产脂肪酶菌株的筛选鉴定及产酶条件优化

研究报告　中　国　酿造　２０１６年第３５卷第１１期　总第２９７期　・３９・　

产脂肪酶菌株的筛选鉴定及产酶条件优化　胡琚，杜新凯，王常高，林建国，杜馨，蔡俊　（湖北工业大学，发酵工程教育部重点实验室工业发酵湖北省协同创新中心，湖北武汉４３００６８）　摘要：以橄榄油为唯一碳源，采用油脂同化平板从食堂废弃物中筛选出一株产脂肪酶菌株ＨＦＥ７２２。通过测定与分析该菌株１６Ｓ　ｒＲＮＡ　基因序列，鉴定该菌株为芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）。菌株ＨＦＥ７２２在初始条件（发酵温度３Ｏ℃，接种量为ｌ％，自然ｐＨ，装液量为１００ｍＬ／２５０ｍＬ，　摇床转速为２００　ｒ／ｍｉｎ）下培养３６ｈ，测得发酵液上清液脂肪酶酶活为２．１７Ｕ／ｍＬ。优化后所得菌株ＨＦＥ７２２产酶的最适发酵条件为：发酵温　度３Ｏ℃，发酵周期为３６ｈ，接种量为１％（Ｖ／Ｖ），初始ｐＨ７．０，装液量为５０ｍＬ／２５０ｍＬ，摇床转速为１６０　ｒ／ｍｉｎ。在最佳发酵条件下，发酵液上　清液酶活可达到５．８　Ｕ／ｍＬ，酶活较优化前提高了１６７．２８％。　关键词：脂肪酶；筛选；鉴定；发酵条件优化　中图分类号：Ｑ８１５　文章编号：０２５４—５０７１（２０１６）１１—００３９—０５　ｄｏｉ：ｌ０．１侣８２／ｊ．ｉｓｓｎ．０２５４—５０７１．２０１６．１１．００８　

Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ａｎｄ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｌｉｐａｓｅ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ　ｓｔｒａｉｎｓ　ａｎｄ　ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　

ＨＵ　Ｊｕｎ，ＤＵ　Ｘｉｎｋａｉ，ＷＡＮＧ　Ｃｈａｎｇｇａｏ，Ｌ１Ｎ　Ｊｉａｎｇｕｏ，ＤＵ　Ｘｉｎ，ＣＡＩ　Ｊｕｎ　（ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＦｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（ＭｉｎｉｓｔｒｙｏｆＥｄｕｃａｔｉｏｎ），ＨｕｂｅｉＰｒｏｖｉｎｃｉａｌＣｏｏｐｅｒａｔｉｖｅＩｎｎｏｖａｔｉｏｎ　Ｃｅｎｔｅｒｏｆ　ＩｎｄｕｓｔｒｉａｌＦｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ，Ｈｕｂｅｉ　ＵｎｉｖｅｒｓｉＯ￣ｏｆＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｗｕｈａｎ　４３００６８，Ｃｈｉｎａ）　

Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｕｓｉｎｇ　ｏｌｉｖｅ　ｏｉｌ　ａｓ　ｕｎｉｑｕｅ　ｃａｒｂｏｎ　ｓｏｕｒｃｅ，ａ　ｌｉｐａｓｅ—ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ　ｓｔｒａｉｎ　ＨＦＥ７２２　ｗａｓ　ｉｓｏｌａｔｅｄ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ｗａｓｔｅ　ｏｆ　ｃａｎｔｅｅｎ　ｂｙ　ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ｐｌａｔｅｓ．　Ｔｈｒｏｕｇｈ　１６Ｓ　ｒＲＮＡ　ｇｅｎｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ａｎａｌｙｓｉｓ，ｒｅｓｕｈｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｓｔｒａｉｎ　ＨＦＥ７２２　ｗａｓ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ　ａｓ　ａ　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．Ｓｔｒａｉｎ　ＨＦＥ７２２　ｗａｓ　ｉｎｃｕｂａｔｅｄ　ｆｏｒ　３６　ｈ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｉｎｉｔｉａｌ　ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ（ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　３０℃，ｉｎｏｃｕｌｕｍ　１％，ｎａｔｕｒａｌ　ｐＨ，ｌｏａｄｉｎｇ　ｖｏｌｕｍｅ　１００　ｍｌ／２５０　ｍｌ，　ｓｈａｋｉｎｇ　ｓｐｅｅｄ　２００　ｒ／ｍｉｎ），ｔｈｅ　ｌｉｐａｓｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｂｒｏｔｈ　ｗａｓ　２．１　７　Ｕ／ｍ１．Ｓｉｎｇｌｅ—ｆａｃｔｏｒ　ｍｅｔｈｏｄ　ｗａｓ　ｕｓｅｄ　ｆｏｒ　ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ　ｔｈｅ　ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ，ａｎｄ　ｔｈｅｎ　ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍｕｍ　ｌｉｐａｓｅ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　ｗｅｒｅ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ　ａｓ　ｆｏｌｌｏｗｓ：ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｔｅｍｐｅｒａｔｍ＇ｅ　３０℃，ｔｉｍｅ　３６　ｈ，ｉｎｏｃｕｌｕｍ　１％　（ｖ／ｖ），ｉｎｆｆｉａｌ　ｍｅｄｉｕｍ　ｐＨ　７．０，ｌｏａｄｉｎｇ　ｖｏｌｕｍｅ　５０　ｍｌ／２５０　ｍｌ，ａｎｄ　ｓｈａｋｉｎｇ　ｓｐｅｅｄ　１６０　ｒ／ｍｉｎ．Ｕｎｄｅｒ　ｔｈｅｓｅ　ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ，ｔｈｅ　ｌｉｐａｓｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｂｒｏｔｈ　ｏｆｓｔｒａｉｎ　ＨＦＥ７２２　ｒｅａｃｈｅｄ　５．８　Ｕ／ｍｌ，ｗｈｉｃｈ　ｗａｓ　１６７．２８％ｈｉｇｈｅｒ　ｔｈａｎ　ｔｈａｔ　ｏｆｂｅｆｏｒｅ　ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｌｉｐａｓｅ；ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ；ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ；ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ　

脂肪酶是一类特殊酯键水解酶，是目前紧俏的生物　催化剂之一，一般用于催化油脂的水解和合成反应。脂肪　酶的催化活性主要在于它的蛋白质结构，在油水界面上，　它催化三酰甘油的酯键的水解，水解生成甘油一酯、二酯　或者直接生成甘油和脂肪酸ｆ１］。　微生物来源（包括细菌、霉菌和酵母）的脂肪酶含量　最为丰富［２］。由于微生物种类多、繁殖快，易发生遗传变　异，产生的脂肪酶具有比动植物脂肪酶作用更广的ｐＨ　值、反应温度范围以及底物专一性［３Ｊ；而且微生物来源的　脂肪酶一般都是分泌性的胞外酶，适合于工业化大生产　和样品提纯，因此，微生物脂肪酶是工业用脂肪酶的重要　来源，是生物技术和有机化学应用中使用最为广泛的酶　类之一　。　目前，已知的大约有２％的微生物产脂肪酶。自然界中　的微生物大约有６５个属可产脂肪酶，其中放线菌４个属，细　菌２８个属，酵母１０个属，其他真菌２３个属，但事实上，脂肪　酶在微生物群落的分布已远远超过了这个数字阎，且不同　微生物来源的脂肪酶其组成成分、理化特性各不相同。产　微生物脂肪酶菌种的研究主要集中在根酶川、黑曲霉嘲、白　地霉『９】、青霉㈣、木霉［１１】、毛霉、洋葱伯克霍尔德菌【　、枯草　芽抱杆菌【ｎ］、大肠杆菌工程菌【ｌ４Ｊ、无色杆菌、酵母【悯、小球　菌、发光杆菌［１６】、非极端细菌【切、假丝酵母【ｌ８］和假单胞菌㈣　等具有工业应用价值的菌株和应用在临床医学上的金黄　色葡萄球菌、钩状螺旋体、粉刺棒状杆菌。　本研究从食堂废弃物中筛选到一株产脂肪酶的菌　株，对其进行鉴定，并对其培养条件进行了优化，得到最适　产酶条件。开展这方面的研究工作，对于开发新酶种和脂　肪酶扩大应用领域，具有十分现实的意义。　

收稿臼期：２０１６—０８—１３　基金项目：国家自然科学基金（３１４０１８０７）　作者简介：胡瑶（１９８８一），男，硕士研究生，研究方向为发酵过程优化与放大。　・通讯作者：蔡俊（１９６８．），男，教授，博士，研究方向为微生物发酵工程。　２０１６　Ｖｅ１．３５　ＮＯ．１１　・４０・　Ｓｅｒｉａｌ　Ｎｏ．２９７　Ｃｈｉｎａ　Ｂｒｅｗｉｎｇ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｒｅｐｏ￣　

