蛋白酶产生菌的筛选
耐高温蛋白酶产生菌的筛选及酶学特性的初步研究
水 产 品深加 工 广 东普 通 高校 重点 实验 室 ， 广 东湛 江 ５ ２ ４ ０ ８ ８ ； ２ ． 广 东省水 产 品深加 工及 副产 物 高值化 利 用工程技 术研 究 中心 ，
湛 江恒 兴水 产科技 有 限公 司 ， 广 东湛江 ５ １ ０ ３ ０ ０ ）
摘 要： 为 了提 供 可用 于 水 产 饲 料 添 加 剂 用 途 的蛋 白酶 ， 从 玛 珥 湖环 境 中筛选 出耐 高温 蛋 白酶 产 生 菌株 。通 过 牛 奶 平
（ １ ． Ｃ ｏ ｌ ｌ ｅ ｇ ｅ ｏ ｆ Ｆ ｏ ｏ ｄ Ｓ ｃ ｉ ｅ ｎ ｃ ｅ ａ ｎ ｄ Ｔ ｅ ｃ ｈ ｎ ｏ ｌ ｏ ｇ ｙ ， Ａ ｑ ｕ ａ ｔ ｉ ｃ Ｐ ｒ ｏ ｄ ｕ ｃ ｔ Ｐ ｒ ｏ ｃ ｅ ｓ ｓ ｉ ｎ ｇ ａ ｎ ｄ Ｓ ａ ｆ ｅ ｔ ｙ Ｋ ｅ ｙ Ｌ ａ ｂ ｏ ｆ
板 筛选的方法从土壤 中分 离获得 ３ ０株产蛋白酶菌株 ， 并通过摇瓶发酵 复筛的方法 筛选产酶最高的菌株 Ｈ Ｌ 一 ３ ， 其发酵
液 的 蛋 白酶 活 性 高 达 ３ ９ ９ ． ２ Ｕ ／ ｍ Ｌ 。通 过 生 理 生化 特 征 鉴 定 、 １ ６ Ｓ ｒ Ｄ Ｎ Ａ 基 因序 列和 系统发 育 分析 ， 初 步 鉴 定 菌 株 Ｈ Ｌ 一 ３为地 衣 芽孢 杆 菌。 菌株 Ｈ Ｌ 一 ３所 产 蛋 白 酶 的 最适 作 用 温度 为 ７ ０℃ ， 最适 ｐ Ｈ为 ７ ． ０ ， 在９ ０℃ 保 温 １ ０ ｍ ｉ ｎ后 酶 活 力 仍 可保 留 ７ ５ ． １ ２ ％ 。在 离子 浓度 为 １ ． ０×１ ０ ～ｍ ｏ ｌ ／ Ｌ时 ， Ｃ ｕ “和 Ｍ ｎ 对 该 酶 有较 强 的抑 制 作 用 ， Ｆ ｅ 、 Ｚ ｎ “、 Ｃ ａ “ 对 该
蛋白酶产生菌的筛选及发酵条件的优化
关 键词 ：蛋白酶；筛选；枯草芽孢杆菌；优化
中图分 类 号 ：Ｑ ９ ３ ９ ． ９ ７
文 献标 志 码 ：Ａ
文 章编 号 ：１ ０ ０ １ — ９ ６ ７ ７ （ ２ ０ １ ４ ） ０ ７ — ０ ０ ６ ７ — ０ ４
Ｏｐ ｔ ｉ ｍｉ ｚ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ Ｓ ｃ ｒ ｅ ｅ ｎ ｉ ｎ ｇ ｏ ｆ Ｐｒ ｏ ｔ ｅ ａ ｓ ｅ Ｐ ｒ ｏ ｄ ｕ ｃ ｉ ｎ ｇ Ｓ ｔ ｒ ａ ｉ ｎ ａ ｎ ｄ ｔ ｈ ｅ Ｆｅ ｒ ｍｅ ｎ ｔ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ Ｃｏ ｎ ｄ ｉ ｔ ｉ ｏ ｎ
第４ ２卷第 ７期 ２ ０ １ ４年 ４月
广
州
化
工
Ｖｏ １ ． ４ ２ Ｎｏ ． ７ Ａｐ ｒ ． ２ ０ １ ４
Ｇｕ ａ ｎ ｇ ｚ ｈ ｏ ｕ Ｃｈ ｅ ｍｉ ｃ ａ ｌ Ｉ ｎ ｄ ｕ ｓ ｔ ｒ ｙ
蛋 白酶 产 生 菌 的 筛 选 及 发 酵 条 件 的 优 化
７ ５ ％为水解 酶类 ，蛋 白酶 为工业生产 酶三 大类 之一 ，其 市值 约 占总市值 ６ ５ ％＿ ４ Ｊ 。蛋 白酶存 在于所有生活有机休 中，因此 可从
１ ． １ 材
料
１ ． １ ． １ 菌种 来 源 本公 司分离鉴定保存 。
１ ． １ ． ２ 主要 试 剂
酵母 膏（ Ｂ Ｒ） ：英 国 Ｏ Ｘ Ｏ Ｉ Ｄ公司 ，胰蛋 白胨 （ Ｂ Ｒ） ：国药集 团化学试 剂 有 限公 司 ，脱 脂 奶粉 ：国药集 团 化学 试 剂有 限公
ｐｒ ｏ ｃ ｅ ｓ ｓ ｔ ｏ ｐ ｒ ｏ ｄ ｕｃ ｅ ｐ ｏ ｌ ｙ—ｐ ｅ ｐ ｔ ｉ ｄ ｅ ． Ｂｙ ｒ ｅ ｐ ｅ ａ ｔ ｅ ｄ ｓ ｉ ｆ ｔ ｉ ｎ ｇ ｓ ｏ ｆ ｂ ｃ ｔ ｅ ｒ ｉ ａ ｌ ｓ ｔ ｒ ａ ｉ ｎ ｓ，ａ ｐ ｒ ｏ ｄ ｕｃ ｔ ｉ ｖ ｅ ｐ ｒ ｏ ｔ ｅ ａ ｓ ｅ ｂ ａ ｃ ｔ ｅ ｉａ ｒ ｌ ｓ ｔ ｒ ａ ｉ ｎ Ｂａ ｃ ｉ ｌ ｌ ｕ ｓ
