实验十一 产蛋白酶菌株的筛选-2013
开菲尔粒中高产蛋白酶菌株的筛选及培养基优化
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实验十一 产蛋白酶菌株的筛选-2013
实验十一产蛋白酶菌株的筛选-2013 实验十一产蛋白酶菌株的筛选碱性蛋白酶是一类最适宜作用pH为碱性的蛋白酶，在轻工、食品、医药工业中用途非常广泛。
微生物来源的碱性蛋白酶都是胞外酶，具有产酶量高，适合大规模工业生产等优点，被认为是最重要的一类营业性酶类。
从自然界筛选获取有用的微生物资源一直是微生物学的一项重要工作，也是学习微生物学的学生应该掌握的基本技能。
一、基本原理, 自能够产生胞外蛋白酶的菌株在牛奶平板上生长后，其菌落周围可形成明显的蛋白水解圈。
, 水解圈与菌落直径的比值常被作为判断该菌株蛋白酶产生能力的初筛依据。
不同类型的蛋白酶都能在牛奶平板上形成蛋白水解圈，细菌在平板上的生长条件和液体环境中生长的情况相差很大，因此在平板上产圈能力强的菌株不一定就是碱性蛋白酶的高产菌株。
, 碱性蛋白酶活力测定按中华人民共和国颁布标准QB747-80进行。
, 原理:Folin试剂与酚类化合物(Tyr,Trp,Phe)在碱性条件下发生反应形成蓝色化合物，用蛋白酶分解酪蛋白生成含酚基的氨基酸与Folin试剂呈蓝色反应，通过分光光度计测定可知酶活大小。
二、实验目的, 学习用选择平板从自然界中分离胞外蛋白酶产生菌的方法, 学习并掌握细菌菌株的摇瓶液体发酵技术, 掌握蛋白酶活力测定的原理与基本方法三、实验器材1(菌株从自然界筛选获得的蛋白酶产生菌株2(溶液和试剂蛋白胨，酵母粉，脱脂奶粉，琼脂，干酪素，三氯醋酸，NaOH，NaCO，Folin 试剂，硼砂，23酪氨酸，水等3(仪器和用品三角烧瓶，培养皿，吸管，试管，涂布棒，玻璃搅拌棒，水浴锅，分光光度计，培养摇床，高压灭菌锅，尺，玻璃小漏斗和滤纸四、操作步骤1. 培养基和试剂的配制(1)牛奶平板:在普通肉汤蛋白胨固体培养基中添加终质量浓度为1.5%的牛奶(2)发酵培养基:玉米粉4%，黄豆饼粉3%，NaHPO 0.4%，KHPO 0.03%，3 mol/l NaOH 调节2424pH到9.0，0.1MPa 灭菌20min，250ml三角烧瓶的装瓶量为50ml。
产蛋白酶菌的筛选及产酶条件优化
大庆师范学院本科生毕业论文蛋白酶产生菌培养条件的条件优化院(部)、专业生命科学学院生物技术研究方向微生物学学生姓名朱琳学号200901122598指导教师姓名张亦婷2013年06月01日摘要采用大庆师范学院生命科学学院花园附近土壤、农田土壤及体育场附近土壤作为样品，并从中筛选分离并得到产蛋白酶能力较高的菌株，经过初步鉴定该菌株属芽孢杆菌。
通过对其产酶条件进行优化，结果显示该菌产酶最佳碳源为质量浓度15g/L的乳糖，最佳氮源为质量浓度20g/L的尿素，最适初始pH值为6.5，最适发酵温度为35℃。
关键词：菌种筛选；鉴定；蛋白酶；条件优化AbstractThe sewage treatment plant soil near east institute, soil and soil samples near farms .Using milk hydrolysis circle screening model separating screening in high ability get protease whr1 strains. Preliminary appraisal of the fungus belong to bacillus. After the optimization of the condition, the capability of whr1 was improved, the optimal condition is: carbon source is sucrose 15g/L; nitrogen source is Yeast extract 20g/L, the pH is 6.5; fermentation temperature is 35℃.Key words：Screening；Identified；Protease；Conditions optimization目录摘要 (1)Abstract (2)1 引言 ...........................................................................................................................................................2 材料与方法 (3)2.2.2 实验材料 (3)2.2.1 菌株筛选 (3)3.1 菌株筛选 (6)3.1.1 菌株的分离筛选 (6)2.3 条件优化 (7)2.3.1 不同碳源对产酶的影响 (7)2.3.3不同氮源对产酶的影响 (8)2.3.4 培养基不同初始pH值对产酶的影响 (9)2.3.5 不同温度对产酶的影响 (10)4 结论 (10)11 引言蛋白酶是催化蛋白质中肽键水解的酶，是一类广泛应用于皮革、毛皮、丝绸、医药、食品、酿造等方面的重要工业用酶，也是目前世界上产销量最大的商业酶，其市场占有率约占整个商品酶销售量的60％，微生物蛋白酶从微生物中提取，不受资源、环境和空间的限制，具有动物蛋白酶和植物蛋白酶所不可比拟的优越性。
产碱性蛋白酶菌株的筛选
产碱性蛋白酶菌株的筛选碱性蛋白酶是在碱性范围内水解蛋白质肽键的酶类，一般最适pH值为9~11，属内肽酶中的丝氨酸蛋白水解酶类，主要用于加酶洗涤剂中，在制革、纺织、医药、化妆品等的生产中也有广泛的应用。
目前，全世界所生产的酶中碱性蛋白酶占到总产量的30%左右，显示出良好的使用性能和经济价值。
碱性蛋白酶广泛存在于细菌、放线菌和真菌中，其中以芽孢杆菌属的碱性蛋白酶研究的最深入。
微生物来源的碱性蛋白酶都是胞外酶，与动植物来源的碱性蛋白酶相比具有产酶量高，适合大规模工业生产的优点。
因此，微生物碱性蛋白酶被认为是最重要的应用型酶类。
本实验从盐碱地采集土样，从中分离出若干株产碱性蛋白酶的菌株。
培养基。
平板培养基( %) : 酵母粉1. 5，蛋白胨0. 5，氯化钠0. 5，琼脂1. 6，pH9。
分离培养基( %) : 酵母膏1. 5，脱脂奶粉0. 5，琼脂1. 6，pH9。
种子培养基%) : 葡萄糖1. 0，蛋白胨0. 5，酵母膏0. 5，KH2PO40. 1，MgSO40. 02，Na2CO31. 0，pH9。
土样采集。
选取采集地点地表植被根系周围的土壤，先除去地表浮土及植被根系，然后挖取深约5cm 的土壤样品。
样品处理。
将土样混合均匀，4℃冰箱保存。
菌株分离( 平板分离法)。
取10g土样装入90ml 无菌生理盐水的三角烧瓶中，100r /min 旋转摇床培养20min，取10 -3，10 -4，10-5稀释液分别涂布于平板培养基上，每个浓度涂布3 个培养皿。
37℃恒温箱倒置培养24h。
观察与保存: 培养24h、48h 后，挑选菌落形态、颜色不一致的菌落保存待用。
筛选采用平板划线法将保存的单菌落划线于分离培养基上。
37℃恒温培养箱中培养24h。
通过观察水解圈的大小初步判断菌株产酶能力的高低，挑选产生透明水解圈大的单菌落接2 环于装有5ml 液体发酵培养基的无菌试管中，30℃条件下旋转摇床培养24h。
产蛋白酶菌的筛选及产酶条件优化
陇东大学学士学位毕业论文（设计）蛋白酶产生菌的筛选及产酶条件优化生命科学与技术学院08生物技术班作者：指导教师：蛋白酶产生菌的筛选及产酶条件优化何泰杜旭谢丽娟，刘丽萍(陇东学院生命科学与技术学院，甘肃庆阳745000)摘要：采用陇东学院污水处理厂附近土壤、农田土壤及养殖场附近土壤作为样品，利用牛奶水解圈筛选模型从中分离筛选得到产蛋白酶能力较高的菌株whr1，初步鉴定该菌株属于芽孢杆菌。
并对其产酶条件进行优化，结果显示该菌最适培养时间为24h，最佳碳源为质量浓度1% 蔗糖，最佳氮源为质量浓度1.5%酵母膏，最适初始pH值为6.0，最适发酵温度为35℃。
关键词：菌种筛选，鉴定，蛋白酶，条件优化Protease produced the screening of the bacteria and the optimization of theenzyme production conditions（College of life science and technology, Longdong University, Qingyang 74500, Gansu, China）Abstract：The sewage treatment plant soil near east institute, soil and soil samples near farms .Using milk hydrolysis circle screening