基因工程大肠杆菌基因工程-精
基因工程-外源基因在大肠杆菌中的表达1
基因工程刘夫锋2019.11.18基因工程5 2 3 4 1 6789重组DNA 技术与基因工程的基本概念重组DNA技术与基因工程的基本原理重组DNA技术所需的基本条件重组DNA技术的操作过程目的基因的克隆与基因文库的构建外源基因在大肠杆菌中的表达外源基因在酵母菌中的表达外源基因在哺乳动物细胞中的表达外源基因表达产物的分离纯化6.1 大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征6 外源基因在大肠杆菌中的表达6.1 大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征6 外源基因在大肠杆菌中的表达大肠杆菌表达外源基因的优势遗传背景清楚，适合大规模发酵基因克隆表达系统成熟完善培养成本低廉、繁殖迅速、培养简单、操作方便和遗传稳定被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物K-12MG1655的全基因组测序，共有4405个开放型阅读框丰富的寄主菌株和载体系列大肠杆菌表达外源基因的劣势缺乏对来源于真核生物蛋白质的复性功能缺乏对来源于真核生物蛋白质的翻译后修饰加工系统内源性蛋白酶会降解三维构象不正确的异源蛋白细胞周质内含有种类繁多的内毒素，痕量就会引起人体热激反应6.1 大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征6 外源基因在大肠杆菌中的表达外源基因在大肠杆菌中高效表达6 外源基因在大肠杆菌中的表达强化蛋白质生物合成抑制蛋白产物降解维持或恢复蛋白质特异性空间构象外源基因数量（拷贝数）基因转录水平mRNA 翻译速率的时序性控制6.2 外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理6 外源基因在大肠杆菌中的表达启动子终止子核糖体结合位点密码子质粒拷贝数基因的基本组成6.2 外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理6 外源基因在大肠杆菌中的表达启动子(Promoter)-启动基因转录需要的一段DNA 序列位于基因的编码区上游，与基因的编码方向一致，被细胞内转录因子和RNA聚合酶识别后，可开启基因转录的一段特殊的DNA序列。
启动子E. Coli 中常用的启动子-35 区序列-10 区序列P l L P recA P trp P lac P traA P tac启动子T T G A C A G A T A C T T T G A T A T A T A A T T T G A C A T T A A C T T A G A C A T A A T G T T T T A C A T A T A A T T T G A C AT A T A A T启动子的启动效率：P tac = 3 P trp = 11 P lac启动子启动子的可控性P乳糖启动子P lac 的可控性：OP O高效转录阻遏蛋白诱导乳糖异丙基-b -D-硫代半乳糖苷（IPTG ）野生型的P lac 与其控制区O lac 偶联在一起，在没有诱导物存在时，整个操纵子处于基基底水平转录底水平表达；诱导物可以使启动子P lac 介导的转录大幅提高。
基因工程-外源基因在大肠杆菌中的表达2
基因工程5 2 3 4 16789重组DNA 技术与基因工程的基本概念重组DNA技术与基因工程的基本原理重组DNA技术所需的基本条件重组DNA技术的操作过程目的基因的克隆与基因文库的构建外源基因在大肠杆菌中的表达外源基因在酵母菌中的表达外源基因在哺乳动物细胞中的表达外源基因表达产物的分离纯化6.3 大肠杆菌基因工程菌的构建策略6 外源基因在大肠杆菌中的表达包涵体型异源蛋白的表达分泌型异源蛋白的表达融合型异源蛋白的表达寡聚型异源蛋白的表达整合型异源蛋白的表达蛋白酶抗性或缺陷型表达系统的构建细胞定位包涵体型异源蛋白的表达重组异源蛋白的细胞定位胞质型、周质型（内膜与外膜之间的空隙）和胞外型将重组异源蛋白引导至何种特定的细胞间隔各有利弊。
优选胞质，原因是在胞质型表达的表达水平高。