蛋白酶产生菌的分离鉴定及筛选
蛋白酶产生菌的分离、鉴定和筛选是一项重要的微生物学工作，通常用于寻找能够产生具有特定功能的蛋白酶的细菌或真菌菌株。
以下是一般的步骤和方法：
1. 样品采集：首先从土壤、水体、食品等环境中采集样品，可能含有潜在的蛋白酶产生菌。
2. 分离：将样品进行稀释处理后，通过涂布法、稀释涂布法、过滤法等分离方法，在富含寒原蛋白酶的寒原平板培养基上培养，以分离出单菌种。
3. 纯化：将分离得到的单菌种进行多次传代，确保单一菌株的纯化。
4. 鉴定：利用生理生化试验、形态学观察、生物学特性和分子生物学方法（如16S rRNA序列分析）等手段，对分离得到的菌株进行鉴定，确定其分类地位。
5. 筛选：利用含有蛋白质底物的培养基（如乳清蛋白、明胶等）进行筛选，观察菌株在培养基上的透明圈或发酵液的浑浊度变化，筛选出产生蛋白酶活性高的菌株。
6. 活性测定：对筛选出的蛋白酶产生菌株进行蛋白酶活性测定，确
定其蛋白酶活性水平。
7. 保存与应用：对获得的蛋白酶产生菌株进行保存，并进一步研究其生物学特性和应用潜力，如酶学特性、温度和pH稳定性等。
通过以上步骤，可以有效地从环境样品中分离、鉴定并筛选出具有高蛋白酶产量和活性的菌株，为后续的蛋白酶生产及应用研究提供了可靠的菌种资源。
5产蛋白酶菌株的筛选2019
三、器材
1.菌株 从自然界筛选获得的蛋白酶产生菌株 2.溶液和试剂 蛋白胨，酵母粉，脱脂奶粉，琼脂，干酪素，三氯醋酸，NaOH，
Na2CO3,Folin试剂，硼砂，酪氨酸，水等 3.仪器和用品 三角烧瓶，培养皿，吸管，试管，涂布棒，玻璃搅拌棒，培养摇
床，高压灭菌锅，直尺，玻璃小漏斗和滤纸
四、操作步骤
1.牛奶平板培养基的配制及灭菌 牛奶平板：在普通肉汤蛋白胨
固体培养基中添加终质量浓度为 1.5%的ห้องสมุดไป่ตู้奶
2.倒平板
四、操作步骤
3.制备土壤悬液 4.涂布 5.培养 6.观察记录
五、注意事项
培养基灭菌条件的控制。
六、实验结果
将菌落计数结果记录于下表中。
七、思考题
1.在选择平板上形成蛋白透明水解圈大小是否能作为 判断菌株产蛋白酶能力的直接证据？为什么？ 2.简单设计一方案，从实验中初筛得到的产蛋白酶菌 落里获得某个碱性蛋白酶的高产菌株。
产蛋白酶菌株的筛选
生物制药系 2019年12月
一、实验目的
学习用选择平板从自然界中分离胞外蛋白酶产生 菌的方法。
二、实验原理
蛋白酶在轻工、食品、医药工业中用途非常广泛。 微生物来源的碱性蛋白酶都是胞外酶，具有产酶量高， 适合大规模工业生产等优点，被认为是最重要的一类营业 性酶类。自然界筛选获取有用的微生物资源一直是微生物 学的一项重要工作。 自能够产生胞外蛋白酶的菌株在牛奶平板上生长后，其 菌落周围可形成明显的蛋白水解圈。水解圈与菌落直径的 比值常被作为判断该菌株蛋白酶产生能力的初筛依据。
产蛋白酶菌的筛选及产酶条件优化
陇东大学学士学位毕业论文（设计）蛋白酶产生菌的筛选及产酶条件优化生命科学与技术学院08生物技术班作者：指导教师：蛋白酶产生菌的筛选及产酶条件优化何泰杜旭谢丽娟，刘丽萍(陇东学院生命科学与技术学院，甘肃庆阳745000)摘要：采用陇东学院污水处理厂附近土壤、农田土壤及养殖场附近土壤作为样品，利用牛奶水解圈筛选模型从中分离筛选得到产蛋白酶能力较高的菌株whr1，初步鉴定该菌株属于芽孢杆菌。
并对其产酶条件进行优化，结果显示该菌最适培养时间为24h，最佳碳源为质量浓度1% 蔗糖，最佳氮源为质量浓度1.5%酵母膏，最适初始pH值为6.0，最适发酵温度为35℃。
