂匀。
每个稀释梯度做两个平行试验，3 7 ℃培养箱倒置培养48h。
北京理工大学生物实验产蛋白酶菌种的分离与纯化
产蛋白酶菌种的分离与纯化--初筛一、目的要求1 学习蛋白酶产生菌的筛选方法。
2 掌握稀释涂布平板法从自然环境中分离纯化微生物的基本操作技术。
3 进一步熟练和掌握微生物无菌操作技术。
二、基本原理土壤是微生物生长的大本营，所含微生物无论是数量还是种类都是极其丰富的，因此土壤是微生物多样性的重要场所，是发掘微生物资源的重要基地，可以从中分离纯化得到许多有价值的菌株。
工业微生物菌种最初都来自于自然界。
但是自然界中微生物种类繁多，而且都是混居在一起的，要获得工业发酵菌株，首先必须把它们从混杂的微生物群体中分离出来。
从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。
常用的方法有：简单单细胞挑取法和平板分离法。
本实验用平板分离法。
平板分离法操作简便，普遍用于微生物的分离与纯化。
其基本原理包括两个方面：(1)选择适合于待分离微生物的生长条件，如营养，酸碱度，温度和氧等或加入某种抑制剂造成只利于该微生物的生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。
(2)微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落可以是由一个细胞繁殖而成的集合体。
因此可通过挑取单菌落而获得一种纯培养。
获取单个菌落的方法可通过稀释涂平板法或平板划线等技术完成。
值得指出的是从微生物群体中经分离生长在平板上的单菌落并不一定保证是纯培养。
因此纯培养的确定要经过一系列的分离与纯化过程和多种特征鉴定方能得到。
蛋白酶是一类重要的工业用酶制剂，它能将蛋白质分解成短肽甚至氨基酸。
根据三氯乙酸能将酪蛋白变性从而产生沉淀这一原理，可在平板培养基上直接筛选蛋白酶产生菌株。
产酶菌株能将酪蛋白水解成小分子物质，菌落周围不形成沉淀蛋白而出现透明圈，根据透明圈大小还能判断产酶活力。
三、实验器材与试剂1 样品土壤样品。
2 培养基酪素培养基配方如下：葡萄糖0.5gNaCl 5gK2HPO4 0.5gKH2PO4 0.5g干酪素10g蒸馏水1000ml琼脂20gpH 7.5115℃灭菌30min。
一株高产蛋白酶菌株的筛选及其产酶条件(
一株高产蛋白酶菌株的筛选及其产酶条件*林玩庄，林淑娜，陈汶聪，刘荣莲，黄可佳，黄丹敏，谢桂仁，陈宇豹，邓毛程，王瑶，李静广东轻工职业技术学院，广州，510300摘要：为了提高水产行业蛋白质资源的综合利用率，从南海海域大型鱼类的肠道中筛选蛋白酶高产菌株。
采用平板透明圈法和摇瓶发酵法进行筛选，获得一株蛋白酶高产菌株PE11。
通过菌体形态观察、生理生化实验和16S rDNA鉴定，菌株PE11被鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。
通过摇瓶发酵试验，优选出可溶性淀粉和牛肉膏分别为最佳的碳源和氮源，并确定菌株PE11产蛋白酶的最佳条件为：温度30 °C、初始pH7.0、转速200 rpm和时间36 h。
在最佳的产酶条件下，发酵液中的蛋白酶活力可达376 U/mL。
关键词：蛋白酶；高产；筛选；产酶条件Study on screening and enzyme-producing conditions of a highprotease producing strainLING Wan-zhuang, LING Shu-Na, CHEN Wen-cong, LIU Rong-lian, HUANG Ke-jia, HUANG Dan-min, XIE Gui-ren, CHEN Yu-bao, DENG Mao-cheng, WANG Yao, LI Jing(Guangdong Industry Technical