实验十一 产蛋白酶菌株的筛选
蛋白酶产生菌的分离鉴定及筛选
蛋白酶产生菌的分离、鉴定和筛选是一项重要的微生物学工作，通常用于寻找能够产生具有特定功能的蛋白酶的细菌或真菌菌株。
以下是一般的步骤和方法：
1. 样品采集：首先从土壤、水体、食品等环境中采集样品，可能含有潜在的蛋白酶产生菌。
2. 分离：将样品进行稀释处理后，通过涂布法、稀释涂布法、过滤法等分离方法，在富含寒原蛋白酶的寒原平板培养基上培养，以分离出单菌种。
3. 纯化：将分离得到的单菌种进行多次传代，确保单一菌株的纯化。
4. 鉴定：利用生理生化试验、形态学观察、生物学特性和分子生物学方法（如16S rRNA序列分析）等手段，对分离得到的菌株进行鉴定，确定其分类地位。
5. 筛选：利用含有蛋白质底物的培养基（如乳清蛋白、明胶等）进行筛选，观察菌株在培养基上的透明圈或发酵液的浑浊度变化，筛选出产生蛋白酶活性高的菌株。
6. 活性测定：对筛选出的蛋白酶产生菌株进行蛋白酶活性测定，确
定其蛋白酶活性水平。
7. 保存与应用：对获得的蛋白酶产生菌株进行保存，并进一步研究其生物学特性和应用潜力，如酶学特性、温度和pH稳定性等。
通过以上步骤，可以有效地从环境样品中分离、鉴定并筛选出具有高蛋白酶产量和活性的菌株，为后续的蛋白酶生产及应用研究提供了可靠的菌种资源。
产蛋白酶菌的筛选及产酶条件优化
大庆师范学院本科生毕业论文蛋白酶产生菌培养条件的条件优化院(部)、专业生命科学学院生物技术研究方向微生物学学生姓名朱琳学号200901122598指导教师姓名张亦婷2013年06月01日摘要采用大庆师范学院生命科学学院花园附近土壤、农田土壤及体育场附近土壤作为样品，并从中筛选分离并得到产蛋白酶能力较高的菌株，经过初步鉴定该菌株属芽孢杆菌。
通过对其产酶条件进行优化，结果显示该菌产酶最佳碳源为质量浓度15g/L的乳糖，最佳氮源为质量浓度20g/L的尿素，最适初始pH值为6.5，最适发酵温度为35℃。
关键词：菌种筛选；鉴定；蛋白酶；条件优化AbstractThe sewage treatment plant soil near east institute, soil and soil samples near farms .Using milk hydrolysis circle screening model separating screening in high ability get protease whr1 strains. Preliminary appraisal of the fungus belong to bacillus. After the optimization of the condition, the capability of whr1 was improved, the optimal condition is: carbon source is sucrose 15g/L; nitrogen source is Yeast extract 20g/L, the pH is 6.5; fermentation temperature is 35℃.Key words：Screening；Identified；Protease；Conditions optimization目录摘要 (1)Abstract (2)1 引言 ...........................................................................................................................................................2 材料与方法 (3)2.2.2 实验材料 (3)2.2.1 菌株筛选 (3)3.1 菌株筛选 (6)3.1.1 菌株的分离筛选 (6)2.3 条件优化 (7)2.3.1 不同碳源对产酶的影响 (7)2.3.3不同氮源对产酶的影响 (8)2.3.4 培养基不同初始pH值对产酶的影响 (9)2.3.5 不同温度对产酶的影响 (10)4 结论 (10)11 引言蛋白酶是催化蛋白质中肽键水解的酶，是一类广泛应用于皮革、毛皮、丝绸、医药、食品、酿造等方面的重要工业用酶，也是目前世界上产销量最大的商业酶，其市场占有率约占整个商品酶销售量的60％，微生物蛋白酶从微生物中提取，不受资源、环境和空间的限制，具有动物蛋白酶和植物蛋白酶所不可比拟的优越性。
蛋白酶产生菌的筛选及其酶活性的测定
分离与纯化
将采集的 土壤样品 称取1g于 99ml无菌 水中制成 1：10的 土壤悬液。 将其摇动 一会。 取5支灭 菌的指管， 分别在其 中加入 4.5ml无 菌水。并 在指管上 贴上标签， 分别标有 10-3，104，10-5， 10-6，107. 用稀释法分离 土壤微生物， 即用移液抢取 上述的土壤悬 液0.5ml于标 有10-3的指管 中，混匀后再 从标有10-4的 指管中取 0.5ml于下一 个指管中，依 次进行。 用涂布棒 将稀释后 的菌悬液 涂布在脱 脂乳培养 基平板上； 涂布好后 放在温室 中培养。
结果与分析
1.形态特征： 菌株在脱脂乳固体培养基上培养48h后，菌落湿 润且为乳白色，半透明，表面较光滑，后期菌落 边缘不整齐，较为粗糙，淡黄色，不透明，无光 泽，表面皱褶。
2.菌株的鉴定：
革兰氏染色结果表明，菌体形态为杆状，链状排列，两端钝圆， 菌体大小约为(1.0～1.8)×(2.0～4.1)μｍ，革兰氏染色为阳性， 有芽孢，芽孢椭圆或卵圆，每个细胞产一个芽孢，芽孢 水解 圈的 形成。
菌株的鉴定及其酶活性的测定
鉴定
（1）形态观察 对筛选出的高产蛋白酶菌 株进行形态观察，进行革 兰氏染色。 （2）细菌的鉴定 参照《伯杰氏细菌鉴定手 册》 《常见细菌系统鉴定 手册》和《芽孢杆菌属》 依据形态特征对分离的纯 培养的细菌菌株进行初步 分类鉴定。
3.酶活性的测定
发酵培养温度 28 平均值 1.1cm
32 1.5cm
实验心得
土壤的采取
培养基的灭菌温度控制很重要
及时观察平板中菌的生长
蛋白酶产生菌的 筛选及其酶活性 的测定
五班6组 小组成员:张兴娇 邓莲英 任倩
一
•材料与方法 •结果与分析
微生物实验设计-产蛋白酶菌株的筛选
微生物实验设计-产蛋白酶菌株的筛选产蛋白酶菌株的筛选级分离一、实验原理自能够产生胞外蛋白酶的菌株在牛奶平板上生长后，其菌落周围可形成明显的蛋白水解圈，水解圈与菌落直径的比值，常被作为判断该菌株蛋白酶产生能力的初筛依据。
将腐烂的大豆浸泡液中的细菌接种在含有酪素的培养基上进行培养。
由于产蛋白酶菌株能在干酪素的培养基上形成无色透明圈，因此能将产蛋白菌株分离出来，分离出来的菌株经再次培养，就可获得纯种产蛋白酶的菌株。
二、实验器材1.菌种：从大豆浸泡液中获得2.培养基:(1)PDA斜面培养基：马铃薯200g，蔗糖20g,琼脂20g,水1000ml.马铃薯去皮，切成块，煮沸半小时后用纱布过滤，再加糖及琼脂，溶化后补水至1000ml，121℃灭菌30min备用。
