实验三 淀粉酶产生菌产酶条件的优化

实验三淀粉酶产生菌产酶条件的优化

一、目的和要求

1.掌握紫外分光光度计的工作原理和操作方法

2. 掌握掌握用DNS法测淀粉酶活的方法，了解淀粉水解圈初筛原理。

3.掌握培养基的配置原则，熟悉用正交实验优化产酶培养基的方法

4.了解炭源、氮源、通气量、底物含量、温度、发酵初始pH值等理化因素对芽孢杆菌产酶的影响。

二实验原理

一般使用的培养基包括适合于代谢产物生成和菌体生成所需要的碳源、氮源、无机盐、PH和其他物质等以有利于最终代谢物的产生。研究各个成分对在终产物的影响采用单因素的方法实验处理和次数比较多，考虑不到所有成分的综合影响，需要采用数理统计的方法优化培养基的成分。正交试验设计可以以比较少的实验处理数来判断出培养基的成分的最佳组合。

由于 2 h 之内酶的稳定性较好, 使得酶活大小与水解圈直径大小呈正相关, 并且此方法灵敏度高, 酶活大于 1 u/ mL 时即可进行比较。由于菌落水解圈法是一个常用的方法, 其他胞外水解酶产生菌的初筛可能也存在类似的现象, 因此尝试使用通过对比H/C大小来优化产酶条件.

淀粉酶有催化淀粉水解的作用，能从淀粉分子非还原性末端开始，分解a —1，4—葡萄糖苷键生成葡萄糖。碱性条件下，还原糖于3、5—二硝基水杨酸被还原为3—氨基—5—硝基水杨酸，还原糖则被氧化成糖酸及其他物质。在一定范围内，还原糖的量与棕色物质颜色深浅的程度成一定的比例关系，可在722型分光光度计540nm波长测定棕红色物质的吸光度值。查标准曲线计算，可求出菌液中还原糖的含量，从而求出淀粉酶的活力，优化产酶条件。

三实验材料：

蛋白胨、牛肉膏、可溶性淀粉、Nacl、无菌水、琼脂、发酵液、碘液

0.2mol/LpH6.8 PBS缓冲液

PBS母液的配制：

0.2M Na2HPO4：称取71.6g Na2HPO4-12H2O，溶于1000ml 水

0.2M NaH2PO4：称取31.2g NaH2PO4-2H2O，溶于1000ml 水

各种浓度PB(pH=7.4)的配制：

先配0.2M PB (pH=7.4，100ml)：取19ml 0.2mol/L的NaH2PO4，81ml 0.2mol/L 的Na2HPO4, 即可。

然后只需将0.2M PB (pH=7.4)按相应比例适当稀释即可，如：

0.02M PB （PH=7.4）：取100ml 0.2 M PB，加水稀释至1000ml 即可

葡萄糖标准液1mg/mL葡萄糖标准液准确称取80℃烘至恒重的分析纯葡糖100mg，置于小烧杯中，加少量蒸馏水溶解后，转移到100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至100mL，混匀，4℃冰箱中保存备用。

DNS试剂（3,5-二硝基水杨酸试剂）DNS试剂（3,5-二硝基水杨酸试剂）的制备：甲液，溶解6.9g苯酚于15.2mL 10%氢氧化钠中，并稀释至69mL，在此溶液中加入6.9g亚硫酸氢钠。乙液，称取22.5g酒石酸钾钠，加到300mL 10%氢氧化钠溶液中，再加入880mL 1%的3,5二硝基水杨酸溶液将甲液与乙液相混合即得黄色试剂，贮于棕色试剂瓶中，放置