１材料与方法　１．１材料与试剂　１．１．１试剂　橄榄油乳化液：称取聚乙烯醇（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌ　ａｌｃｏｈｏｌ，ＰＶＡ）　４０．０　ｇ，加水８００　ｍＬ，在沸水浴中加热，搅拌，直至全部溶　解，冷却后定容至１　０００　ｍＬ。用干净的双层纱布过滤，取滤　液备用。量取上述滤液１５０　ｍＬ，加橄榄油５０　ｍＬ，用高速匀　浆机处理６　ｍｉｎ（分两次处理，间隔５　ｍｉｎ，每次处理３　ｍｉｎ），　即得乳白色橄榄油乳化液。该溶液现用现配。实验中所用　试剂均为国产分析纯。　１．１．２培养基　富集培养基￣Ｋ２ＨＰＯ４１　ｇ，ＭｇＳＯ４￣７Ｈ２００．５ｇ，ＫＣ１０．５ｇ，　ＦｅＳＯ４０９ｌｇ，　Ｈ　２ＳＯ４２ｇ，橄榄油乳化液１２０ｍＬ，水１　０００ｍＬ；　油脂同化平板　：Ｋ２ＨＰＯ　１　ｇ，ＭｇＳＯ４￣７Ｈ２０　０．５　ｇ，ＫＣ１　Ｏ．５　ｇ，ＦｅＳＯ４　０．０１　ｇ，（Ｎｎ４＞２ＳＯ４　２　ｇ，橄榄油乳化液１２０　ｍＬ，　琼脂２０ｇ，溴甲酚紫４ｍＬ，水１　０００ｍＬ；　三丁酸甘油酯平板［２１］：蛋白胨１０　ｇ，酵母粉５　ｇ，ＮａＣ１　１０　ｇ，三丁酸甘油酯２　ｍＬ，琼脂粉２０　ｇ，水１　０００　ｍＬ；　ＬＢ斜面培养基：蛋白胨１０　ｇ、酵母粉５　ｇ、氯化钠１０　ｇ、　琼脂粉２０　ｇ，水１０００　ｍＬ；　种子培养基：葡萄糖２０　ｇ，（ＮＨ４）２ＳＯ４　５　ｇ，Ｋ２ＨＰＯ４　１　ｇ，　ＭｇＳＯ４￣７Ｈ２Ｏ　０．５　ｇ，蛋白胨２５　ｇ，橄榄油１０　ｍＬ，水１　０００　ｍＬ；　发酵培养基：葡萄糖５　ｇ，（ＮＨ４）：ＳＯ４　１　ｇ，Ｋ２ＨＰＯ　１　ｇ，　ＭｇＳＯ４￣７Ｈ２Ｏ　０．５　ｇ，蛋白胨２０　ｇ，橄榄油１０　ｍＬ，水１　０００　ｍＬ。　１．２仪器与设备　ＰＨＳ．２５　ｐＨ计：上海雷磁；３Ｋ１５冷冻离心机：德［￣Ｓｉｇｍａ　公司；ＳＷ　ＣＪ．１Ｄ型单人净化工作台：苏州净化设备有限公　司；ＡＲ１１４０型电子分析天平：奥豪斯国际贸易（上海）有限　公司；Ａ型立式压力蒸汽灭菌器：上海博讯实业有限公司　医疗设备厂；ＺＳＤ一１２７０全自动生化培养箱、ＺＨＷＹ系列双　层恒温培养振荡器：上海智城分析仪器制造有限公司。　１－３方法　１．３．１菌种初筛　取５　ｇ样品于１００　ｍＬ生理盐水中，充分混匀后取１　ｍＬ　接种于１００　ｍＬ富集培养基中，３Ｏ　ｏＣ、２００　ｒ／ｍｉｎ培养４　ｄ。取　富集后的菌悬液０．５　ｍＬ做适当的梯度稀释，涂布于油脂同　化平板上，３０℃培养３　ｄ。挑取能使平板变黄的菌落点样于　三丁酸甘油酯平板上，３０℃培养２　ｄ。以菌落直径与水解圈　直径的比值作为初筛依据，将比值较大的菌落保存于ＬＢ　斜面，以便复筛测酶活。　１．３．２复筛　将上述所得到的菌落接种于种子培养基中，３０℃、　２００　ｒ／ｍｉｎ培养１２　ｈ，然后将液体种子１　ｍＬ接种于发酵培养　基中，３０℃、２００　ｒ／ｍｉｎ培养３６　ｈ。取发酵液８　０００　ｒ／ｍｉｎ离心　