关键词：菌种筛选，鉴定，蛋白酶，条件优化Protease produced the screening of the bacteria and the optimization of theenzyme production conditions（College of life science and technology, Longdong University, Qingyang 74500, Gansu, China）Abstract：The sewage treatment plant soil near east institute, soil and soil samples near farms .Using milk hydrolysis circle screening model separating screening in high ability get protease whr1 strains. Preliminary appraisal of the fungus belong to bacillus. After the optimization of the condition, the capability of whr1 was improved, the optimal condition is: The time is 24h; carbon source is sucrose 1%; nitrogen source is Yeast extract 1.5 %, the pH is 6.0; fermentation temperature is 30℃.Keyword: Screening，Identified，Protease, Conditions optimization0引言蛋白酶是水解蛋白质肽键的一类酶的总称，是一类广泛应用于皮革、毛皮、丝绸、医药、食品、酿造等方面的重要工业用酶[1]，也是目前世界上产销量最大的商业酶，其市场占有率约占整个商品酶销售量的60％，微生物蛋白酶从微生物中提取，不受资源、环境和空间的限制，具有动物蛋白酶和植物蛋白酶所不可比拟的优越性[2,3]。
微生物实验设计-产蛋白酶菌株的筛选
微生物实验设计-产蛋白酶菌株的筛选产蛋白酶菌株的筛选级分离一、实验原理自能够产生胞外蛋白酶的菌株在牛奶平板上生长后，其菌落周围可形成明显的蛋白水解圈，水解圈与菌落直径的比值，常被作为判断该菌株蛋白酶产生能力的初筛依据。
将腐烂的大豆浸泡液中的细菌接种在含有酪素的培养基上进行培养。
由于产蛋白酶菌株能在干酪素的培养基上形成无色透明圈，因此能将产蛋白菌株分离出来，分离出来的菌株经再次培养，就可获得纯种产蛋白酶的菌株。
二、实验器材1.菌种：从大豆浸泡液中获得2.培养基:(1)PDA斜面培养基：马铃薯200g，蔗糖20g,琼脂20g,水1000ml.马铃薯去皮，切成块，煮沸半小时后用纱布过滤，再加糖及琼脂，溶化后补水至1000ml，121℃灭菌30min备用。
（2）干酪素琼脂培养基：干酪素4.0g，用20ml 0.1mol/L NaOH溶液溶解后再加20g琼脂，加蒸馏水煮沸加水至1000ml 121℃灭菌30min备用。
3.试剂：无菌水。
4.仪器：天平，电磁炉，烧杯，无菌试管，无菌培养皿，高压灭菌锅，锥形瓶，接种环，涂布棒，酒精灯，恒温培养箱。
三、实验步骤1.将腐烂的大豆放入无菌水中浸泡，制成细菌悬浮液。
2.用涂布棒蘸取菌液接种于PAD培养基中，26℃培养48h。
3.倒置于酪素琼脂培养基平板上，37℃培养24h。
4.挑取培养好的菌落接种于平板上，28℃培养48h。
5.观察各菌落周围形成的透明圈的情况。
6.选取透明圈较大的三个菌落分别接种在干酪素琼脂培养基上，28℃培养48h。
7.观察受否为单菌落，若为单菌落且有透明圈，则为纯种产蛋白酶菌株。
若有杂菌，则需要重复步骤6，直到培养出纯菌为止。
参考文献[1]代玉梅.蛋白酶高产菌株的筛选鉴定及酶学性质研究[D].青岛:青岛大学,2008.[2]黄志强,林白雪,谢联辉.产碱性蛋白酶海洋细菌的筛选与鉴定[J].福建农林大学学报:自然科学版,2006,35(4):416-420.。
