蛋白酶产生菌的筛选及活力的测定
蛋白酶产生菌的分离鉴定及筛选
蛋白酶产生菌的分离、鉴定和筛选是一项重要的微生物学工作，通常用于寻找能够产生具有特定功能的蛋白酶的细菌或真菌菌株。
以下是一般的步骤和方法：
1. 样品采集：首先从土壤、水体、食品等环境中采集样品，可能含有潜在的蛋白酶产生菌。
2. 分离：将样品进行稀释处理后，通过涂布法、稀释涂布法、过滤法等分离方法，在富含寒原蛋白酶的寒原平板培养基上培养，以分离出单菌种。
3. 纯化：将分离得到的单菌种进行多次传代，确保单一菌株的纯化。
4. 鉴定：利用生理生化试验、形态学观察、生物学特性和分子生物学方法（如16S rRNA序列分析）等手段，对分离得到的菌株进行鉴定，确定其分类地位。
5. 筛选：利用含有蛋白质底物的培养基（如乳清蛋白、明胶等）进行筛选，观察菌株在培养基上的透明圈或发酵液的浑浊度变化，筛选出产生蛋白酶活性高的菌株。
6. 活性测定：对筛选出的蛋白酶产生菌株进行蛋白酶活性测定，确
定其蛋白酶活性水平。
7. 保存与应用：对获得的蛋白酶产生菌株进行保存，并进一步研究其生物学特性和应用潜力，如酶学特性、温度和pH稳定性等。
通过以上步骤，可以有效地从环境样品中分离、鉴定并筛选出具有高蛋白酶产量和活性的菌株，为后续的蛋白酶生产及应用研究提供了可靠的菌种资源。
蛋白酶产生菌的分离汇总讲解
蛋白酶产生菌的分离、活化选育、发酵及酶活力的测定许多细菌和霉菌产生蛋白酶，细菌中的芽孢杆菌是常见的蛋白酶产生菌。
本实验将土壤样品悬液加热处理，杀死非芽孢细菌及其它微生物后进行划线分离得到芽孢杆菌，将其接种到酪蛋白平板进行培养，根据酪蛋白平板的水解圈做初筛。
也可直接将细菌或霉菌接种到酪蛋白平板进行培养，分离筛选其它蛋白酶产生菌。
本实验主要包括：蛋白酶产生菌的分离纯化、产酶微生物菌种的选育、产酶微生物的发酵与酶活力的测定、蛋白酶产生菌的生长及生长曲线、培养基优化。
通过本实验项目，使学生学会从自然界中分离蛋白酶产生菌的方法，菌种的纯化技术、高产菌的选育技术；了解蛋白酶产生菌的生长情况，学会绘制其生长曲线；学会培养基优化的方法；了解蛋白酶的性质及蛋白酶的测定原理；掌握蛋白酶的发酵及酶活力测定方法。
1 实验材料1.1 实验样品校园内土壤样品1.2实验仪器与材料牛肉膏蛋白胨培养基平板、酪蛋白平板、无菌水（带玻璃珠）、芽孢染色液番红；显微镜、恒温水浴锅、酒精灯、接种针、游标卡尺、无菌移液管、无菌试管、血球计数板、试管、三角烧瓶、烧杯、量筒、，玻棒、电子天平、牛角匙、高压蒸汽灭菌锅、pH试纸（ pH 5．5—9．0）、棉花、牛皮纸、记号笔、麻绳、纱布、培养皿、胶头滴管、分光光度计（应符合GB9721的规定）等。
2实验方法与步骤 2.1 培养基的配制方法1.称量按培养基配方比例依次准确地称药品放入烧杯中。
2.溶化在上述烧杯中可先加入少于所需要的水量，用玻棒搅匀，然后，在石棉网上加热使其溶解。
待药品完全溶解后，补充水分到所需的总体积。
3.调pH4.分装按实验要求，可将配制的培养基分装入试管内或三角烧瓶内。
5．包扎塞好棉花的试管和锥形瓶应盖上厚纸用绳捆扎，用记号笔注明培养基名称、组别、日期。
6．灭菌将上述培养基以1.02kg/cm2（15磅/英寸2），121．3℃， 15-20min高压蒸汽灭菌。
如因特殊情况不能及时灭菌，则应放入冰箱内暂存。
5产蛋白酶菌株的筛选2019
三、器材
1.菌株 从自然界筛选获得的蛋白酶产生菌株 2.溶液和试剂 蛋白胨，酵母粉，脱脂奶粉，琼脂，干酪素，三氯醋酸，NaOH，
Na2CO3,Folin试剂，硼砂，酪氨酸，水等 3.仪器和用品 三角烧瓶，培养皿，吸管，试管，涂布棒，玻璃搅拌棒，培养摇