包涵体型异源蛋白的表达（胞质型）分泌型异源蛋白的表达（周质型或胞外型）融合型异源蛋白的表达寡聚型异源蛋白的表达整合型异源蛋白的表达蛋白酶抗性或缺陷型表达系统的构建单独表达融合表达包涵体型异源蛋白的表达包涵体及其性质在某些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子，它们致密地集聚在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露结构，这种水不溶性的结构称为包涵体（Inclusion Bodies ，IB ）。
富含蛋白质的包涵体多见于生长在含有氨基酸类似物培养基的大肠杆菌细胞中，由这些氨基酸类似物所合成的蛋白质往往会丧失其理化特性和生物功能，从而集聚形成包涵体。
由高效表达质粒构建的大肠杆菌工程菌大量合成非天然性的同源或异源蛋白质，后者在一般情况下也以包涵体的形式存在于细菌细胞内。
除此之外，包涵体中还含有少量的DNA 、RNA 和脂多糖等非蛋白分子。
包涵体型异源蛋白的表达以包涵体形式表达目的蛋白的优缺点高效表达重组异源蛋白包涵体表达形式的优点：以包涵体形式表达的重组异源蛋白可达细菌蛋白总量的20%-60%。
具有固相特性，从而简化外源基因表达产物的分离纯化包涵体的水难溶性及其密度远大于其它细胞碎片和细胞成份，菌体经超声波裂解后，直接通过高速离心即可将重组异源蛋白从细菌裂解物中分离出来。
基因工程名词解释
基因工程名词解释1、基因工程：对不同的遗传物质在体外进行剪切、组合和拼接，使遗传物质重新组合，然后通过载体转入微生物、植物和动物细胞内，进行无性繁殖，并使所需的基因在细胞中表达，产生人类所需的产物或新生物类型。
2、重组DNA技术：是指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后再转入另一个生物体（受体）内，按照人们的意愿稳定遗传并表达新产物或新性状的DNA体外操作程序，也称为分子克隆技术。
3、基因xx：经无性繁殖获得基因许多相同拷贝的过程。
通常是将单个基因导入宿主细胞中复制而成。
（包括把来自不同生物的基因同有自主复制能力的载体DNA在体外人工连接，构建成新的重组的DNA，然后送入受体生物中去表达。
从而产生遗传物质和状态的转移和重新组合。
）4、限制性内切核酸酶：一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸水解酶。
5、修饰酶：体内有些酶可在其他酶的作用下，将酶的结构进行共价修饰，使该酶活性发生改变，这种调节称为共价修饰调节(covalentmodificationregulation)，这类酶称为修饰酶(prosessing enzyme)。
6、同裂酶：识别相同序列的限制酶称同裂酶，但它们的切割位点可能不同。
（同序同切酶、同序异切酶、“同功多位”等）7、同尾酶：切割不同的DNA片段但产生相同的粘性末端的一类限制性内切酶。
8、位点偏爱：某些限制酶对同一底物中的有些位点表现出偏爱性切割，即对不同位置的同一个识别序列表现出不同切割效率。
9、星星活性：极端非标准反应条件下，限制酶能够切割与识别序列相似的序列，这个改变的特殊性称星星活性。
10、甲基化酶：原核生物甲基化酶是作为限制与修饰系统中的一员，用于保护宿主DNA不被相应的限制酶所切割。
11、DNA聚合酶：以DNA为复制模板，从将DNA由5'端点开始复制到3'端的酶。
DNA聚合酶的主要活性是催化DNA的合成（在具备模板、引物、dNTP等的情况下）及其相辅的活性。
基因工程-32大肠杆菌克隆载体课件
这样可以在转化后的大肠杆菌细胞中获得大量 的目的DNA。
第二个优点在于重组体的识别只需一步，仅仅 只要把待筛选的大肠杆菌铺板到含有氨苄青 霉素和X-gal的琼脂培养基上。
而pBR322和pBR327，重组体的筛选都需要把 菌落从一种抗生素培养基原样转移到另一种 抗生素培养基平板。
一个用pUC8做载体的克隆实验比选择pBR322
当被克隆的基因有潜在的危害性时，应优先选 择pBR327。
•基因工程-32大肠杆菌克隆载体
•12
•基因工程-32大肠杆菌克隆载体•13来自pUC8—乳糖选择质粒
pUC8也是一个源自于pBR322的质粒，
只保留了pBR322的复制起点和ampR基因。 ampR基因的核酸序列也被改变了，不再包含唯一
的限制性酶切位点。
到噬菌体M13的短序列中。产生了M13mpl， 它在含有X-gal的琼脂板上形成蓝色的噬菌斑。
M13mpl的lacZ'基因上不含有任何的限制性酶
切位点，但在靠近基因起始位置的地方有一 个GGATTC的序列。改变一个核苷酸就变成
GAATTC，这是EcoRI的识别位点。这个改变