College, Guangzhou 510300)Abstract：In order to improve the comprehensive utilization rate of protein resources from aquatic industry, strains having the ability to produce protease were isolated and screened from the gastrointestinal tract of large fish of South China Sea. Using flat transparent circle and shake flask fermentation test, a high producing protease strain PE11 was obtained. The strain PE11 was identified as Bacillus amyloliquefaciens through the systematic investigations of morphology, physiological and biochemical characteristics and 16S rDNA sequences analysis. By means of shake flask fermentation tests, the optimal carbon resource and nitrogen resource for strain PE11 were soluble starch and beef extract, respectively. In addition, the best conditions for protease-producing were determined as temperature of 30 °C, initial pH of 7.0 and rotation speed of 200 rpm. At the optimal condition, the highest protease activity of fermentation broth reached 376 U/mL.Key words：protease；high producing；screening；enzyme-producing condition*基金项目：广东高校特色调味品工程技术开发中心建设项目（GCZX-B1103），广东省教育部产学研结合项目（2012B091000040），广东轻工职业技术学院自然科学启动基金项目（KJ201307），广东轻工职业技术学院自然科学启动基金项目（KJ201203）。
赊店老酒大曲中耐高温霉菌的筛选与产酶条件优化
赊店老酒大曲中耐高温霉菌的筛选与产酶条件优化1. 引言1.1 背景介绍赊店老酒大曲是一种传统酿酒工艺中使用的主要发酵剂，其在酿造过程中起到很重要的作用。
在大曲中，存在着各种微生物，包括霉菌。
随着酿酒技术的不断发展，对大曲中微生物的特性和效果的研究也越来越重要。
随着现代酿酒工艺的快速发展，人们对赊店老酒大曲中耐高温霉菌的筛选和产酶条件优化的研究也越来越深入。
目前，针对这一问题的研究还比较有限，需要更多的实验和数据支持。
本研究旨在通过对赊店老酒大曲中耐高温霉菌的筛选和产酶条件优化的实验研究，深入了解其特性和作用机制，为酿酒工艺的改进提供科学依据和参考。
希望通过本研究的开展，能够为酿酒行业的发展和改进提供一定的帮助和指导。
1.2 研究目的研究目的旨在探究赊店老酒大曲中耐高温霉菌的筛选方法及产酶条件优化的实验研究。
通过对这些耐高温霉菌的筛选，可以深入了解其在酿造过程中的作用机制，为提高酒品质和生产效率提供科学依据。
优化产酶条件不仅可以提高酶活力，还可以减少生产成本，提高生产效率，对酒类生产行业具有积极的推动作用。