床，高压灭菌锅，直尺，玻璃小漏斗和滤纸
四、操作步骤
1.牛奶平板培养基的配制及灭菌 牛奶平板：在普通肉汤蛋白胨
固体培养基中添加终质量浓度为 1.5%的ห้องสมุดไป่ตู้奶
2.倒平板
四、操作步骤
3.制备土壤悬液 4.涂布 5.培养 6.观察记录
五、注意事项
培养基灭菌条件的控制。
六、实验结果
将菌落计数结果记录于下表中。
七、思考题
1.在选择平板上形成蛋白透明水解圈大小是否能作为 判断菌株产蛋白酶能力的直接证据？为什么？ 2.简单设计一方案，从实验中初筛得到的产蛋白酶菌 落里获得某个碱性蛋白酶的高产菌株。
产蛋白酶菌株的筛选
生物制药系 2019年12月
一、实验目的
学习用选择平板从自然界中分离胞外蛋白酶产生 菌的方法。
二、实验原理
蛋白酶在轻工、食品、医药工业中用途非常广泛。 微生物来源的碱性蛋白酶都是胞外酶，具有产酶量高， 适合大规模工业生产等优点，被认为是最重要的一类营业 性酶类。自然界筛选获取有用的微生物资源一直是微生物 学的一项重要工作。 自能够产生胞外蛋白酶的菌株在牛奶平板上生长后，其 菌落周围可形成明显的蛋白水解圈。水解圈与菌落直径的 比值常被作为判断该菌株蛋白酶产生能力的初筛依据。
微生物实验设计-产蛋白酶菌株的筛选
微生物实验设计-产蛋白酶菌株的筛选产蛋白酶菌株的筛选级分离一、实验原理自能够产生胞外蛋白酶的菌株在牛奶平板上生长后，其菌落周围可形成明显的蛋白水解圈，水解圈与菌落直径的比值，常被作为判断该菌株蛋白酶产生能力的初筛依据。
将腐烂的大豆浸泡液中的细菌接种在含有酪素的培养基上进行培养。
由于产蛋白酶菌株能在干酪素的培养基上形成无色透明圈，因此能将产蛋白菌株分离出来，分离出来的菌株经再次培养，就可获得纯种产蛋白酶的菌株。
二、实验器材1.菌种：从大豆浸泡液中获得2.培养基:(1)PDA斜面培养基：马铃薯200g，蔗糖20g,琼脂20g,水1000ml.马铃薯去皮，切成块，煮沸半小时后用纱布过滤，再加糖及琼脂，溶化后补水至1000ml，121℃灭菌30min备用。
（2）干酪素琼脂培养基：干酪素4.0g，用20ml 0.1mol/L NaOH溶液溶解后再加20g琼脂，加蒸馏水煮沸加水至1000ml 121℃灭菌30min备用。
3.试剂：无菌水。
4.仪器：天平，电磁炉，烧杯，无菌试管，无菌培养皿，高压灭菌锅，锥形瓶，接种环，涂布棒，酒精灯，恒温培养箱。
三、实验步骤1.将腐烂的大豆放入无菌水中浸泡，制成细菌悬浮液。
2.用涂布棒蘸取菌液接种于PAD培养基中，26℃培养48h。
3.倒置于酪素琼脂培养基平板上，37℃培养24h。
4.挑取培养好的菌落接种于平板上，28℃培养48h。
5.观察各菌落周围形成的透明圈的情况。
6.选取透明圈较大的三个菌落分别接种在干酪素琼脂培养基上，28℃培养48h。
7.观察受否为单菌落，若为单菌落且有透明圈，则为纯种产蛋白酶菌株。
若有杂菌，则需要重复步骤6，直到培养出纯菌为止。
参考文献[1]代玉梅.蛋白酶高产菌株的筛选鉴定及酶学性质研究[D].青岛:青岛大学,2008.[2]黄志强,林白雪,谢联辉.产碱性蛋白酶海洋细菌的筛选与鉴定[J].福建农林大学学报:自然科学版,2006,35(4):416-420.。
蛋白酶产生菌的分离鉴定及筛选。
蛋白酶产生菌的分离鉴定及筛选。
蛋白酶产生菌的分离鉴定和筛选可以按照以下步骤进行：1.样品收集：从环境样品（如土壤、水样、发酵物等）中收集样品，注意收集样品需要符合生物安全和伦理规范。
2.分离菌株： a. 样品处理：将样品进行适当的稀释处理，以获得适量的单菌落。
