2产蛋白酶菌株的筛选
产蛋白酶菌的筛选及产酶条件优化
大庆师范学院本科生毕业论文蛋白酶产生菌培养条件的条件优化院(部)、专业生命科学学院生物技术研究方向微生物学学生姓名朱琳学号200901122598指导教师姓名张亦婷2013年06月01日摘要采用大庆师范学院生命科学学院花园附近土壤、农田土壤及体育场附近土壤作为样品，并从中筛选分离并得到产蛋白酶能力较高的菌株，经过初步鉴定该菌株属芽孢杆菌。
通过对其产酶条件进行优化，结果显示该菌产酶最佳碳源为质量浓度15g/L的乳糖，最佳氮源为质量浓度20g/L的尿素，最适初始pH值为6.5，最适发酵温度为35℃。
关键词：菌种筛选；鉴定；蛋白酶；条件优化AbstractThe sewage treatment plant soil near east institute, soil and soil samples near farms .Using milk hydrolysis circle screening model separating screening in high ability get protease whr1 strains. Preliminary appraisal of the fungus belong to bacillus. After the optimization of the condition, the capability of whr1 was improved, the optimal condition is: carbon source is sucrose 15g/L; nitrogen source is Yeast extract 20g/L, the pH is 6.5; fermentation temperature is 35℃.Key words：Screening；Identified；Protease；Conditions optimization目录摘要 (1)Abstract (2)1 引言 ...........................................................................................................................................................2 材料与方法 (3)2.2.2 实验材料 (3)2.2.1 菌株筛选 (3)3.1 菌株筛选 (6)3.1.1 菌株的分离筛选 (6)2.3 条件优化 (7)2.3.1 不同碳源对产酶的影响 (7)2.3.3不同氮源对产酶的影响 (8)2.3.4 培养基不同初始pH值对产酶的影响 (9)2.3.5 不同温度对产酶的影响 (10)4 结论 (10)11 引言蛋白酶是催化蛋白质中肽键水解的酶，是一类广泛应用于皮革、毛皮、丝绸、医药、食品、酿造等方面的重要工业用酶，也是目前世界上产销量最大的商业酶，其市场占有率约占整个商品酶销售量的60％，微生物蛋白酶从微生物中提取，不受资源、环境和空间的限制，具有动物蛋白酶和植物蛋白酶所不可比拟的优越性。
北京理工大学生物实验产蛋白酶菌种的分离与纯化
产蛋白酶菌种的分离与纯化--初筛一、目的要求1 学习蛋白酶产生菌的筛选方法。
2 掌握稀释涂布平板法从自然环境中分离纯化微生物的基本操作技术。
3 进一步熟练和掌握微生物无菌操作技术。
二、基本原理土壤是微生物生长的大本营，所含微生物无论是数量还是种类都是极其丰富的，因此土壤是微生物多样性的重要场所，是发掘微生物资源的重要基地，可以从中分离纯化得到许多有价值的菌株。
工业微生物菌种最初都来自于自然界。
但是自然界中微生物种类繁多，而且都是混居在一起的，要获得工业发酵菌株，首先必须把它们从混杂的微生物群体中分离出来。
从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。
常用的方法有：简单单细胞挑取法和平板分离法。
本实验用平板分离法。
平板分离法操作简便，普遍用于微生物的分离与纯化。