7-10天以后使用。

实验仪器

分光光度计微量接种针高压蒸汽灭菌锅离心机电子天平

四实验步骤：

试验路线

设置条件梯度→发酵培养（设置条件剃度）→酶活测定→确定最佳培养条件

（1）培养基的配制

1 因素水平的设定

因素水平牛肉膏蛋白胨可溶性淀粉pH （g/100ml）

1 0.3g 0.5g 0.1g 6

2 0.5g 1.0g 0.2g 7

3 0.7g 1.5g 0.3g 8

配100ml,用1mol/lNaOH ,1mol/lHCl 的调pH

2正交试验表

（2）参照正交表将上述9瓶培养基配配制好以后，每250mL三角瓶装入培养基100mL，于121℃下灭菌30min,冷却。

（3）冷却后接种将实验一中纯化的菌株接入种子培养基摇瓶培养24h，2% 的接种量接种到发酵培养基，置于37℃培养箱进行培养36h。

（4）酶的提取：各取5ml发酵液在3000r/min的离心机中离心20min，取上清 1.淀粉水解圈法测酶活

（1）配制含2%淀粉 1.5%琼脂的固体筛选培养基于121℃下灭菌30min,冷却倒平板,厚度3mm。

（2）取18个淀粉平板，每个平板上用微量注射器垂直滴加三滴体积为5ul酶液。每种酶液做两个重复。37℃反应2h。

（3）滴加碘液后测量H/C大小，通过比较H/C大小筛选出最优产酶培养基。

（4）实验结果分析

滴加碘液后无明显水解圈，在滴加酶液处有水解小斑点，失败可能原因平板琼脂浓度过高酶液不能很好地渗透，反应时间过短等。

2.DNS法测酶活：

1. 绘制葡萄糖标准曲线，取25mL试管8支，按下表加入试剂。

水冷却至室温，摇匀。于540nm波长处，测定吸光值，以吸光度值为

纵坐标，葡萄糖毫克数为横坐标做出标准曲线。

葡萄糖毫克数0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2

540nm吸光度0 0.098 0.610 1.111 1.509 1.943 2.193

2.测定：将2%可溶性淀粉，置于50℃水浴中预热，取9支试管中加

入0.2mol/L pH6.8 PBS缓冲液0.5ml，酶液1ml，迅速放入沸水浴中

5-10min，使酶失活，冷却。另外9支试管加入0.2mol/L pH6.8 PBS缓

冲液0.5ml，酶液1ml。再向每支试管中加入预热可溶性淀粉0.5ml。

60℃反应20min.立即向每个试管中加入3mlDNS终止反应（为减小人

为误差加一个对照管加一个试验管）沸水浴10min显色。以9支灭活

酶试管作为空白对照，于540nm波长处，测定吸光值

实验数据

540nm(A-A0) 1 2 3 4 5 6 7 8 9

0.223 -1.014 -0.535 -0.811 -0.255 0.279 0.607 -0.389 0.529

酶活力 6.69 8.37 18.21 15.63

3. 淀粉酶活力计算：以1mL酶液在60℃、pH6.8的条件下，1h催化

分解1%可溶性淀粉产生1mg葡萄糖的酶量为1个酶活力单位u/mg表

示。

酶活力单位（U/mg）=

K×（A－A0）×F

S×（20÷60）

其中：U——样品淀粉酶活性，U/mg；

K——标准曲线斜率；k=1.9943

F——样品溶液反应前的总量，5ml；

S——样品测试量；表1中S＝1ml；

60——1小时为60min；

20——反应时间min。

实验结果分析

经正交试验分析，方案（7），（9）产酶活力较高方案（2）产酶活力最低。采取方案（7）培养基初始pH7.0，牛肉膏浓度0.7％，蛋白胨浓度0．5％，可溶性淀粉0.3％这种方案时产生的淀粉酶活力最高为优化的最佳产酶培养基方案。出现负值可能原因为该方案产酶活力较低，操作过程中存在误差，导致吸光度值为负值。

注意事项：

（1）接种液体培养物时应特别注意勿使菌液溅在工作台上或其他器皿上，以免造成污染；

如有溅污，可用酒精棉球灼烧灭菌后，再用消毒液擦净

（2）凡吸过菌液的吸管或滴管，应立即放入盛有消毒液的容器内；

（3）配制可溶性淀粉溶液必须用沸水或煮沸的缓冲液进行配制，煮沸溶解成透明或半透明的液体，否则不能与碘结合成紫兰色的复合物；

4 DNS配制一周后使用效果最好

5严格控制DNS测酶活法的反应时间，温度