b. 培养基选择：根据目标酶的特性，选择合适的培养基进行菌株分离。
常用的培养基有LB（大肠杆菌培养基）、TSA（琼脂糖营养平板培养基）等。
也可以添加特定的底物来富集酶活菌株。
c. 接种和分离：将处理后的样品接种在选定的培养基上，并进行营养和环境条件的适当调整。
通过稀释分离法，将单菌落分离至不同的培养皿中，得到纯培养的菌株。
3.酶活性测定： a. 初步筛选：将分离的菌株进行初步筛选，通过对菌落的酶活性直接观察或使用浸润琼脂糖等方法判断酶的活性。
b. 液体培养：将筛选出的菌株进行液体培养，收集培养物用于后续的酶活性测定。
c. 酶活性测定：通过适当的酶活性测定方法（如改良的Casein酶活测定法、Azocasein酶活测定法等）来评估菌株的酶活性。
4.酶产量测定： a. 最优菌株筛选：根据酶活性测定结果，选择酶活性较高的菌株。
b. 酶产量测定：对选定的菌株进行批量发酵或连续发酵实验，通过酶活性和菌体生长曲线的测定，估计菌株的酶产量。
5.菌株鉴定： a. 形态学特征：观察菌落的形态学特征，如形状、颜色、质地等。
b. 生理生化特性：进行生理生化测试，包括生长方式、耐受性、产酸性、酶反应等。
c. 分子生物学鉴定：通过PCR方法扩增和测序16S rRNA基因，进行菌株的分子鉴定，并与已知菌株进行比对。
这些步骤将有助于从样品中分离、鉴定和筛选出蛋白酶产生菌株。
根据筛选结果，选择高酶活性和高酶产量的菌株，可以进行后续的酶性质研究、表达载体构建等工作。
在实践中，根据具体实验条件和要求，可能需要进行适当的优化和调整。
高温蛋白酶产生菌株的筛选
高温蛋白酶产生菌株的筛选一、实验目的1. 学习从各种样品中分离微生物的操作技术2. 掌握分离微生物时定性测定产物的筛选方法3. 掌握高产蛋白酶菌株的初筛方法二、基本原理从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。
常用的方法有：平板分离法：该方法操作简便，普遍用于微生物的分离与纯化。
其基本原理包括两方面：1. 选择适合于待分离微生物的生长条件，如营养、酸碱度、温度和氧等要求或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。
2. 微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落可以是由一个细胞繁殖而成的集合体。
因此可通过挑取菌落而获得一种纯培养。
获取单个菌落的方法可通过稀释涂布平板或平板划线等技术完成。
值得指出的是从微生物群体中经分离生长在平板上的单个菌落并不一定保证是纯培养。
因此，纯培养的确定除观察其菌落特征外，还要结合显微镜检测个体形态特征后才能确定，有些微生物的纯培养要经过一系列的分离与纯化过程和多种特征鉴定方能得到。
土壤是微生物生活的大本营，它所含微生物无论是数量还是种类都是极其丰富的。
因此土壤是微生物多样性的重要场所，是发掘微生物资源的重要基地，可以从中分离、纯化得到许多有价值的菌株。
三、实验材料1. 样品：从地表下10~15cm的土壤或者枯枝烂叶、腐烂稻草中用无菌小铲、纸袋取土样，并记录取样的地理位置、pH、植被情况等。
（学生自取）2. 培养基①肉汤培养基（附录Ⅱ-1.1）：100 mL/组，其中20 mL液体培养基/250 mL△中（内装玻璃珠10颗）；50 mL固体斜面培养基分装在试管中：5mL/支，10支。