（2）干酪素琼脂培养基：干酪素4.0g，用20ml 0.1mol/L NaOH溶液溶解后再加20g琼脂，加蒸馏水煮沸加水至1000ml 121℃灭菌30min备用。
3.试剂：无菌水。
4.仪器：天平，电磁炉，烧杯，无菌试管，无菌培养皿，高压灭菌锅，锥形瓶，接种环，涂布棒，酒精灯，恒温培养箱。
三、实验步骤1.将腐烂的大豆放入无菌水中浸泡，制成细菌悬浮液。
2.用涂布棒蘸取菌液接种于PAD培养基中，26℃培养48h。
3.倒置于酪素琼脂培养基平板上，37℃培养24h。
4.挑取培养好的菌落接种于平板上，28℃培养48h。
5.观察各菌落周围形成的透明圈的情况。
6.选取透明圈较大的三个菌落分别接种在干酪素琼脂培养基上，28℃培养48h。
7.观察受否为单菌落，若为单菌落且有透明圈，则为纯种产蛋白酶菌株。
若有杂菌，则需要重复步骤6，直到培养出纯菌为止。
参考文献[1]代玉梅.蛋白酶高产菌株的筛选鉴定及酶学性质研究[D].青岛:青岛大学,2008.[2]黄志强,林白雪,谢联辉.产碱性蛋白酶海洋细菌的筛选与鉴定[J].福建农林大学学报:自然科学版,2006,35(4):416-420.。
蛋白酶产生菌的筛选及活力的测定
蛋白酶产生菌的筛选及活力的测定作者刘艳芝指导教师张玲秀（忻州师范学院生物系1201班034000）摘要：采用忻州师范学院校园附近土壤、农田土壤及体育场土壤作为样品，并从中筛选分离并得到产蛋白酶能力较高的菌株，经过初步鉴定该菌株属芽孢杆菌。
通过对其产酶条件进行优化，结果显示该菌产酶最佳碳源为质量浓度15g/L 的乳糖，最佳氮源为质量浓度20g/L的尿素，最适初始pH值为6.5，最适发酵温度为35℃。
关键词：菌种筛选；鉴定；蛋白酶；条件优化蛋白酶蛋白质中肽键水解的酶，是一类广泛应用于皮革、毛皮、丝绸、医药、食品、酿造等方面的重要工业用酶，也是目前世界上产销量最大的商业酶，其市场占有率约占整个商品酶销售量的60％，微生物蛋白酶从微生物中提取，不受资源、环境和空间的限制，具有动物蛋白酶和植物蛋白酶所不可比拟的优越性。
目前，蛋白酶的研究仍注重于新品种的发掘，并通过分离筛选、发酵条件优化和诱变育种或构建基因工程菌等综合手段获得高产蛋白酶的优良菌株。
我国的蛋白酶研究还存在如微生物资源开发不足，蛋白酶种类较少，酶制剂品种单一等问题。
本论文从以下几方面对蛋白酶产生菌株进行较为系统的研究：从土壤中筛选出产蛋白酶能力较高菌株。
对筛选出的菌株进行形态学的鉴定，将菌株初步确定到属。
研究产蛋白酶菌株发酵产酶条件，对培养基成分和发酵条件进行优化，确定最佳培养基配方和发酵条件，进一步提高菌株的产酶活力。
一、材料及方法：1.1 实验材料与仪器实验仪器：高压灭菌锅，恒温培养箱，超净工作台，电子分析天平，pH测量仪，水浴锅，微波炉，紫外光可见分光光度计，摇床、酒精灯、接种针、游标卡尺、无菌移液管、无菌试管、量筒、容量瓶、漏斗、试剂瓶、漏斗、载玻片、滤纸、擦镜纸。
1.2 实验材料：样品：取自忻州师范学院附近的土壤。
试剂：无菌水（带玻璃珠）、100ug/ml 酪氨酸溶液、PH8.0硼酸缓冲液、0.4mol/L三氯乙酸、牛肉膏蛋白胨培养基、酪蛋白培养基、产蛋白酶发酵培养基二、操作步骤（一）配制所需培养基按照以下配方配制所需的培养基牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏0.5g，蛋白胨1g，NaCl 0.5g，琼脂1.5～2.0g，水100ml，pH 7.2，配制200mL酪蛋白培养基：牛肉膏0.3g，酪素1g，NaCl 0.5g，琼脂2g ，定容于100ml产蛋白酶发酵培养基：玉米粉6g，豆粉4g，磷酸二氢钾0.03g，碳酸钠0.1g，磷酸氢二钠0.4g，定容于100ml（二）分离1.洗涤培养皿、试管等实验器具，与121℃高压灭菌20min2.采集土壤样品，用无菌水植被1:10土壤悬液。