其基本原理包括两个方面：(1)选择适合于待分离微生物的生长条件，如营养，酸碱度，温度和氧等或加入某种抑制剂造成只利于该微生物的生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。
(2)微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落可以是由一个细胞繁殖而成的集合体。
因此可通过挑取单菌落而获得一种纯培养。
获取单个菌落的方法可通过稀释涂平板法或平板划线等技术完成。
值得指出的是从微生物群体中经分离生长在平板上的单菌落并不一定保证是纯培养。
因此纯培养的确定要经过一系列的分离与纯化过程和多种特征鉴定方能得到。
蛋白酶是一类重要的工业用酶制剂，它能将蛋白质分解成短肽甚至氨基酸。
根据三氯乙酸能将酪蛋白变性从而产生沉淀这一原理，可在平板培养基上直接筛选蛋白酶产生菌株。
产酶菌株能将酪蛋白水解成小分子物质，菌落周围不形成沉淀蛋白而出现透明圈，根据透明圈大小还能判断产酶活力。
三、实验器材与试剂1 样品土壤样品。
2 培养基酪素培养基配方如下：葡萄糖0.5gNaCl 5gK2HPO4 0.5gKH2PO4 0.5g干酪素10g蒸馏水1000ml琼脂20gpH 7.5115℃灭菌30min。
微生物实验设计-产蛋白酶菌株的筛选
微生物实验设计-产蛋白酶菌株的筛选产蛋白酶菌株的筛选级分离一、实验原理自能够产生胞外蛋白酶的菌株在牛奶平板上生长后，其菌落周围可形成明显的蛋白水解圈，水解圈与菌落直径的比值，常被作为判断该菌株蛋白酶产生能力的初筛依据。
将腐烂的大豆浸泡液中的细菌接种在含有酪素的培养基上进行培养。
由于产蛋白酶菌株能在干酪素的培养基上形成无色透明圈，因此能将产蛋白菌株分离出来，分离出来的菌株经再次培养，就可获得纯种产蛋白酶的菌株。
二、实验器材1.菌种：从大豆浸泡液中获得2.培养基:(1)PDA斜面培养基：马铃薯200g，蔗糖20g,琼脂20g,水1000ml.马铃薯去皮，切成块，煮沸半小时后用纱布过滤，再加糖及琼脂，溶化后补水至1000ml，121℃灭菌30min备用。
（2）干酪素琼脂培养基：干酪素4.0g，用20ml 0.1mol/L NaOH溶液溶解后再加20g琼脂，加蒸馏水煮沸加水至1000ml 121℃灭菌30min备用。
3.试剂：无菌水。
4.仪器：天平，电磁炉，烧杯，无菌试管，无菌培养皿，高压灭菌锅，锥形瓶，接种环，涂布棒，酒精灯，恒温培养箱。
三、实验步骤1.将腐烂的大豆放入无菌水中浸泡，制成细菌悬浮液。
2.用涂布棒蘸取菌液接种于PAD培养基中，26℃培养48h。
3.倒置于酪素琼脂培养基平板上，37℃培养24h。
4.挑取培养好的菌落接种于平板上，28℃培养48h。
5.观察各菌落周围形成的透明圈的情况。
6.选取透明圈较大的三个菌落分别接种在干酪素琼脂培养基上，28℃培养48h。
7.观察受否为单菌落，若为单菌落且有透明圈，则为纯种产蛋白酶菌株。
若有杂菌，则需要重复步骤6，直到培养出纯菌为止。
参考文献[1]代玉梅.蛋白酶高产菌株的筛选鉴定及酶学性质研究[D].青岛:青岛大学,2008.[2]黄志强,林白雪,谢联辉.产碱性蛋白酶海洋细菌的筛选与鉴定[J].福建农林大学学报:自然科学版,2006,35(4):416-420.。
酶工程实验指导
酶工程实验指导西南农业大学农学与生物科技学院2009年3月实验一产蛋白酶菌株的分离一、实验目的学习胞外生产微生物菌种的分离选择，熟悉分离菌种的基本操作。
二、实验原理工业上常用的生产酶的微生物有许多，重要的有枯草杆菌和真菌中的曲霉等等，它们都能产生耐热的芽孢或分生孢子，分离这类菌种时可采取先进行一定的热处理杀灭其它营养细胞，提高该菌株的相对数目。
根据胞外酶能分泌到培养基的特点，采用一定的方法在培养基上形成单菌落分泌的酶形成的“水解透明圈”，可对产酶的微生物的产酶能力（活力）进行初步估计、分离高产酶的微生物。
三、试剂、仪器高压灭菌锅，天平，无菌超净工作台，培养皿（8套/组）、试管（2支/组）、三角瓶、烧杯、酵母膏，蛋白胨，NaCl、琼脂粉，奶粉三、操作步骤1、带菌土壤的热处理称取1g带菌土壤湿润后放入80℃烘箱处理30min。