组成：牛肉膏0.5% 蛋白胨1% NaCl 0.5% pH 7.2～7.4 121℃，灭菌20min②酪素培养基（附录Ⅱ-1.10）：200 mL/500 mL△×1（10-12个平板，每组6个平板）* 酪素的母液浓度为4%，是将4g干酪素溶解于0.1N的30-35ml的NaOH水溶液中，水浴溶解20min，待溶解完全后加入60-70℃热水稀释到所需浓度（即定容到100 mL），即得到母液浓度围4%的酪素溶液。
蛋白酶产生菌的分离鉴定及筛选
蛋白酶产生菌的分离鉴定及筛选1. 引言蛋白酶是一类能够降解蛋白质的酶，在许多工业领域具有广泛的应用价值。
因此，发现和筛选具有高蛋白酶产量的菌株成为了很多研究人员的关注点。
本文旨在介绍蛋白酶产生菌的分离鉴定及筛选的方法和步骤。
2. 蛋白酶分离菌株的采集蛋白酶产生菌株可以从各种环境中采集得到，常见的源包括土壤、水样、植物表面等。
采集时需要注意避免污染和样品间的干扰。
常用的采集方法包括无菌棉签擦拭、土壤样品采集等。
3. 蛋白酶分离菌株的分离和筛选3.1 培养基选择和制备蛋白酶分离菌株的分离需要选择合适的培养基，常见的培养基包括含蛋白质和多肽的培养基，如酵母提取物培养基、肉汤培养基等。
培养基制备时需要注意无菌操作，避免细菌污染。
3.2 菌株的分离将采集得到的样品均匀涂布在选定的培养基上，使用无菌棉签或铲子进行均匀涂布。
将涂布后的培养基培养于适宜的温度和时间下，一般常见的培养温度为30摄氏度。
3.3 蛋白酶活性筛选使用适当的蛋白酶活性指示剂，如casein等，在培养基上进行盘状培养。
通过观察培养基上蛋白质的降解情况，筛选出具有高蛋白酶活性的菌株。
此外，也可通过测定培养液中蛋白酶的活性来进行筛选。
4. 蛋白酶产生菌株的鉴定4.1 形态观察观察菌落的形态特征，如菌落的形状、颜色、透明度等，以及菌株的菌落生长速度等。
4.2 生理生化特性检测进行菌株的生理生化特性检测，包括产酸、产气、葡萄糖利用、氧需求等。
常用的方法包括气压油技术、碳水化合物利用酶技术等。
4.3 分子生物学鉴定采用分子生物学方法对菌株进行鉴定，如16S rRNA序列分析、PCR等。
将菌株的DNA提取出来，进行引物扩增，然后通过测序和序列比对，确定菌株的分类信息。
5. 结论通过蛋白酶产生菌的分离鉴定及筛选，可以获得具有高蛋白酶产量的菌株。
这些菌株在生物技术、食品工业等领域具有广泛的应用前景。
未来的研究可以进一步优化培养条件，提高菌株的蛋白酶产量，并应用于相关的工业生产中。
一株耐盐蛋白酶高产菌的筛选与初步鉴定
一株耐盐蛋白酶高产菌的筛选与初步鉴定随着全球气候变化和人类活动的影响，盐碱化和荒漠化的问题日益严重。
盐碱土壤中的高盐浓度不但对植物生长带来影响，也对微生物生长带来极大的压力。
而在这样的环境中，若能筛选出一些耐盐菌株，对维护土壤生态平衡和提高农业生产力都有着积极的意义。
本研究采用土壤样品培养菌株与测序分析相结合的方法，筛选出一株耐盐蛋白酶高产菌，并对其进行初步鉴定和评价。
1、筛选菌株从渭南市半夏沟盐碱土壤中挖取样品，使用平板法选取耐盐菌。
筛选条件为：15%NaCl、pH=8.0、温度为37°C。
经过3个孔眼培养基的筛选后，获得了一株能够在高盐高碱环境下生长的菌株。
2、16S rRNA测序分析使用菌落PCR方法提取该菌株的基因组DNA，将其16S rDNA片段扩增并纯化，测序结果表明该菌株属于葡萄球菌属。
经过BLAST比对分析，其与NCBI数据库中的Staphylococcus arlettae的同源性可达到99.67%。
3、蛋白酶高产能力评价培养该菌株于含有1.5%NaCl的LB培养基中，经过48小时后采集细胞沉淀并测定其蛋白酶活性水平。
结果表明，该菌株可产生100U/mL的蛋白酶活性，具有良好的蛋白酶高产能力。
4、耐盐性评价在不同浓度的NaCl中对该菌株进行耐盐性评价。