model separating screening in high ability get protease whr1 strains. Preliminary appraisal of the fungus belong to bacillus. After the optimization of the condition, the capability of whr1 was improved, the optimal condition is: The time is 24h; carbon source is sucrose 1%; nitrogen source is Yeast extract 1.5 %, the pH is 6.0; fermentation temperature is 30℃.Keyword: Screening，Identified，Protease, Conditions optimization0引言蛋白酶是水解蛋白质肽键的一类酶的总称，是一类广泛应用于皮革、毛皮、丝绸、医药、食品、酿造等方面的重要工业用酶[1]，也是目前世界上产销量最大的商业酶，其市场占有率约占整个商品酶销售量的60％，微生物蛋白酶从微生物中提取，不受资源、环境和空间的限制，具有动物蛋白酶和植物蛋白酶所不可比拟的优越性[2,3]。
一株高产蛋白酶菌株的筛选及其产酶条件(
一株高产蛋白酶菌株的筛选及其产酶条件*林玩庄，林淑娜，陈汶聪，刘荣莲，黄可佳，黄丹敏，谢桂仁，陈宇豹，邓毛程，王瑶，李静广东轻工职业技术学院，广州，510300摘要：为了提高水产行业蛋白质资源的综合利用率，从南海海域大型鱼类的肠道中筛选蛋白酶高产菌株。
采用平板透明圈法和摇瓶发酵法进行筛选，获得一株蛋白酶高产菌株PE11。
通过菌体形态观察、生理生化实验和16S rDNA鉴定，菌株PE11被鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。
通过摇瓶发酵试验，优选出可溶性淀粉和牛肉膏分别为最佳的碳源和氮源，并确定菌株PE11产蛋白酶的最佳条件为：温度30 °C、初始pH7.0、转速200 rpm和时间36 h。
在最佳的产酶条件下，发酵液中的蛋白酶活力可达376 U/mL。
关键词：蛋白酶；高产；筛选；产酶条件Study on screening and enzyme-producing conditions of a highprotease producing strainLING Wan-zhuang, LING Shu-Na, CHEN Wen-cong, LIU Rong-lian, HUANG Ke-jia, HUANG Dan-min, XIE Gui-ren, CHEN Yu-bao, DENG Mao-cheng, WANG Yao, LI Jing(Guangdong Industry Technical College, Guangzhou 510300)Abstract：In order to improve the comprehensive utilization rate of protein resources from aquatic industry, strains having the ability to produce protease were isolated and screened from the gastrointestinal tract of large fish of South China Sea. Using flat transparent circle and shake flask fermentation test, a high producing protease strain PE11 was obtained. The strain PE11 was identified as Bacillus amyloliquefaciens through the systematic investigations of morphology, physiological and biochemical characteristics and 16S rDNA sequences analysis. By means of shake flask fermentation tests, the optimal carbon