蛋白酶产生菌的分离鉴定及筛选。
蛋白酶产生菌的分离鉴定及筛选。
蛋白酶产生菌的分离鉴定和筛选可以按照以下步骤进行：1.样品收集：从环境样品（如土壤、水样、发酵物等）中收集样品，注意收集样品需要符合生物安全和伦理规范。
2.分离菌株： a. 样品处理：将样品进行适当的稀释处理，以获得适量的单菌落。
b. 培养基选择：根据目标酶的特性，选择合适的培养基进行菌株分离。
常用的培养基有LB（大肠杆菌培养基）、TSA（琼脂糖营养平板培养基）等。
也可以添加特定的底物来富集酶活菌株。
c. 接种和分离：将处理后的样品接种在选定的培养基上，并进行营养和环境条件的适当调整。
通过稀释分离法，将单菌落分离至不同的培养皿中，得到纯培养的菌株。
3.酶活性测定： a. 初步筛选：将分离的菌株进行初步筛选，通过对菌落的酶活性直接观察或使用浸润琼脂糖等方法判断酶的活性。
b. 液体培养：将筛选出的菌株进行液体培养，收集培养物用于后续的酶活性测定。
c. 酶活性测定：通过适当的酶活性测定方法（如改良的Casein酶活测定法、Azocasein酶活测定法等）来评估菌株的酶活性。
4.酶产量测定： a. 最优菌株筛选：根据酶活性测定结果，选择酶活性较高的菌株。
b. 酶产量测定：对选定的菌株进行批量发酵或连续发酵实验，通过酶活性和菌体生长曲线的测定，估计菌株的酶产量。
5.菌株鉴定： a. 形态学特征：观察菌落的形态学特征，如形状、颜色、质地等。
b. 生理生化特性：进行生理生化测试，包括生长方式、耐受性、产酸性、酶反应等。
c. 分子生物学鉴定：通过PCR方法扩增和测序16S rRNA基因，进行菌株的分子鉴定，并与已知菌株进行比对。
这些步骤将有助于从样品中分离、鉴定和筛选出蛋白酶产生菌株。
根据筛选结果，选择高酶活性和高酶产量的菌株，可以进行后续的酶性质研究、表达载体构建等工作。
在实践中，根据具体实验条件和要求，可能需要进行适当的优化和调整。
碱性蛋白酶产生菌的筛选
文章编号:1001-3717(2006)01-0070-03碱性蛋白酶产生菌的筛选3李树文,陆秀华,尚海利(莱阳农学院生命科学院,山东青岛266109)摘要:本试验从5份土壤中共筛选出产碱性蛋白酶菌株9株,即SHL-4、SHL-6、SHL-7、SHL-10、SHL-8、SHL-11、SHL-12、SHL-18、SHL-20,其中SHL-4、SHL-6、SHL-7、SHL-10产酶效果较好;采用正交试验设计,初步地确定了菌株SHL-4产酶培养基组分,即蛋白胨0.5%、牛肉膏1.5%。
关键词:碱性蛋白酶;筛选;菌株中图分类号:Q939.97文献标识码:AScerrning R ning of Alkaline Protease Producing StrainsL I Shu2wen,L U Xiu2hua,SHAN G Hai2li(Life Science College,L AC,Qingdao266109,China)Abstract:Nine st rains producing alkaline p rotease were screened out f rom five soil samples,namely SHL-4、6、7、10、8、11、12、18、20,SHL-4、6、7、10of which wit h high protease activity.Through an or2 t hogonal test,t he p roducing protease cult ure medium of t he SHL-4st rain was confirmed preliminarily, namely0.5%of pepto ne,1.5%of beef ext ract.K ey w ords:alkaline protease;screening;st rain 碱性蛋白酶是指在碱性的条件下具有活性,能够水解蛋白质肽键的酶类。