2、分离选择培养基的配制，各组按下列比例配制120ml培养基：奶粉2g ，自来水50ml，装入50ml三角瓶琼脂1.8g ，NaCl 0.5g，自来水70ml，装入100ml三角瓶自来水50ml，装入50ml三角瓶取50ml烧杯一个，放入5支带帽5ml离心管，灭菌备用。
分别封口，常规灭菌（121℃、20min）,灭菌后待冷却至不太烫手时混合上述液体，按无菌操作要领迅速倒平板8个，其中4个加有0.2ml不同稀释倍数（操作5）的样品液（菌悬液），迅速混合冷却形成平板，余4个平板冷却后用于涂布筛选。
3、稀释制备菌液，取5支灭菌带帽5ml离心管，各加入无菌水3.6ml备用；将热处理过的土壤放入无菌50ml烧杯中，加入无菌水10ml，搅拌后静置片刻，上层液体为微生物悬液，按下法稀释微生物悬液：在第一支试管中加入0.4ml微生物悬液，混合均匀后再取0.4ml到第二支试管中混合，从第二支试管中再取0.4ml到第三支试管中，以此类推。
4、斜面培养基配制：配制100ml LB培养基，加入1.5g琼脂粉、蛋白胨1.0g、酵母膏1.0g、NaCl、1.0g加水到100ml，调节pH=7,加热融化后，各组倒斜面培养基2 支，灭菌备用。
02 实验二 产中性蛋白酶芽孢杆菌的诱变育种
第二次实验：
（二）诱变处理：
预热：在正式照射前，应先开紫外线30min，让紫
外灯预热。
搅拌：取5ml制备的菌液加到直径9cm培养皿内，放
入一无菌磁力搅拌子，然后置磁力搅拌器上、15W
紫外线下30cm处。
照射：打开皿盖边搅拌边照射，所有操作必须在黑
暗或红灯下进行。
第二次实验：
（三）培养：
稀释：在红灯下分别取未照射的菌悬液(作为对照)
五、参考文献
一、目的意义
1、通过紫外线诱变的方法，筛选获得一
株高产中性蛋白酶的突变菌株。
二、材料方法
关键技术:
实验原理
技术路线
紫外线诱变
紫外线诱变育种的原理 紫外线的波长在200~380 nm 之间，但对
诱变最有效的波长仅仅是在253~265 nm，一
般紫外线杀菌灯所发射的紫外线大约有80% 是254 nm。
紫外线诱变的主要生物学效应是由于DNA
变化而造成的，DNA 对紫外线有强烈的吸
收作用，尤其是碱基中的嘧啶，它比嘌呤更 为敏感。紫外线引起DNA 结构变化的形式 很多，如DNA 链的断裂、碱基破坏。但其 最主要的作用是使同链DNA 的相邻嘧啶间 形成胸腺嘧啶二聚体，阻碍碱基间的正常配 对，从而引起微生物突变或死亡。
（五）突变株的筛选
1. 初筛（以量为主） 方法需简便、快速
2步
初筛 复筛
（1）利用形态变异：需预先测定形态与产量的相关性 （2）根据平板颜色反应直接挑选 透明圈法（蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶）； 抑菌圈法（抗生素）； 变色圈法（柠檬酸）、显色圈（氨基酸）； 沉淀圈法（外毒素） 透明圈直径（H）/菌落直径（C）：产量高低（初筛指标） 2. 复筛（以质为主，定量测定） 摇瓶培养，直接检测所需产物
生物采油解堵剂中产蛋白酶菌株的筛选及培养条件优化
作者简介 ： 左佳敏（ ９ ３ ， ， １ ８ 一） 女 硕士研究生 ， 主要从 事天然 产物 资源化学方面 的研究
・
９ ・ ６
第 ２ 期
左佳 敏 等 ： 物 采 油解 堵 剂 中 产 蛋 白 酶 菌株 的 筛选 及 培养 条 件 优 化 生
１ １ ２ 培养 基 ．＿
无 机 营养 液 （ ／ ） Ｎａ １ ． ； ｇ Ｌ ： Ｃ ０ ＮＨ４ １ ． ； Ｓ ． ２ Ｋ２ Ｏ ・Ｈ２ ． ； ＮＯ ． ； ３ Ｃ １ Ｍｇ Ｏ４ ０ ； ＨＰ ４ ３ Ｏ ０ ２ Ｎａ ３０ ２ ＫＨ２ Ｏ ０ ０ Ｐ ４
１ 材 料 与方 法
１ １ 材 料 ．
１ １ １ 菌株 ． ．
从 大 庆油 田原 油样 品 中筛选 得到 菌种 ， 经部 分生 理 生化实 验及 １ Ｓｒ ６ ＤＮＡ鉴 定 为铜绿 假单 胞菌 ．
收 稿 日期 ：０ ２—０ ２１ ２—２ ； ８ 编辑 ： 志平 任 基 金 项 目 ： 宁 省 工 业 攻 关 计划 项 目（０ ９２ ０ ３ 辽 ２０ ２ ３０ ）