resource and nitrogen resource for strain PE11 were soluble starch and beef extract, respectively. In addition, the best conditions for protease-producing were determined as temperature of 30 °C, initial pH of 7.0 and rotation speed of 200 rpm. At the optimal condition, the highest protease activity of fermentation broth reached 376 U/mL.Key words：protease；high producing；screening；enzyme-producing condition*基金项目：广东高校特色调味品工程技术开发中心建设项目（GCZX-B1103），广东省教育部产学研结合项目（2012B091000040），广东轻工职业技术学院自然科学启动基金项目（KJ201307），广东轻工职业技术学院自然科学启动基金项目（KJ201203）。
微生物实验设计 产蛋白酶菌株的筛选
产蛋白酶菌株的筛选级分离一、实验原理自能够产生胞外蛋白酶的菌株在牛奶平板上生长后，其菌落周围可形成明显的蛋白水解圈，水解圈与菌落直径的比值，常被作为判断该菌株蛋白酶产生能力的初筛依据。
将腐烂的大豆浸泡液中的细菌接种在含有酪素的培养基上进行培养。
由于产蛋白酶菌株能在干酪素的培养基上形成无色透明圈，因此能将产蛋白菌株分离出来，分离出来的菌株经再次培养，就可获得纯种产蛋白酶的菌株。
二、实验器材1.菌种：从大豆浸泡液中获得2.培养基:(1)PDA斜面培养基：马铃薯200g，蔗糖20g,琼脂20g,水1000ml.马铃薯去皮，切成块，煮沸半小时后用纱布过滤，再加糖及琼脂，溶化后补水至1000ml，121℃灭菌30min备用。
（2）干酪素琼脂培养基：干酪素4.0g，用20ml 0.1mol/L NaOH溶液溶解后再加20g琼脂，加蒸馏水煮沸加水至1000ml 121℃灭菌30min备用。
3.试剂：无菌水。
4.仪器：天平，电磁炉，烧杯，无菌试管，无菌培养皿，高压灭菌锅，锥形瓶，接种环，涂布棒，酒精灯，恒温培养箱。
三、实验步骤1.将腐烂的大豆放入无菌水中浸泡，制成细菌悬浮液。
2.用涂布棒蘸取菌液接种于PAD培养基中，26℃培养48h。
3.倒置于酪素琼脂培养基平板上，37℃培养24h。
4.挑取培养好的菌落接种于平板上，28℃培养48h。
5.观察各菌落周围形成的透明圈的情况。
6.选取透明圈较大的三个菌落分别接种在干酪素琼脂培养基上，28℃培养48h。
7.观察受否为单菌落，若为单菌落且有透明圈，则为纯种产蛋白酶菌株。
若有杂菌，则需要重复步骤6，直到培养出纯菌为止。
参考文献[1]代玉梅.蛋白酶高产菌株的筛选鉴定及酶学性质研究[D].青岛:青岛大学,2008.[2]黄志强,林白雪,谢联辉.产碱性蛋白酶海洋细菌的筛选与鉴定[J].福建农林大学学报:自然科学版,2006,35(4):416-420.。
微生物实验设计-产蛋白酶菌株的筛选
产蛋白酶菌株的筛选级分离一、实验原理自能够产生胞外蛋白酶的菌株在牛奶平板上生长后，其菌落周围可形成明显的蛋白水解圈，水解圈与菌落直径的比值，常被作为判断该菌株蛋白酶产生能力的初筛依据。
将腐烂的大豆浸泡液中的细菌接种在含有酪素的培养基上进行培养。
由于产蛋白酶菌株能在干酪素的培养基上形成无色透明圈，因此能将产蛋白菌株分离出来，分离出来的菌株经再次培养，就可获得纯种产蛋白酶的菌株。
二、实验器材1.菌种：从大豆浸泡液中获得2.培养基:(1)PDA斜面培养基：马铃薯200g，蔗糖20g,琼脂20g,水1000ml.马铃薯去皮，切成块，煮沸半小时后用纱布过滤，再加糖及琼脂，溶化后补水至1000ml，121℃灭菌30min备用。
（2）干酪素琼脂培养基：干酪素4.0g，用20ml 0.1mol/L NaOH溶液溶解后再加20g琼脂，加蒸馏水煮沸加水至1000ml 121℃灭菌30min备用。
3.试剂：无菌水。
4.仪器：天平，电磁炉，烧杯，无菌试管，无菌培养皿，高压灭菌锅，锥形瓶，接种环，涂布棒，酒精灯，恒温培养箱。
三、实验步骤1.将腐烂的大豆放入无菌水中浸泡，制成细菌悬浮液。
2.用涂布棒蘸取菌液接种于PAD培养基中，26℃培养48h。