蛋白酶产生菌的分离鉴定及筛选。
蛋白酶产生菌的分离鉴定及筛选。
蛋白酶产生菌的分离鉴定和筛选可以按照以下步骤进行：1.样品收集：从环境样品（如土壤、水样、发酵物等）中收集样品，注意收集样品需要符合生物安全和伦理规范。
2.分离菌株： a. 样品处理：将样品进行适当的稀释处理，以获得适量的单菌落。
b. 培养基选择：根据目标酶的特性，选择合适的培养基进行菌株分离。
常用的培养基有LB（大肠杆菌培养基）、TSA（琼脂糖营养平板培养基）等。
也可以添加特定的底物来富集酶活菌株。
c. 接种和分离：将处理后的样品接种在选定的培养基上，并进行营养和环境条件的适当调整。
通过稀释分离法，将单菌落分离至不同的培养皿中，得到纯培养的菌株。
3.酶活性测定： a. 初步筛选：将分离的菌株进行初步筛选，通过对菌落的酶活性直接观察或使用浸润琼脂糖等方法判断酶的活性。
b. 液体培养：将筛选出的菌株进行液体培养，收集培养物用于后续的酶活性测定。
c. 酶活性测定：通过适当的酶活性测定方法（如改良的Casein酶活测定法、Azocasein酶活测定法等）来评估菌株的酶活性。
4.酶产量测定： a. 最优菌株筛选：根据酶活性测定结果，选择酶活性较高的菌株。
b. 酶产量测定：对选定的菌株进行批量发酵或连续发酵实验，通过酶活性和菌体生长曲线的测定，估计菌株的酶产量。
5.菌株鉴定： a. 形态学特征：观察菌落的形态学特征，如形状、颜色、质地等。
b. 生理生化特性：进行生理生化测试，包括生长方式、耐受性、产酸性、酶反应等。
c. 分子生物学鉴定：通过PCR方法扩增和测序16S rRNA基因，进行菌株的分子鉴定，并与已知菌株进行比对。
这些步骤将有助于从样品中分离、鉴定和筛选出蛋白酶产生菌株。
根据筛选结果，选择高酶活性和高酶产量的菌株，可以进行后续的酶性质研究、表达载体构建等工作。
在实践中，根据具体实验条件和要求，可能需要进行适当的优化和调整。
高温蛋白酶产生菌株的筛选
高温蛋白酶产生菌株的筛选一、实验目的1. 学习从各种样品中分离微生物的操作技术2. 掌握分离微生物时定性测定产物的筛选方法3. 掌握高产蛋白酶菌株的初筛方法二、基本原理从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。
常用的方法有：平板分离法：该方法操作简便，普遍用于微生物的分离与纯化。
其基本原理包括两方面：1. 选择适合于待分离微生物的生长条件，如营养、酸碱度、温度和氧等要求或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。
2. 微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落可以是由一个细胞繁殖而成的集合体。
因此可通过挑取菌落而获得一种纯培养。
获取单个菌落的方法可通过稀释涂布平板或平板划线等技术完成。
值得指出的是从微生物群体中经分离生长在平板上的单个菌落并不一定保证是纯培养。
因此，纯培养的确定除观察其菌落特征外，还要结合显微镜检测个体形态特征后才能确定，有些微生物的纯培养要经过一系列的分离与纯化过程和多种特征鉴定方能得到。