１０　ｍｉｎ，吸取上清液作为粗酶液，采用ＧＢ／Ｔ　２３５３５－－２００９　《脂肪酶制剂》中所述的酸碱滴定法测其脂肪酶酶活，筛　选出脂肪酶酶活较高的菌株。脂肪酶酶活定义为：１　ｍＬ液　体酶，在一定温度和ｐＨ条件下，１　ｍｉｎ水解底物产生１　ｍｏｌ　可滴定的脂肪酸，即为１个酶活力单位，以Ｕ／ｍＬ表示。　１－３－３菌种的鉴定与保藏　菌株鉴定和保藏由中国典型培养物保藏中心（Ｃｈｉｎａ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，ＣＣＴＣＣ）执行　鉴定内　容包括菌株１６Ｓ　ｒＲＮＡ基因序列的测定与分析（如图１所　示）和微生物菌株的分类地位。菌株ＨＦＥ７２２已于２０１５年ｌ２　月１０日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：　ＣＣＴＣＣ　Ｍ　２０１　５７３５。　ＧＣＣＴＡＡＴＡＣＡＴＧＣＡＧＴＣＧＡＧＣＧＧＡＣＡＧＡＦＧＧＧＡＧＣＴＴＧＣＴＣＣＣＴＧ　ｒＧ丌ＡＧＣＧＧＣＧＧ　ＡＣＧＧＧＴＧＡＧ１＿从ＣＡＣｌ了ｒＧ（研ＡＡＣＣＴＧＣＣＴＧＴＡＡＧＡＣＴＧＧＧＡＴＡＡＣＴＣＣＧＧＧＡＡＡＣＣ　ＧＧＧＧＣＴＡＡＴＡＣＣＧＧＡＴＧＧＴｒＧＴＴＴＧＡＡＣＣＧＣＡＴＧＧＴＴＣＡＧＡＣＡＴＡＡＡＡＧ（汀ＧＧＣＴＴＣＧ　ＧＣＴＡＣＣＡＣＴｒＡＣＡＧＡｒＧＧＡＣＣＣＩ　ＧＧＣＧＣ　丌ＡＧＣＴ＾ＧＴＴＧＧＴＧＡＧＧＴＡＡＣＧＧＣＴＣＡＣ　ＣＡＡＧＧＣＧＡＣＧ　ＧＣＧＴＡＧＣＣＧＡＣＣＴＧＡＧＡＧＧＧＴＧＡＴＣＧＧＣＣＡＣＡＣＴＧＧＧＡＣＴＧＡＧＡＣ　ＡＣＧＧｃＣＣＡＧＡＣＴＣＣ１＿ＡＣＧＧＧＡＧＧＣＡＧＣＡＧ１＿ＡＧＧＧＡＡ＝ｒＣＴＴＣＣＧＣＡＡｒＧＧＡＣＧＡＡＡ（　’　ＣＴＧＡＣＧＧＡＧＣＡＡＣＧＣＣＧＣＧＴＧＡＧＴＧＡｒＧＡＡＧＧＴＴＴＴＣＧＧＡＴＣＧ１＿ＡＡＡＧＣＴＣＴ（　ＴＧＴＴ　ＡＧＧＧＡＡＧＡＡＣＡＡＧＴＧＣＣＧＴＴＣＡＡ　ＩＡＧＧＧＣＧＧＣＡＣＣＴＴＧＡＣＧＧＴＡＣＣＴＡＡＣＣＡＧＡＡＡ　ＧＣＣＡＣＧＧＣ１＿ＡＡＣ１＿ＡＣＧＴＧＣＣＡＧＣＡＧＣＣＧＣＧＧＴＡＡＴＡＣＧＴＡＧ（　