3.倒置于酪素琼脂培养基平板上，37℃培养24h。
4.挑取培养好的菌落接种于平板上，28℃培养48h。
5.观察各菌落周围形成的透明圈的情况。
6.选取透明圈较大的三个菌落分别接种在干酪素琼脂培养基上，28℃培养48h。
7.观察受否为单菌落，若为单菌落且有透明圈，则为纯种产蛋白酶菌株。
若有杂菌，则需要重复步骤6，直到培养出纯菌为止。
参考文献[1]代玉梅.蛋白酶高产菌株的筛选鉴定及酶学性质研究[D].青岛:青岛大学,2008.[2]黄志强,林白雪,谢联辉.产碱性蛋白酶海洋细菌的筛选与鉴定[J].福建农林大学学报:自然科学版,2006,35(4):416-420.。
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实验十一产蛋白酶菌株的筛选-2013 实验十一产蛋白酶菌株的筛选
碱性蛋白酶是一类最适宜作用pH为碱性的蛋白酶，在轻工、食品、医药工业中用途非常广泛。
微生物来源的碱性蛋白酶都是胞外酶，具有产酶量高，适合大规模工业生产等优点，被认为是最重要的一类营业性酶类。
从自然界筛选获取有用的微生物资源一直是微生物学的一项重要工作，也是学习微生物学的学生应该掌握的基本技能。
一、基本原理
, 自能够产生胞外蛋白酶的菌株在牛奶平板上生长后，其菌落周围可形成明显的蛋白水解圈。
, 水解圈与菌落直径的比值常被作为判断该菌株蛋白酶产生能力的初筛依据。
不同类型的蛋白酶都能在牛奶平板上形成蛋白水解圈，细菌在平板上的生长条件和液体环境中生长的情况相差很大，因此在平板上产圈能力强的菌株不一定就是碱性蛋白酶的高产菌株。
, 碱性蛋白酶活力测定按中华人民共和国颁布标准QB747-80进行。
, 原理:Folin试剂与酚类化合物(Tyr,Trp,Phe)在碱性条件下发生反应形成蓝色化合物，用蛋
白酶分解酪蛋白生成含酚基的氨基酸与Folin试剂呈蓝色反应，通过分光光度计测定可知酶
活大小。
二、实验目的
, 学习用选择平板从自然界中分离胞外蛋白酶产生菌的方法
, 学习并掌握细菌菌株的摇瓶液体发酵技术
, 掌握蛋白酶活力测定的原理与基本方法
三、实验器材
1(菌株
从自然界筛选获得的蛋白酶产生菌株
2(溶液和试剂
蛋白胨，酵母粉，脱脂奶粉，琼脂，干酪素，三氯醋酸，NaOH，NaCO，Folin 试剂，硼砂，23
酪氨酸，水等
3(仪器和用品
三角烧瓶，培养皿，吸管，试管，涂布棒，玻璃搅拌棒，水浴锅，分光光度计，培养摇床，高压灭菌锅，尺，玻璃小漏斗和滤纸
四、操作步骤
1. 培养基和试剂的配制
(1)牛奶平板:在普通肉汤蛋白胨固体培养基中添加终质量浓度为1.5%的牛奶
(2)发酵培养基:玉米粉4%，黄豆饼粉3%，NaHPO 0.4%，KHPO 0.03%，3 mol/l NaOH 调节2424
pH到9.0，0.1MPa 灭菌20min，250ml三角烧瓶的装瓶量为50ml。
(3)pH11硼砂- NaOH缓冲液:硼砂19.08克溶于1000ml水中;NaOH 4g，溶于1000 ml水中，二液等量混合。
(4)2%酪蛋白:称取2g干酪素，用少量0.5mol/l NaOH润湿后适量加入pH11的硼砂- NaOH缓冲液，加热溶解，定容至100ml，4?冰箱中保存，使用期不超过一周。
2. 酶活标准曲线的制作
用酪氨酸配制0~100μg/mL的标准溶液，取不同浓度的酪氨酸1mL与5 mL
0.4mol/l NaCO、1 mL 23Folin试剂混合，40 ?水浴显色30 min，680 nm测定吸
收值并绘制标准曲线，求出观密度为1是相当的酪氨酸质量( μg )，及K值。
to prevent the accumulation of air, both ends of the tube are required the Center to bake. 6.2.5 sets should be at the bottom 200mm lashing cable head is fixed rung, with a similar cable color of plastic lashings. Cable head using "equal-width stacked" layout, or according to the size and space within the enclosure cable volume adjust, but you must ensure uniform, neat and elegant. 6.2.6 disc cabinet within cable shield layer requirements