是用体外诱变完成的，产生了M13mp2克隆 载体。
用PstI，PuvI或ScaI酶切后插入DNA会导致氨 苄青霉素抗性基因失活；用BamHI及HindⅢ
等8个限制性内切核酸酶酶切后插入DNA会 导致四环素抗性基因失活。
这意味着pBR322支持很多种不同黏性末端的 DNA片段的导入。
•基因工程-32大肠杆菌克隆载体
•6
第三个优点在于pBR322有相当高的拷贝数
EcoRI的黏性末端。 多接头被插入到M13mp2克隆载体的EcoRI位
点上，形成了一个更加复杂的载体，即 M13mp7。
基因工程3大肠杆菌表达系统
生物农药实例
利用基因工程3大肠杆菌表达系统生产Bt蛋白 （Bacillus thuringiensis），该蛋白对多种
鳞翅目害虫具有毒杀作用，可有效防治棉花、 水稻和玉米等农作物的虫害。
基因工程3大肠杆菌表达系统在生物燃料领域的应用
生物燃料
基因工程3大肠杆菌表达系统在生物燃料领域的应用主要涉及生产生物柴油、生物氢等 可再生能源。通过在大肠杆菌中表达特定的外源基因，可以获得具有催化活性的酶，用
安全性问题
针对安全性问题，应加强监管和规范操作，确保基因工程3大肠杆菌表达系统的安全性 和可靠性。
基因污染
为避免基因污染，应加强基因工程3大肠杆菌表达系统的封闭式生产，并采取有效的检 测手段，确保产品的安全性和可靠性。
基因工程3大肠杆菌表达系统在未来的应用前景
生物制药
基因工程3大肠杆菌表达系统有望在生物制 药领域发挥重要作用，用于生产重组蛋白、 抗体、疫苗等生物药物。
利用基因工程3大肠杆菌表达系统生产重组 人胰岛素、生长激素、干扰素等蛋白质药物， 这些药物在临床治疗中发挥了重要作用。
基因工程3大肠杆菌表达系统在生物农药领域的应用
生物农药
基因工程3大肠杆菌表达系统在生物农药领 域的应用主要涉及生产具有杀虫、杀菌或除 草功能的蛋白质。通过在大肠杆菌中表达特 定的外源基因，可以获得具有生物活性的蛋 白质，用于防治农作物病虫害和杂草。
工业生产
基因工程3大肠杆菌表达系统在工业生产领域具有 广泛的应用前景，可用于生产酶、生物材料、生物 燃料等产品。
农业领域
基因工程3大肠杆菌表达系统在农业领域的 应用前景广阔，可用于改良作物品种、提高 抗逆性、增加产量等方面。
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基因工程大肠杆菌发酵生产重组人胰岛素[宝典]
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基因工程大肠杆菌发酵生产重组人胰岛素[宝典] 基因工程大肠杆菌发酵生产重组人胰岛素的工艺一，背景知识1，基因工程科技名词定义中文名称:基因工程英文名称:genetic engineering;gene engineering其他名称:重组脱氧核糖核酸技术(recombinant DNA technique) 定义1:狭义的基因工程仅指用体外重组DNA技术去获得新的重组基因;广义的基因工程则指按人们意愿设计，通过改造基因或基因组而改变生物的遗传特性。
如用重组DNA技术，将外源基因转入大肠杆菌中表达，使大肠杆菌能够生产人所需要的产品;将外源基因转入动物，构建具有新遗传特性的转基因动物;用基因敲除手段，获得有遗传缺陷的动物等。
定义2:将在体外进行修饰、改造的脱氧核糖核酸分子导入受体细胞中进行复制和表达的技术。
扩充:基因工程是指重组DNA技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。
上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建(即重组DNA技术);而下游技术则涉及到基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程。
一个完整的、用于生产目的的基因工程技术程序包括的基本内容有:(1)外源目标基因的分离、克隆以及目标基因的结构与功能研究。
这一部分的工作是整个基因工程的基础，因此又称为基因工程的上游部分;(2)适合转移、表达载体的构建或目标基因的表达调控结构重组;(3)外源基因的导入;(4)外源基因在宿主基因组上的整合、表达及检测与转基因生物的筛选;(5)外源基因表达产物的生理功能的核实;(6)转基因新品系的选育和建立，以及转基因新品系的效益分析;(7)生态与进化安全保障机制的建立;(8)消费安全评价。
基本操作步骤(上游技术)提取目的基因获取目的基因是实施基因工程的第一步。