通过本研究可以为耐高温霉菌的利用和产酶条件的优化提供新的思路和方法，为酒类酿造工艺的改进和提升提供有力支持，对推动酒类产业的发展具有重要意义。
1.3 意义在食品工业中，霉菌是一种常见的微生物，对食品质量和安全产生重要影响。
赊店老酒大曲中的耐高温霉菌特别具有研究和应用的潜力。
通过对耐高温霉菌的筛选和相关产酶条件的优化研究，不仅可以深入了解赊店老酒大曲中微生物的多样性和功能，也有助于提高大曲的发酵效率和酒质量。
对耐高温霉菌的研究还能为探索其他食品中的耐高温菌种提供参考，拓展微生物资源的利用范围，推动食品工业的技术进步。
本研究具有重要的理论和应用意义，有助于促进食品工业的发展和提升产品质量。
2. 正文2.1 赊店老酒大曲的特点赊店老酒大曲是一种优质的传统酿造发酵剂，在中国酿酒业中拥有悠久的历史。
其主要特点包括以下几个方面：1. 发酵活性高：赊店老酒大曲中的微生物群落丰富，包括酵母菌、霉菌等多种微生物，在发酵过程中能够高效地将淀粉、蛋白质等底物转化为乙醇、香气等有机化合物，提高酒精发酵效率。
产酶条件优化
“产酶条件优化”资料合集目录一、耐低温降解纤维素菌株筛选、鉴定及产酶条件优化二、脂肪酶高产菌株筛选、产酶条件优化及脂肪酶大量纯化研究三、一株纤维素酶真菌的筛选鉴定及产酶条件优化四、纤维素酶产生菌的筛选、发酵产酶条件优化及酶学特性研究五、一株产纤维素酶的暹罗芽孢杆菌筛选及产酶条件优化六、烟草秸秆废弃物中纤维素降解菌的筛选、鉴定及产酶条件优化七、耐低温降解纤维素菌株筛选、鉴定及产酶条件优化八、产环糊精葡萄糖基转移酶的菌株分离、产酶条件优化与酶学特性研究九、脂肪酶高产菌株的筛选及产酶条件优化耐低温降解纤维素菌株筛选、鉴定及产酶条件优化随着环境问题日益严重，生物可降解材料的研究和应用变得日益重要。
其中，纤维素作为地球上最丰富的可再生资源之一，其降解和利用是当前研究的热点。
然而，纤维素的降解需要特定的微生物菌株，尤其在低温环境下，筛选和鉴定具有耐低温特性的纤维素降解菌株是当前的重要任务。
在本次研究中，我们从不同环境中收集了多种微生物，通过在低温条件下筛选，我们成功获得了一株具有良好耐低温性能的纤维素降解菌株。
该菌株可以在低温条件下有效降解纤维素，并且表现出较高的酶活性。
为了进一步了解该菌株的特性，我们采用了多种分子生物学和生理学方法对其进行了鉴定。
结果表明，该菌株属于一个名为Xylanimonas 的属，这是一个在纤维素降解方面具有良好前景的菌种。
接下来，我们对该菌株的产酶条件进行了优化。
通过单因素实验和正交实验，我们发现该菌株的最佳产酶条件为：温度20℃，pH值为6.5，在含有1%纤维素的液体培养基中培养。
在此条件下，该菌株的酶活性达到了最大值。
总的来说，我们的研究提供了一种具有耐低温特性的纤维素降解菌株，并对该菌株的产酶条件进行了优化。
这为纤维素的生物降解和利用提供了新的可能性，有助于推动生物可降解材料的发展和环保事业的发展。
脂肪酶高产菌株筛选、产酶条件优化及脂肪酶大量纯化研究一、引言脂肪酶（Lipases）是一类在生物体内起着重要作用的酶，它们能够水解脂肪，生成脂肪酸和甘油。
酱香型大曲中产蛋白酶放线菌的分离及产酶条件研究
ｏ ｂ ｊ ｅ ｃ ｔ ｉ ｖ ｅ ｓ ｔ ｒ ａ ｉ ｎ ｗ ａ ｓ ｓ ｅ ｐ ｒａ ａ ｔ ｅ ｄ ａ ｎ ｄ ｐ ｕ ｒ ｉ ｉ ｆ ｅ ｄ ｔ ｈ ｒ ｏ ｕ ｇ ｈ ｓ ｐ ｒ ｅ ａ ｄ ｐ ｌ ａ ｔ ｅ ａ ｎ ｄ ｂ ｉ ｏ ｃ ｈ ｅ ｍ ｉ ｃ ａ ｌ ｒ ｅ ａ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ ｍｅ ｔ ｈ ｏ ｄ ，ａ ｎ ｄ ｈｅ ｔ ｔ ａ ｒ ｇ ｅ ｔ ｓ ｔ ｒ ａ ｉ ｎ ｗ ａ ｓ ｉ ｄ ｅ ｎ ｔ ｉ ｉ ｆ ｅ ｄ ｂ ｙ