结果表明该菌株最大耐盐浓度为18%NaCl，具有较强的耐盐能力。
5、蛋白酶酶学性质研究将该菌株的蛋白酶纯化并研究其酶学性质。
结果表明，该蛋白酶在pH=9.0~10.0和温度为50℃时具有最高酶活性，属于碱性蛋白酶。
综合上述结果可知，本研究筛选出一株具有较强耐盐能力和蛋白酶高产能力的Staphylococcus arlettae，对于盐碱土壤的改良和农业生产都具有重要的潜在应用前景。
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蛋白酶产生菌的筛选及活力的测定
作者刘艳芝指导教师张玲秀
（忻州师范学院生物系1201班034000）
摘要：采用忻州师范学院校园附近土壤、农田土壤及体育场土壤作为样品，并从中筛选分离并得到产蛋白酶能力较高的菌株，经过初步鉴定该菌株属芽孢杆菌。
通过对其产酶条件进行优化，结果显示该菌产酶最佳碳源为质量浓度15g/L 的乳糖，最佳氮源为质量浓度20g/L的尿素，最适初始pH值为6.5，最适发酵温度为35℃。
关键词：菌种筛选；鉴定；蛋白酶；条件优化
蛋白酶蛋白质中肽键水解的酶，是一类广泛应用于皮革、毛皮、丝绸、医药、食品、酿造等方面的重要工业用酶，也是目前世界上产销量最大的商业酶，其市场占有率约占整个商品酶销售量的60％，微生物蛋白酶从微生物中提取，不受资源、环境和空间的限制，具有动物蛋白酶和植物蛋白酶所不可比拟的优越性。
目前，蛋白酶的研究仍注重于新品种的发掘，并通过分离筛选、发酵条件优化和诱变育种或构建基因工程菌等综合手段获得高产蛋白酶的优良菌株。
我国的蛋白酶研究还存在如微生物资源开发不足，蛋白酶种类较少，酶制剂品种单一等问题。
本论文从以下几方面对蛋白酶产生菌株进行较为系统的研究：从土壤中筛选出产蛋白酶能力较高菌株。
对筛选出的菌株进行形态学的鉴定，将菌株初步确定到属。
研究产蛋白酶菌株发酵产酶条件，对培养基成分和发酵条件进行优化，确定最佳培养基配方和发酵条件，进一步提高菌株的产酶活力。
一、材料及方法：
1.1 实验材料与仪器
实验仪器：高压灭菌锅，恒温培养箱，超净工作台，电子分析天平，pH测量仪，水浴锅，微波炉，紫外光可见分光光度计，摇床、酒精灯、接种针、游标卡尺、无菌移液管、无菌试管、量筒、容量瓶、漏斗、试剂瓶、漏斗、载玻片、滤纸、擦镜纸。
1.2 实验材料：
样品：取自忻州师范学院附近的土壤。
试剂：无菌水（带玻璃珠）、100ug/ml 酪氨酸溶液、PH8.0硼酸缓冲液、
0.4mol/L三氯乙酸、牛肉膏蛋白胨培养基、酪蛋白培养基、产蛋白酶发酵培养基
二、操作步骤
（一）配制所需培养基
按照以下配方配制所需的培养基
牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏0.5g，蛋白胨1g，NaCl 0.5g，琼脂1.5～2.0g，水100ml，pH 7.2，配制200mL
酪蛋白培养基：牛肉膏0.3g，酪素1g，NaCl 0.5g，琼脂2g ，定容于100ml
产蛋白酶发酵培养基：玉米粉6g，豆粉4g，磷酸二氢钾0.03g，碳酸钠0.1g，磷酸氢二钠0.4g，定容于100ml
（二）分离
1.洗涤培养皿、试管等实验器具，与121℃高压灭菌20min
2.采集土壤样品，用无菌水植被1:10土壤悬液。
3.取1:10土壤悬液5 mL ，注入已灭过菌的试管中，将此试管放入75℃恒温水浴中热处理10min ，以杀死非芽孢细菌及其他微生物。
4.取加热处理过的土壤悬液100～200μL ，涂布接种到牛肉膏蛋白胨培养平板，后将平板倒置，于30～32℃下培养24～48h.