如植物的抗病(抗病毒抗细菌)基因，种子的贮藏蛋白的基因，以及人的胰岛素基因干扰素基因等，都是目的基因。
要从浩瀚的“基因海洋”中获得特定的目的基因，是十分不易的。
基因工程
基因工程基因工程是生物工程的一个重要分支，它和细胞工程、酶工程、蛋白质工程和微生物工程共同组成了生物工程。
所谓基因工程（genetic engineering）是在分子水平上对基因进行操作的复杂技术。
是将外源基因通过体外重组后导入受体细胞内，使这个基因能在受体细胞内复制、转录、翻译表达的操作。
它是用人为的方法将所需要的某一供体生物的遗传物质——DNA大分子提取出来，在离体条件下用适当的工具酶进行切割后，把它与作为载体的DNA分子连接起来，然后与载体一起导入某一更易生长、繁殖的受体细胞中，以让外源物质在其中“安家落户”，进行正常的复制和表达，从而获得新物种的一种崭新技术。
它克服了远缘杂交的不亲和障碍。
1974年，波兰遗传学家斯吉巴尔斯基（Waclaw Szybalski）称基因重组技术为合成生物学概念，1978年，诺贝尔生医奖颁给发现DNA 限制酶的纳森斯（Daniel Nathans）、亚伯（Werner Arber）与史密斯（Hamilton Smith）时，斯吉巴尔斯基在《基因》期刊中写道：限制酶将带领我们进入合成生物学的新时代。
2000年，国际上重新提出合成生物学概念，并定义为基于系统生物学原理的基因工程。
A 重组DNA技术的基本定义重组DNA技术是指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA 体外操作程序，也称为分子克隆技术。
因此，供体、受体、载体是重组DNA技术的三大基本元件。
B 基因工程的基本定义基因工程是指重组DNA技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。
上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建（即重组DNA技术）；而下游技术则涉及到基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程。
基因工程是利用重组技术，在体外通过人工“剪切”和“拼接”等方法，对各种生物的核酸（基因）进行改造和重新组合，然后导入微生物或真核细胞内进行无性繁殖，使重组基因在细胞内表达，产生出人类需要的基因产物，或者改造、创造新的生物类型。
第十四章：大肠杆菌基因工程
②启动子与外源基因转录起始位点 之间的距离
2.启动子最佳作用距离的探测
其中目的基因表达量最高的克隆即具有最 佳的启动子作用距离。
若克隆菌细胞内检测不到相应的mRNA，有 必要考虑调整启动子与基因最佳的距离。
3.启动子的筛选 ①鸟枪法克隆 采用鸟枪法战略，将合适大小的DNA 片段克隆到启动子探针质粒pKO1上， 受 体 细 胞 染 色 体 DNA 上 的 galE 、 galT 与质粒报告基因galK的表达产物联合 作用，能将培养基中的半乳糖糖酵解 成红色素物质。
②色氨酸启动子Ptrp的可控性
Ptrp受色氨酸-阻遏蛋白复合物的阻遏， 转录呈基底状态，在培养系统中去除色 氨酸或加入3-吲哚丙烯酸（IAA）可有 效解除阻遏。正常培养体系中去除色氨 酸很难，基因工程通过添加IAA诱导Ptrp 介导的目的基因的表达。
③λ噬菌体启动子PλL的可控性
PλL受阻遏蛋白阻遏，很难直接诱导，基因 工 程 中 常 使 用 温 度 敏 感 型 的 cI 突 变 基 因
活外源基因表达。从整体上来看，外源基因虽然
处于Pl启动子控制之下，但却可用色氨酸取代温
度进行诱导表达。
二．终止子
外源基因在强启动子的控制下表达， 易发生转录过头现象，即RNA聚合酶 滑过终止子结构继续转录质粒上邻 近的DNA序列，形成长短不一的mRNA 混合物。
1.过长转录物的产生在很大程度上会 影响外源基因的表达，原因如下：
③滤膜结合法分离
原理是双链DNA不能与硝酸纤维素薄膜有效结合，而DNA蛋白质复合物却能在一定条件下结合在膜上。将待检测 DNA片段与RNA聚合酶保温，并转移保温混合物至膜上，温 和漂洗薄膜，除去未结合RNA聚合酶的双链DNA片段，然后 再用高盐溶液将结合在薄膜上的DNA片段洗下。一般来说， 这种DNA片段在膜上的滞留程度与其同RNA聚合酶的亲和性 （即启动子的强弱）成比例，然而这种强弱难以量化，通 常仍需要将之克隆在探针质粒上进行检测。