酪素 培养 基［ （ ／ ： ｇ Ｌ） ＫＨ２ Ｏ４ ． ６ Ｍｇ Ｏ ． ； ｎ １ ０ ０ ４ Ｎ Ｃ ． ６ ＮａＨＰ ４ ７ Ｏ １ Ｏ ； Ｐ ３ ； Ｓ ４０ ５ Ｚ Ｃ ２ ． １ ； ａ １ １ ； ２ Ｏ ・ Ｈ２ ． ７ ０ ０ Ｃ Ｃ ２ ． ０ ； ｅ Ｏ ． ２ 干酪 素 ４ 琼 脂 ２ ． ； 离子 水 １０ ０ｍＬ ｐ ６ ５ ． ． ａ １００ ２ Ｆ Ｓ ４ ０ ； ０ ； ０ ０去 ０ ； Ｈ ． ～７ ０ 以上 培养 基使 用前 在 １ １℃ 、 ． ａ ２ ０ １ＭＰ 条件 下 灭菌 ３ ｉ． ０ｒ ｎ ａ
大
庆
微生物实验设计-产蛋白酶菌株的筛选
产蛋白酶菌株的筛选级分离一、实验原理自能够产生胞外蛋白酶的菌株在牛奶平板上生长后，其菌落周围可形成明显的蛋白水解圈，水解圈与菌落直径的比值，常被作为判断该菌株蛋白酶产生能力的初筛依据。
将腐烂的大豆浸泡液中的细菌接种在含有酪素的培养基上进行培养。
由于产蛋白酶菌株能在干酪素的培养基上形成无色透明圈，因此能将产蛋白菌株分离出来，分离出来的菌株经再次培养，就可获得纯种产蛋白酶的菌株。
二、实验器材1.菌种：从大豆浸泡液中获得2.培养基:(1)PDA斜面培养基：马铃薯200g，蔗糖20g,琼脂20g,水1000ml.马铃薯去皮，切成块，煮沸半小时后用纱布过滤，再加糖及琼脂，溶化后补水至1000ml，121℃灭菌30min备用。
（2）干酪素琼脂培养基：干酪素4.0g，用20ml 0.1mol/L NaOH溶液溶解后再加20g琼脂，加蒸馏水煮沸加水至1000ml 121℃灭菌30min备用。
3.试剂：无菌水。
4.仪器：天平，电磁炉，烧杯，无菌试管，无菌培养皿，高压灭菌锅，锥形瓶，接种环，涂布棒，酒精灯，恒温培养箱。
三、实验步骤1.将腐烂的大豆放入无菌水中浸泡，制成细菌悬浮液。
2.用涂布棒蘸取菌液接种于PAD培养基中，26℃培养48h。
3.倒置于酪素琼脂培养基平板上，37℃培养24h。
4.挑取培养好的菌落接种于平板上，28℃培养48h。
5.观察各菌落周围形成的透明圈的情况。
6.选取透明圈较大的三个菌落分别接种在干酪素琼脂培养基上，28℃培养48h。
7.观察受否为单菌落，若为单菌落且有透明圈，则为纯种产蛋白酶菌株。
若有杂菌，则需要重复步骤6，直到培养出纯菌为止。
参考文献[1]代玉梅.蛋白酶高产菌株的筛选鉴定及酶学性质研究[D].青岛:青岛大学,2008.[2]黄志强,林白雪,谢联辉.产碱性蛋白酶海洋细菌的筛选与鉴定[J].福建农林大学学报:自然科学版,2006,35(4):416-420.。
土壤中高产蛋白酶菌株的筛选鉴定及发酵条件优化
土壤中高产蛋白酶菌株的筛选鉴定及发酵条件优化耿芳;杨绍青;闫巧娟;刘军;龚思怡;江正强【摘要】从海南土壤中筛选得到一株高产蛋白酶的菌株,并对其进行菌种鉴定、产蛋白酶发酵条件优化及蛋白酶分子质量测定.经筛选,得到一株高产蛋白酶的菌株,编号为CAUH83,蛋白酶活力达到126 U/mL.通过形态观察、生理生化试验及16S rDNA序列分析,鉴定菌株CAUH83为粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens).通过单因素试验优化,确定该菌株产蛋白酶的最优发酵条件:大豆粉3.0％、蔗糖3.0％、初始pH 6.0、培养温度30 ℃、培养时间48 h.在此优化发酵条件下,该菌株产蛋白酶酶活力达到1 932.3 U/mL,较优化前提高15.3倍.通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和酶谱分析表明该蛋白酶分子质量约51 kDa.