ＧＧＣＡＡＧＣＧＴＴＧＴＣＣＧ　ＴＡＡＡＧＧＧＣＴＣＧＣＡＧＧＣＧ（　ＴＴＣＴＴＡＡＧＴＣＴＧＡＴＧＴＧＡＡＡＧＣＣＣＣＣ　ＧＧＧＴＣ椰ＧＧＡＡＡＣＴＧＧＧＧＡＡＣＴＴＧＡＧＴＧＣＡＧＡＡＧＡＧＧＡＧＡＧ　ＴＧＧＡＡＩｒｒＣＣＡＣＧＴＧＴＡＧＣＧＧＴＧＡＡＡＴＧＣＧＴＡＧＡＧＡＴ（　ＧＧＡＧＧＡＡＣＡＣＣＡ（　ＧＧＣＧＡ　ＡＧ（　：ＧＡＣＴＣＴＣＴＧＧＴＣＴＧＴＡＡＣＴＧＡＣＧＣＴＧＡＧＧＡＧＣＧＡＡＡＧＣＧＴＧＧＧＧＡＧＣＧＡＡＣＡＧ　ＧＡ＝ｎ１ＡＧＡＴＡＣＣＣＴＧＧＴＡＧＴＣＣＡＣＧＣＣＧ１＿ＡＡＡＣＧＡＴＧＡＧＴＧＣ１＿ＡＡＧＴＧＴｒＡＧＧＧＧＧＴＴＴＣ　Ｃ（｝ＣＣＣＣ丌ＡＧＴＧＣＴＧＣＡＧＣ１＿ＡＡＣＧＣ　ｒｒＡＡＧＣＡＣＴＣＣＧＣｃＴＧＧＧＧＡＧＴＡＣＧＧＴＣＧＣＡＡ　ＧＡＣＴＧＡＡＡＣＴＣＡＡＡＧＧＡＡＴＴＧＡＣＧＧＧＧＧＣＣＣＧＣＡＣＡＡＧＣＧＧＴＧＧＡＧＣＡＴＧＴＧＧＴＴＴＡ　椰ＣＧＡＡＧＣＭＣＧＣＧＡＡＧＡＡＣＣＴＴＡＣＣＡＧＧＴＣＴｒＧＡＣＡｒＣＣＴＣＴＧＡＣＡＡｒＣＣＴＡＧＡＧＡ　１ＡＧＧＡＣＣ｜ＴＣＣＣＣＴＴＣＧＧＧＧＧＣＡＧＡＧＴＧＡＣＡＧＧＴＧＧＴＧｃ　ＧＧＴＴＧＴＣＣ｜ＴＣＡＧＣＴＣＧＴＧ　ＴＣＧＴＧＡＧ　ｒＧＴＩ　ＧＴＬ　Ａ（汀ＣＣＣＧＣＡＡＣＧＡＧＣＧＣＡＡＣＣＣＴＴＧｍＴｒＡＧＴＴＧＣＣＡＧＣ　Ａ丌ＣＡＧＴＴＧＧＧＣＡＣＴＣＴＡＡＧＧＴＧＡＣＴＧＣＣＧＧＴＧＡＣＡＡＡＣＣＧＧＡＧＧＡＡＧＧＴＧＧＧＧＡＴＧ　ＡＣ（汀ＣＡＡ＾＝ｒＣＡＴＣ　ｒＧＣＣＣＣＴｎ　ＡＣＣＴＧＧＧＣＴＡＣＡＣＡＣ（汀ＧＣ１＿ＡＣＡ　ｒＧＧＡＣＡＧＡＡＣ　ＡＡＡＧＧＧＣＡＧＣＧＡＡＡＣＣＧＣＧＡＧＧＴＴＡＡＧＣＣＡＡＴＣＣＣＡ　ＣＧＣＡＧ１℃ＴＧＣＡＡＣ　ＣＧＡＣＴＧＣＧＴＧＡＡＧＣＴＧＧＡＡＴＣｌ　ＴＡＧＴＡＡＴＣＧＣＧＧ　ｒＣＡＧＣＡｒＧ　ＣＣＧＣＧＧＴＧＡＡＴＡＣＧＴＴＣＣＣＧＧＧＣＣＴＴＧＴＡＣＡＣＡＣＣＧＣＣＣＧＴＣＡＣＡＣＣＡＣＧＡＧＡＧＴＴＴＧ　ＴＡＡＣＡＣＣＣＧＡＡＧＴＣＧＧＴＧＡＧＧＴＡＡＣＣＴｒｎ　粥ＡＧＣＣＡＧＣＣＧＣＣＧＡＡＧＧＧ