土壤是微生物生活的大本营，它所含微生物无论是数量还是种类都是极其丰富的。
因此土壤是微生物多样性的重要场所，是发掘微生物资源的重要基地，可以从中分离、纯化得到许多有价值的菌株。
三、实验材料1. 样品：从地表下10~15cm的土壤或者枯枝烂叶、腐烂稻草中用无菌小铲、纸袋取土样，并记录取样的地理位置、pH、植被情况等。
（学生自取）2. 培养基①肉汤培养基（附录Ⅱ-1.1）：100 mL/组，其中20 mL液体培养基/250 mL△中（内装玻璃珠10颗）；50 mL固体斜面培养基分装在试管中：5mL/支，10支。
组成：牛肉膏0.5% 蛋白胨1% NaCl 0.5% pH 7.2～7.4 121℃，灭菌20min②酪素培养基（附录Ⅱ-1.10）：200 mL/500 mL△×1（10-12个平板，每组6个平板）* 酪素的母液浓度为4%，是将4g干酪素溶解于0.1N的30-35ml的NaOH水溶液中，水浴溶解20min，待溶解完全后加入60-70℃热水稀释到所需浓度（即定容到100 mL），即得到母液浓度围4%的酪素溶液。
蛋白酶产生菌的分离鉴定及筛选
蛋白酶产生菌的分离鉴定及筛选1. 引言蛋白酶是一类能够降解蛋白质的酶，在许多工业领域具有广泛的应用价值。
因此，发现和筛选具有高蛋白酶产量的菌株成为了很多研究人员的关注点。
本文旨在介绍蛋白酶产生菌的分离鉴定及筛选的方法和步骤。
2. 蛋白酶分离菌株的采集蛋白酶产生菌株可以从各种环境中采集得到，常见的源包括土壤、水样、植物表面等。
采集时需要注意避免污染和样品间的干扰。
常用的采集方法包括无菌棉签擦拭、土壤样品采集等。
3. 蛋白酶分离菌株的分离和筛选3.1 培养基选择和制备蛋白酶分离菌株的分离需要选择合适的培养基，常见的培养基包括含蛋白质和多肽的培养基，如酵母提取物培养基、肉汤培养基等。
培养基制备时需要注意无菌操作，避免细菌污染。
3.2 菌株的分离将采集得到的样品均匀涂布在选定的培养基上，使用无菌棉签或铲子进行均匀涂布。
将涂布后的培养基培养于适宜的温度和时间下，一般常见的培养温度为30摄氏度。
3.3 蛋白酶活性筛选使用适当的蛋白酶活性指示剂，如casein等，在培养基上进行盘状培养。
通过观察培养基上蛋白质的降解情况，筛选出具有高蛋白酶活性的菌株。
此外，也可通过测定培养液中蛋白酶的活性来进行筛选。
4. 蛋白酶产生菌株的鉴定4.1 形态观察观察菌落的形态特征，如菌落的形状、颜色、透明度等，以及菌株的菌落生长速度等。
4.2 生理生化特性检测进行菌株的生理生化特性检测，包括产酸、产气、葡萄糖利用、氧需求等。
常用的方法包括气压油技术、碳水化合物利用酶技术等。
4.3 分子生物学鉴定采用分子生物学方法对菌株进行鉴定，如16S rRNA序列分析、PCR等。
将菌株的DNA提取出来，进行引物扩增，然后通过测序和序列比对，确定菌株的分类信息。
5. 结论通过蛋白酶产生菌的分离鉴定及筛选，可以获得具有高蛋白酶产量的菌株。
这些菌株在生物技术、食品工业等领域具有广泛的应用前景。
未来的研究可以进一步优化培养条件，提高菌株的蛋白酶产量，并应用于相关的工业生产中。
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实验十一产蛋白酶菌株的筛选
碱性蛋白酶是一类最适宜作用PH为碱性的蛋白酶，在轻工、食品、医药工业中用途非常广泛。
微生物来源的碱性蛋白酶都是胞外酶，具有产酶量高，适合大规模工业生产等优点，被认为是最重要的一类营业性酶类。