ｆ ｅ ｒ ｍｅ ｎ ｔ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｃ ｏ ｎ ｄ ｉ ｔ ｉ ｏ ｎ ｓ ｔ ｒｏ ｈ ｕ ｈ ｇ ｓ ｉ ｎ ｇ ｌ ｅ ｆ ａ ｃ ｔ ｏ ｒ ａ ｎ ｄ ｏ ｒ ｔ ｈ ｏ ｇ ｏ ｎ ａ ｌ ｔ ｅ ｓ ｔ ｓ ｗｅ ｒ ｅ ： ｐ Ｈ ９ ． ０ ， ｆ ｅ ｒ ｍｅ ｔ ｎ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｔ ｅ ｍ ｐ ｅ ｒ ａ ｔ ｕ ｒ ｅ ３ ５ ｏ Ｃ， ｒ ｏ ｔ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｓ ｐ ｅ ｅ ｄ １ ８ ０ ｒ ／ ｍ ｉ ｎ ， ｈ ｔ ｅ
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陇东大学学士学位毕业论文（设计）蛋白酶产生菌的筛选及产酶条件优化生命科学与技术学院08生物技术班作者：指导教师：蛋白酶产生菌的筛选及产酶条件优化何泰杜旭谢丽娟，刘丽萍(陇东学院生命科学与技术学院，甘肃庆阳745000)摘要：采用陇东学院污水处理厂附近土壤、农田土壤及养殖场附近土壤作为样品，利用牛奶水解圈筛选模型从中分离筛选得到产蛋白酶能力较高的菌株whr1，初步鉴定该菌株属于芽孢杆菌。
并对其产酶条件进行优化，结果显示该菌最适培养时间为24h，最佳碳源为质量浓度1% 蔗糖，最佳氮源为质量浓度1.5%酵母膏，最适初始pH值为6.0，最适发酵温度为35℃。
关键词：菌种筛选，鉴定，蛋白酶，条件优化Protease produced the screening of the bacteria and the optimization of theenzyme production conditions（College of life science and technology, Longdong University, Qingyang 74500, Gansu, China）Abstract：The sewage treatment plant soil near east institute, soil and soil samples near farms .Using milk hydrolysis circle screening model separating screening in high ability get protease whr1 strains. Preliminary appraisal of the fungus belong to bacillus. After the optimization of the condition, the capability of whr1 was improved, the optimal condition is: The time is 24h; carbon source is sucrose 1%; nitrogen source is Yeast extract 1.5 %, the pH is 6.0; fermentation temperature is 30℃.Keyword: Screening，Identified，Protease, Conditions optimization0引言蛋白酶是水解蛋白质肽键的一类酶的总称，是一类广泛应用于皮革、毛皮、丝绸、医药、食品、酿造等方面的重要工业用酶[1]，也是目前世界上产销量最大的商业酶，其市场占有率约占整个商品酶销售量的60％，微生物蛋白酶从微生物中提取，不受资源、环境和空间的限制，具有动物蛋白酶和植物蛋白酶所不可比拟的优越性[2,3]。
目前，蛋白酶的研究仍注重于新品种的发掘，并通过分离筛选、发酵条件优化和诱变育种或构建基因工程菌等综合手段获得高产蛋白酶的优良菌株[4,10]。