3. 用选择平板分离产蛋白酶产生菌株(周一下午)
-3-4-5 取10g土样混于90mL无菌水中，梯度稀释后涂布到牛奶平板上(稀释
梯度:10,10,10，两个平行，每组2块平板)，37 ?培养30h左右观察建议用地衣芽孢杆菌作为对照菌株
4. 产蛋白酶菌株的观察、划线分离与转接(周三、周四 )
对牛奶平板上的总菌数和产蛋白酶的菌数进行记录，量取水解圈与菌落直径，计算其比例，选择比例最大的2株菌。
转接到肉汤琼脂平板上进行划线分离(每组2块平板，周三)，37 ?培养过夜。
挑取单菌落斜面培养(周四下午，每组2支斜面)，同时对单菌落进行革兰氏染色和形态观察(显微镜室，载破片)。
(周三下午)
5. 用发酵培养基测定蛋白酶菌株的碱性蛋白酶活力
将斜面上培养24 h的初筛菌株接种到发酵培养基中(每人1瓶)，37 ?、
200r/min 摇床培养48h。
(下周一)
6. 酶活力的测定(下周三)
离心获得粗酶液(8000 r/m，10min)
空白对照样品
发酵液(或其稀释液)1ml 发酵液(或其稀释液)1ml
0.4mol/L 三氯醋酸 3ml 2% 酪蛋白1 ml
2% 酪蛋白1 ml 40?水浴保温10min
0.4mol/L 三氯醋酸 3ml
静置15min，使蛋白质完全沉淀，然后用离心(8000 r/m，10 min)
滤液1ml
0.4 mol/l NaCO，5ml 23
Folin试剂1 ml
40?水浴保温20min ，于680nm处测定OD值
, 碱性蛋白酶活力单位U，以每毫升样品在40 ?，pH 11条件下，每分钟水解酪蛋白所产生的
酪氨酸质量()来表示。
U = K×A×N×5/10
K:由标准曲线求出光密度为1是相当的的酪氨酸质量，本实验K = 200
N:稀释倍数
A:样品OD值与空白对照,,值之差
5/10:测定中吸取的滤液是全部上清液的1/5，而酶反应时间为10 min 五、实验报告
1. 结果记录
2. 思考题
(,)在选择平板上分离获得蛋白酶产生菌的比例如何,试结合采样地点进行分析。
to prevent the accumulation of air, both ends of the tube are
required the Center to bake. 6.2.5 sets should be at the bottom 200mm lashing cable head is fixed rung, with a similar cable color of plastic lashings. Cable head using "equal-width stacked" layout, or according to the size and space within the enclosure cable volume adjust, but you must ensure uniform, neat and elegant. 6.2.6 disc cabinet within cable shield layer requirements
(,)在选择平板上形成蛋白透明水解圈大小为什么不能作为判断菌株产蛋白酶
能力的直接证据,
试结合你初筛和复筛的结果分析。
to prevent the accumulation of air, both ends of the tube are required the Center to bake. 6.2.5 sets should be at the bottom 200mm lashing cable head is fixed rung, with a similar cable color of plastic lashings. Cable head using "equal-width stacked" layout, or according to the size and space within the enclosure cable volume adjust, but you must ensure uniform, neat and elegant. 6.2.6 disc cabinet within cable shield layer requirements。