%A strain with high yield protease was isolated from soil sample of Hainan. The identification, fermentation conditions optimization and molecular mass of the strain were determined. After screening, a strain CAUH83 with high yield protease was obtained and the enzyme activity was 126 U/ml. Through morphological observation, physiological and biochemical tests and 16S rDNA sequence analysis, strain CAUH83 was identified asSerratia marcescens. The optimal fermentation conditions were optimized by single factor experiments as follows: soybean flour 3.0％, sucrose 3.0％, initial pH 6.0, culture temperature 30 ℃ and time 48 h. Under the optimal conditions, the highest protease activity of the strain was 1 932.3 U/ml, which increased 15.3 times higher than that of before optimization. The molecular mass of the protease was about 51 kDa by SDS-PAGE and protease zymogram analysis.【期刊名称】《中国酿造》【年(卷),期】2018(037)004【总页数】6页(P66-71)【关键词】粘质沙雷氏菌;筛选鉴定;蛋白酶;发酵条件优化【作者】耿芳;杨绍青;闫巧娟;刘军;龚思怡;江正强【作者单位】中国农业大学食品科学与营养工程学院,北京 100083;中国农业大学食品科学与营养工程学院,北京 100083;中国农业大学工学院,北京 100083;中国农业大学食品科学与营养工程学院,北京 100083;中国农业大学食品科学与营养工程学院,北京 100083;中国农业大学食品科学与营养工程学院,北京 100083【正文语种】中文【中图分类】TS201.3蛋白酶(protelytic enzymes,EC 3.4)是催化肽键水解的一类酶,在食品、饲料、医药、化工等行业有着广泛的应用［1］。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
1.牛奶平板培养基的配制及灭菌 牛奶平板：在普通肉汤蛋白胨
固体培养基中添加终质量浓度为 1.5%的牛奶
2.倒平板
四、操作步骤
3.制备土壤悬液 4.涂布 5.培养 6.观察记录
五、注意事项
培养基灭菌条件的控制。
六、实验结果
将菌落计数结果记录于下表中。
七、思考题
1.在选择平板上形成蛋白透明水解圈大小是否能作为 判断菌株产蛋白酶能力的直接证据？为什么？ 2.简单设计一方案，从实验中初筛得到的产蛋白酶菌 落里获得某个碱性蛋白酶的高产菌株。
产蛋白酶菌株的筛选
一、实验目的
学习用选择平板从自然界中分离胞外蛋白酶产生 菌的方法。
二、实验原理
蛋白酶在轻工、食品、医药工业中用途非常广泛。 微生物来源的碱性蛋白酶都是胞外酶，具有产酶量高， 适合大规模工业生产等优点，被认为是最重要的一类营业 性酶类。自然界筛选获取有用的微生物资源一直是微生物 学的一项重要工作。 自能够产生胞外蛋白酶的菌株在牛奶平板上生长后，其 菌落周围可形成明显的蛋白水解圈。水解圈与菌落直径的 比值常被作为判断该菌株蛋白酶产生能力的初筛依据。
三、器材1.菌株 从自然界筛 Nhomakorabea获得的蛋白酶产生菌株 2.溶液和试剂 蛋白胨，酵母粉，脱脂奶粉，琼脂，干酪素，三氯醋酸，NaOH，
Na2CO3,Folin试剂，硼砂，酪氨酸，水等 3.仪器和用品 三角烧瓶，培养皿，吸管，试管，涂布棒，玻璃搅拌棒，培养摇
床，高压灭菌锅，直尺，玻璃小漏斗和滤纸
四、操作步骤