我国的蛋白酶研究还存在如微生物资源开发不足，蛋白酶种类较少，酶制剂品种单一等问题。
本论文从以下几方面对蛋白酶产生菌株进行较为系统的研究：从土壤中筛选出产蛋白酶能力较高菌株。
对筛选出的菌株进行形态学的鉴定，将菌株初步确定到属。
研究产蛋白酶菌株发酵产酶条件，对培养基成分和发酵条件进行优化，确定最佳培养基配方和发酵条件，进一步提高菌株的产酶活力。
1实验材料及方法1.1 实验材料与仪器1.1.1 实验仪器电热压力蒸汽灭菌锅全温振荡培养箱生化培养箱超净工作台电子分析天平离心机pH测量仪分光光度计水浴锅微波炉1.1.2 实验材料①样品：分别采自陇东学院污水处理厂附近，农田土壤及养殖场附近的土壤。
②主要试剂：脱脂奶粉，氯化钠（NaCl），蔗糖，碳酸钠，酪氨酸，尿素，琼脂粉，牛肉膏，蛋白胨，三氯乙酸，结晶紫，干酪素，磷酸氢二钠，磷酸二氢钠③培养基种子斜面培养基：牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，NaCl5.0g，琼脂粉20.0g，水1000ml，121℃灭菌20min，备用。
筛选培养基：牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，NaCl 5.0g，琼脂粉20.0g，脱脂奶粉25.0g，水1000ml，106℃灭菌6min，备用。
基础培养基：牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，NaCl5.0g，水1000ml，121℃灭菌20min，备用。
④试剂配制0.4mol/L碳酸钠溶液：称取无水碳酸钠42.4g，定容至1000ml。
0.4mol/L三氯乙酸(TCA)溶液：称取三氯乙酸65.4g，定容至1000ml。
pH7.2磷酸缓冲液：称取磷酸二氢钠31.2g，定容至1000ml，即成0.2mol溶液（A液）。
称取磷酸氢二钠71.63g，定容至1000ml，即成1.2mol溶液（B液）。
取A液28mL和B液72ml，再用蒸馏水稀释1倍，即成0.1mol/L pH7.2的磷酸缓冲液。
2％酪蛋白溶液：准确称取干酪素2g，称准至0.002g，加入0.1N氢氧化钠10mL，在水浴中加热使溶解（必要时用小火加热煮沸），然后用pH7.2磷酸缓冲液定容至100ml即成。
配置后应及时使用或放入冰箱内保存，否则极易繁殖细菌，引起变质。
100µg/mL酪氨酸溶液：精确称取在105℃烘箱中烘至恒重的酪氨酸0.1g，逐步加入6ml 1mol/L 盐酸使溶解，用0.2mol/L盐酸定容至100ml，其浓度为1000µg/mL，在吸取此液10ml，以0.2mol/L 盐酸定容至100ml，其浓度为100µg/mL的酪氨酸溶液。
此溶液配成后液应及时使用或放入冰箱内保存，以免繁殖细菌而变质。
1.2 实验方法1.2.1 菌株筛选富集：将从陇东学院污水处理厂附近，实验楼前植物园土壤及养殖场附近的土壤采集的土壤,分别称取5g土样，放入装有45ml无菌水的三角瓶中，37℃震荡培养24h。
初筛：将富集培养的菌液取1ml，用无菌水依次稀释到10-7，分别取10-5、10-6、10-7三个梯度各0.1ml土壤稀释液制成混菌平板，将培养皿放入37℃培养箱中培养24h[8,9]。
取出培养好的平皿，选择生长良好、试剂管号形态明显的单菌落，用无菌牙签挑种到牛奶筛选培养基上，每个平皿中接4-5个，37℃培养箱中培养24h。
挑选出能在牛奶筛选培养基上产生水解圈的单菌落，接种到斜面培养基上，放入冰箱冷藏。
复筛:从冰箱中取出初筛得到的菌株，转接试管斜面活化，37℃下恒温培养24 h。
各取1环，接种到装液量为20ml基础培养基的50ml三角瓶中，在37℃条件下摇床培养24h。