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蛋白酶产生菌的筛选
组别：第*组
班级：生工**班
组员：***
指导老师：***
一、实验目的
学习从自然界中分离蛋白酶产生菌
二、实验内容
蛋白酶产生菌的分离
三、实验原理
许多细菌和霉菌产生蛋白酶，细菌中的芽孢杆菌是最常见的蛋白酶产生菌。
本实验将土壤样品悬液加热处理，杀死非芽孢细菌及其他微生物后进行划线分离得到芽孢杆菌，将其接种到奶粉培养平板并进行培养，根据奶粉平板的水解圈做初筛。
将初筛的蛋白酶产生菌接入产酶培养基振荡培养，测定蛋白酶的活力，最终得到产蛋白酶的芽孢杆菌。
也可直接将细菌接种到奶粉培养平板进行培养，分离筛选其他蛋白酶产生菌。
四、实验材料和用具
1.材料：土壤样品
2.试剂：牛肉膏蛋白胨培养及平板、奶粉培养基平板、45mL
无菌水（带玻璃珠）、芽孢染色液、
3.仪器及用具：紫外分光光度计、显微镜、恒温水浴锅、摇
床、酒精灯、接种针、游标卡尺、无菌移液
管、无菌试管、量筒、容量瓶、漏斗、试剂
瓶、漏斗、载玻片、滤纸、擦镜纸。
五、操作步骤
（一）配制所需培养基
按照以下配方配制所需的培养基
牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏 0.5g，蛋白胨 1g，NaCl 0.5g，
琼脂 1.5～2.0g，水 100ml，pH 7.2
配制200mL
奶粉培养基：牛肉膏 0.5g，蛋白胨 1g，NaCl 0.5g，
琼脂 2.0g，水 100ml，pH 7.0～7.2
脱脂奶粉 3g，配制200mL
（二）分离
1.采集土壤样品，用无菌水植被1:10土壤悬液。
2.取1:10土壤悬液5 mL，注入已灭过菌的试管中，将此试
管放入75～80℃水浴中热处理10min以杀死非芽孢细菌。
3.取加热处理过的土壤悬液100～200μL，涂布接种到牛肉
膏蛋白胨培养平板，后将平板倒置，于30～32℃下培养24～48h.
4.对长出的单菌落进行编号，选择表面干燥、粗糙、不透明
的菌落，挑取少许菌苔涂片，做芽孢染色，判断是否为芽孢杆菌。
（三）筛选
1、从判定为芽孢杆菌的菌落处，分别挑取少许菌苔，先接种奶粉斜面培养基，再转接奶粉培养基平板上，30～32℃下培养24～48h。
2、选择水解圈直径与菌落直径比值大的菌，接入牛肉膏蛋白胨培养基30-32℃振荡培养48小时，将发酵液过滤或离心，取清夜检测蛋白酶活力进行复筛。
六、实验结果：
相关图片：
（2）菌株的分离
根据菌落大小、形状、表面光泽、隆起程度、透明程度、边缘性
状和菌落颜色的差别，最终从培养基上筛选出23个菌落。
（3）将分离到的菌株分别接种到含脱脂奶粉的培养基上，置于32℃培养60h，于室温下观察是否产生细胞外蛋白酶，分解培养
基中的脱脂牛奶，进而产生肉眼可见的水解透明圈。
结果表明，
在接种的23株菌落中，共有18株产生胞外蛋白酶分解脱脂牛奶，形成肉眼可见的透明圈。
从中筛选出9株水解圈与菌落直径比值
较大的菌株。
如下表：
菌株编
号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 比值++ ++ + ++ ++ + + + + 说明：“+”表示：水解圈与菌落直径比值约为3：1，“++”表示：
水解圈与菌落直径大于3：1.。
六、结果分析
在奶粉培养基平板上，蛋白质被孢芽杆菌产生的蛋白酶水解，形成透明圈（见实验相关图片）。
不同种类的微生物产生的蛋白酶的种类和活力各不相同，起对奶粉中蛋白质的水解能力各不相同，所形成的水解圈与菌落大小比值故而不同，因而根据其比值可初步断定其对奶粉中蛋白质的水解能力。
组员签字：。