从自然界筛选获取有用的微生物资源一直是微生物学的一项重要工作，也是学习微生物学的学生应该掌握的基本技能。
一基本原理
⏹自能够产生胞外蛋白酶的菌株在牛奶平板上生长后，其菌落周围可形成明显的蛋白
水解圈。
⏹水解圈与菌落直径的比值常被作为判断该菌株蛋白酶产生能力的初筛依据。
不同类型的蛋白酶都能在牛奶平板上形成蛋白水解圈，细菌在平板上的生长条件和液体环境中生长的情况相差很大，因此在平板上产圈能力强的菌株不一定就是碱性蛋白酶的高产菌株。
⏹碱性蛋白酶活力测定按中华人民共和国颁布标准QB747-80进行。
⏹原理：Folin试剂与酚类化合物（Tyr,Trp,Phe）在碱性条件下发生反应形成蓝色化
合物，用蛋白酶分解酪蛋白生成含酚基的氨基酸与Folin试剂呈蓝色反应，通过分光光度计测定可知酶活大小。
二实验目的
⏹学习用选择平板从自然界中分离胞外蛋白酶产生菌的方法
⏹学习并掌握细菌菌株的药瓶液体发酵技术
⏹掌握蛋白酶活力测定的原理与基本方法
三实验器材
1 菌株
从自然界筛选获得的蛋白酶产生菌株
2 溶液和试剂
蛋白胨，酵母粉，脱脂奶粉，琼脂，干酪素，三氯醋酸，NaOH，Na2CO3,Folin试剂，硼砂，酪氨酸，水等
3 仪器和用品
三角烧瓶，培养皿，吸管，试管，涂布棒，玻璃搅拌棒，水浴锅，分光光度计，培养摇床，高压灭菌锅，尺，玻璃小漏斗和滤纸
四操作步骤
1 培养基和试剂的配制
（1）牛奶平板：在普通肉汤蛋白胨固体培养基中添加终质量浓度为1.5%的牛奶
（2）发酵培养基：玉米粉4%，黄豆饼粉3%，Na2HPO4 0.4%,KH2PO4 0.03%,3 mol/l NaOH 调节pH到9.0,0.1MPa 灭菌20min,250ml三角烧瓶的装瓶量为50ml。
（3）PH11硼砂- NaOH缓冲液：硼砂19.08克溶于1000ml水中；NaOH4g，溶于1000ml 水中，二液等量混合。
（4）2%酪蛋白：称取2g干酪素，用少量0.5mol/l NaOH润湿后适量加入pH11的硼砂- NaOH 缓冲液，加热溶解，定容至100ml，4℃冰箱中保存，使用期不超过一周。
2 酶活标准曲线的制作
用酪氨酸配制0~100μg/mL的标准溶液，取不同浓度的酪氨酸1mL与5mL 0.4mol/l Na2CO3、1mL Folin试剂混合，40 ℃水浴显色30min，680nm测定吸收值并绘制标准曲线，求出观密度为1是相当的酪氨酸质量（μg ），及K值。
3 用选择平板分离产蛋白酶产生菌株
取少量土样混于无菌水中，梯度稀释后涂布到牛奶平板上，37 ℃培养30h左右观察
建议用地衣芽孢杆菌作为对照菌株
4 产蛋白酶菌株的观察与转接
对牛奶平板上的总菌数和产蛋白酶的菌数进行记录，选择蛋白水解圈最大的5个菌株进行测量和记录菌落和透明圈得直径，然后转接到肉汤琼脂斜面上，37 ℃培养过夜。
5 用发酵培养基测定蛋白酶菌株的碱性蛋白酶活力
用初筛获得的5株蛋白酶菌株接种到发酵培养基中，37 ℃、200r/min 摇床培养48h。
所产生的酪氨酸质量（）来表示。
U=K×A×N×5/10
K：由标准曲线求出光密度为1是相当的的酪氨酸质量，本实验K=200
N：稀释倍数
A：样品OD值与空白对照ＯＤ值之差
5/10：测定中吸取的滤液是全部滤液的１/５，而酶反应时间为１０ｍｉｎ
实验报告
１结果记录
２思考题
（１）在选择平板上分离获得蛋白酶产生菌的比例如何？试结合采样地点进行分析。
（２）在选择平板上形成蛋白透明水解圈大小为什么不能作为判断菌株产蛋白酶能力的直接证据？试结合你初筛和复筛的结果分析。