分别取各菌株发酵液10μl滴加在牛奶筛选平板中的滤纸片上(直径为12mm)，然后将培养皿放入37℃的培养箱中培养24h，取出后测量水解圈直径与菌落直径。
重复此过程3次，取平均值，选取水解圈直径与菌落直径差值最大的菌株作为出发菌株whr1。
1.2.2 蛋白酶产生菌酶活力的测定酶活测定原理：酶活力是指酶催化某些化学反应的能力。
酶活力的大小可以用在一定条件下它所催化的某一化学反应的初速度来表示。
测定酶活力实际就是测定被酶所催化的化学反应的速度，即可以用单位时间内反应底物的减少量或产物的增加量来表示。
蛋白酶可以催化酪蛋白水解生成酪氨酸。
酪氨酸为含有酚羟基的氨基酸，可与福林试剂发生福林酚反应。
（福林酚反应：福林试剂在碱性条件下极其不稳定，容易定量地被酚类化合物还原，生成钨蓝和钼蓝的混合物，而呈现出不同深浅的蓝色。
）利用比色法即可测定酪氨酸的生成量，用蛋白酶在单位时间内水解酪蛋白产生的酪氨酸的量来表示酶活力[11]。
酶液的制备：从斜面培养基中取1环菌种于30ml基础发酵培养基中，在37℃、140rpm摇床上培养12h，再分别取1ml经12h培养的菌液于不同条件的液体培养基中培养24h，然后培养液于5000rpm离心10min取其上清液为酶液。
酪氨酸标准曲线的制作：取6支25ml的比色管，编号，按下表操作表1-1 制作酪氨酸的标准曲线测定步骤：取6支试管编号按表1分别吸取不同浓度酪氨酸1ml ，各加入0.4mol/L 碳酸钠5ml ，在各加入的福林试剂1ml 。
摇匀置于水浴锅中，40℃保温发色20min ，用722型分光光度计进行测定（波长660nm ）。
测三次，取平均值。
将1-6号管所测得的光密度（OD ）减去一号管所测得的光密度为净OD 值。
测定酶活方法：取25ml 比色管3支，每管内加入酶液1ml ，置于40℃水浴中预热2min ，再各加入经同样预热的酪蛋白1ml ，精确保温10min ，时间到后，立即再各加入0.4mol/L 三氯乙酸2ml ，以终止反应，继续置于水浴中保温20min ，使残余蛋白质沉淀后离心或过滤，然后另取25mL 试管3支，编号1、2、3，每管内加入滤液1ml ，再加0.4mol 碳酸钠5ml ，已稀释的福林试剂1ml ，摇匀，40℃保温发色20min 后进行光密度（OD ）测定。
空白试验同样取试管3支，编号（1）、（2）、（3），测定方法同上，唯在加酪蛋白之前先加0.4mol/L 三氯乙酸2ml ，使酶失活，再加入酪蛋白。
1.2.3产酶条件优化产酶曲线测定：在50ml 基础培养基中，分别在37℃下培养0h 、6h 、12h 、18h 、24h 、30h 、36h ，测其酶活。
不同碳源对产酶的影响：在50ml 基础培养基中其他成分不变，选用4种浓度为1%的不同的碳源，分别为麦芽糖、乳糖、蔗糖、葡萄糖，37℃ 140 rpm 培养最优时间，测其酶活。
不同氮源对产酶的影响：在50ml 基础培养基中加入最优碳源，氮源改用5种浓度为1.5%的不同的氮源，其他成分不变，分别是尿素、(NH 4)2SO 4、蛋白胨、牛肉膏、酵母膏，37℃以最优时间培养，测其酶活。
不同培养基初始pH 值对产酶的影响：在50ml 基础培养基中加入最优碳源、氮源，其他成分不变，选用5种不同的pH ，分别是pH 5、pH 6、pH 7、pH 8、pH 9，37℃以最优时间培养，测其酶活。
不同温度对产酶的影响：在50ml 基础培养基中加入最优碳源、氮源，其他成分不变，采用最优pH 值，分别在31℃、33℃、35℃、37℃、39℃下以最优时间培养，测其酶活[6,9]。
2实验结果2.1 菌株筛选2.1.1 菌株的分离筛选将土样利用牛奶筛选培养基分离得到具有蛋白酶活性的菌株，选出其中水解圈较大的whr1号菌1 2 3 4 5 6 蒸馏水，ml 100µg/ml 酪氨酸，ml 酪氨酸最终浓度，µg/ml 10 0 0 8 2 20 6 4 40 4 6 60 2 8 80 0 10 100株进行后续实验，并斜面保藏。