（三） 筛选
1、从判定为芽孢杆菌的菌落处，分别挑取少许菌苔，接种于酪蛋白培养基，30～32℃下倒置培养24～48h 。
2、选择水解圈直径与菌落直径比值大的菌，接入产蛋白酶发酵培养基30-32℃振荡培养48小时，将发酵液过滤或离心，取清夜检测蛋白酶活力进行复筛。
（四）蛋白酶活力的测定
1. 原理：蛋白酶在一定条件下不仅能够水解蛋白质中的肽键，也能够水解酰胺键和酯键，因此可用蛋白质或人工合成的酰胺及酯类化合物作为底物来测定蛋白酶的活力。
本实验选用酪蛋白为底物，测定微生物蛋白酶水解肽键的活力。
酪蛋白经蛋白酶作用后，降解成相对分子质量较小的肽和氨基酸，在反应混合物中加入三氯醋酸溶液，相对分子质量较大的蛋白质和肽就沉淀下来，相对分子质量较小的肽和氨基酸仍留在溶液中，溶解于三氯醋酸溶液中的肽的数量正比于酶的数量和反应时间。
在275nm 波长下测定溶液吸光度的增加，就可计算酶的活力。
2. 绘制标准曲线
取7支试管，按下表加入试剂：
将各管溶液混匀，40℃预热2min ，用滤纸过滤，滤液用紫外分光光度计测定275nm 的吸光值，用Excel 软件求回归方程，并计算出1ug/ml 酪氨酸的吸光值。
3.实验步骤
（1）取5ml 用PH8.0硼酸缓冲液制备的0.6%酪蛋白溶液于试管中，40℃保温20min 后加入1：20以PH8.0硼酸缓冲液稀释的酶液1ml ，40℃反应10min 后，加入5ml0.4mol/ml 三氯乙酸以终止反应，并沉淀残余底物，40℃保温20min 使沉淀完全，用漏斗加滤纸过滤，滤液用紫外分光光度计测定275nm 的吸光值。
（2）空白组先加三氯乙酸使酶失活，后加酪蛋白，按上述同样步骤测定吸光值。
4.计算酶活力
以1min 内有酪蛋白释放的三氯乙酸可溶物在275nm 的吸光值于1ug 酪氨酸相当时，其所需要的酶量为1个单位。
项目 0 1 2 3 4 5 6 100ug/ml 酪氨酸溶液（ml ） 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 酪氨酸浓度（ug/ml ） 0 10 20 30 40 50 60 PH8.0硼酸缓冲液 6.0 5.9 5.8 5.7 5.6 5.5 5.4 0.4mol/l 三氯乙酸（ml ）
5 5 5 5 5 5 5
酶活（U/ml ）=n A 10A -A 20
1⨯⨯n A 10A -A 20
1⨯⨯
式中，10——反应时间10min
A 1————酶反应可溶物的吸光值，
A 0————空白对照可溶物的吸光值，
A 2————1ug/ml 酪氨酸的吸光值
实验结果及数据分析： 实验所测标准曲线数据如下：
试管号 0 1 2 3
4 5 6 酪氨酸的浓度（ug/ml ） 0 10
20 30
40 50 60 A 275下的吸光值
0 0.021 0.028 0.036
0.046 0.057 0.073
标准曲线绘制如下：
由图中可知，线性关系为y=0.0011x+0.0042
在实验过程中，测得的A 1=0.005，A 0=0
由以上数据知，酶活（U/ml ）=0.9
实验结果：失败
原因：液体培养基在灭菌时，因喷溅而使液体培养基凝固，接入产蛋白酶菌后，培养基因凝固而使菌生长分布不均匀，甚至不生长，所以测蛋白酶活力时，菌太少使测得数据太小。