X射线晶体衍射测定蛋白质三维结构
蛋白质结构分析方法
蛋白质结构分析方法：X射线晶体衍射分析和核磁共振x 射线衍射法的分辨率可达到原子的水平，使它可以测定亚基的空间结构、各亚基间的相对拓扑布局，还可清楚的描述配体存在与否对蛋白质的影响。
多维核磁共振波谱技术已成为确定蛋白质和核酸等生物分子溶液三维结构的唯一有效手段。
NM R技术最大的优点不在于它的分辨率，而在于它能对溶液中和非晶态的蛋白质进行测量。
蛋白质的序列结构测定:1.到目前为止，最经典的蛋白质的氨基酸序列分析方法是，sarI等人基于Edman降解原理研制的液相蛋白质序列仪，及后来发展的固相和气相的蛋白质序列分析仪。
2.质谱：早期的质谱电离的方式主要是电子轰击电离(EI)，它要求样品的挥发性好，一般与气相色谱联用。
但使用G C／M S分析，肽的长度受到限制，只能分析小的肽段。
近年来，在离子化的技术及仪器方面取得了突破性进展，使得质谱所能测定的分子量的范围大大超出了10k u。
因此，软离子化技术、基质辅助的激光解吸／离子化(MALDI)和电喷雾离子化(E SI)显得尤为有前途。
通过串联质谱技术(MS／MS)和源后衰减基质辅助的激光解吸／离子化(PSD—MAIDI—MS)，人们就可以从质谱分析中获得肽及蛋白质的结构信息。
蛋白质三维结构的研究：1.X射线单晶衍射分析2.核磁共振分析3.蛋白质的二维晶体与三级重构：蛋白质二维结晶及其电子晶体学的结构分析是目前结构生物学最活跃的领域之一。
此法既适用于水溶性蛋白质，也适用于脂溶性膜蛋白的研究。
电子晶体学的结构分析源于早期的电子衍射分析。
与X射线衍射方法类似，电子衍射数据的实验分析得到的只是结构因子的振幅部分，丢掉了相位信息。
但从剑桥MRC分子生物学实验室的Klug和DeRo sier建立了三维重构的方法开始，电子晶体学才真正发展成为一种独立的空间结构的分析方法，并从传统的X射线晶体学中脱胎出来。
所谓电镜图像的三维重构是指由样品的一个或多个投影图得到样品中各成分之间的三维关系。
X射线晶体衍射测定蛋白质三维结构
X射线晶体衍射测定蛋白质三维结构X射线晶体衍射是一种常用的方法，用于研究蛋白质的三维结构。
它提供了高分辨率的信息，可以确定蛋白质的原子坐标和结构细节。
本文将介绍X射线晶体衍射测定蛋白质三维结构的过程和应用，并讨论一些相关的技术和方法。
首先，为了进行X射线晶体衍射，研究者需要获得蛋白质的高质量晶体。
蛋白质晶体的制备是一个关键步骤，它要求蛋白质具有高纯度和稳定的结构。
通常，蛋白质晶体的制备是一个经验性的过程，需要优化各种条件，如蛋白质浓度、缓冲液pH值、添加剂和结晶温度等。
一旦获得了合适的晶体，就可以进行下一步的X射线衍射实验。
在X射线晶体衍射实验中，晶体被放置在X射线束中，并旋转以产生衍射图样。
这些衍射图样可以通过衍射仪器进行收集和记录。
X射线束的穿过晶体会与晶体中的原子相互作用，并被散射。
通过测量衍射方向和散射强度，可以推断出晶体中原子的空间分布。
衍射图样经过处理、解析和模型建立，可以得到蛋白质的三维结构。
X射线晶体衍射是一种非常强大和广泛应用的技术。
它可以用于解析各种蛋白质的结构，包括酶、抗体和膜蛋白等。
通过比较不同蛋白质的结构，研究者可以揭示蛋白质功能和机制。
另外，X射线晶体衍射还可以用于蛋白质药物设计和优化。
通过了解蛋白质与小分子结合的方式和结构细节，可以指导药物开发和设计更有效的药物。
尽管X射线晶体衍射是一种强大的技术，但它也存在一些限制。
首先，制备高质量晶体是一个挑战，有些蛋白质很难获得足够的高质量晶体。
其次，X射线晶体衍射测定的过程是非常耗时的，通常需要几个月甚至几年的时间来完成。
最后，一些结构细节可能无法通过X射线晶体衍射来解析，因为这种技术只能提供静态结构的信息，而无法直接观察蛋白质的动态过程。
为了克服这些限制，科学家们一直在不断改进和发展X射线晶体衍射技术。
例如，他们引入了新的结晶方法和结晶辅助技术，以提高晶体质量和产量。
此外，还开发了一些高通量的实验和自动化的方法，以加快实验过程和数据处理。
蛋白质的三维结构
（３）疏水作用
( Hydrophobic Interactions)
• 非极性侧链为避开极性溶剂水彼此靠近所 产生
• 主要存在蛋白质的内部结构 蛋白质表面通常具有极性链或区域
• 蛋白质可形成分子内疏水链/腔/缝隙
——稳定生物大分子的高级结构
（２)范德华力(van der Waals force )
这是一种普遍存在的作用力，是一个原子的原 子核吸引另一个原子外围电子所产生的作用力。它 是一种比较弱的、非特异性的作用力。
这种作用力非常依赖原子间的距离，当相互靠 近到大约0.4～0.6nm(4～6A)时，这种力就表现 出较大的集合性质。
改变而引起其余亚基和整个分子构象、性质和功能发生改变 的作用。因别构而产生的效应称别构效应。
肌红蛋白
1
饱 和 度 0.5
0
血红蛋白
在毛细血管中 O2的压力
在肺部O2 的压力
20 40 60 80 100 120
O2压力
血红蛋白是别构蛋白，O2结合到一个亚基上以后，影响与 其它亚基的相互作用。
（三）Hb结合氧的调节
• 平行肽链间以氢键从侧面连接的构象
2、-折叠的类型
平行的β－片层结构中，两个残基的间距为0.65nm； 反平行的β－片层结构，则间距为0.7nm
• 平行式： 所有肽链 的N-端 都在同一 边
• 反平行式： 相邻两条 肽链的方 向相反
（三） -转角和凸起
1、 β转角（ β turn/bend/hairpin structure）
（5）表面空穴
——营造疏水环境、活性功能部位
八、亚基缔合和四级结构
第五章蛋白质的三维结构
二硫键 二硫键的形成并不规定多肽链的折叠。然而一旦蛋 白质采取了它的三维结构则二硫键的形成对此构 象起稳定作用。
三、多肽主链折叠的空间限制
（一） 肽平面与α-碳原子的二面角（φ和ψ） 主 链 肽基 成 为 刚 性 平 面 ， 称 酰 胺 平 面 。 平 面 内 C==O 与 N—H 成反式排列，各原子间有固定的 键角与键长。肽链主链上只有α-碳原子连接的两 个键，Cα—N和C α—C，是纯的单键，能自由旋 转；α-碳是两个相邻酰胺平面的连接点，酰胺平 面虽然是刚性的，但酰胺平面之间的位置可以任
是由一条多肽链的若干段β折叠片反平行组合而成，
两个β股间通过一个短环(发夹)连接起来。
（二）结构域 • 多肽链在二级结构或超二级结构的基础上形成三 级结构的局部折叠区，它是相对独立的紧密球状
实体，称为结构域（structural domain,）。
• 结构域是球状蛋白质的独立折叠单位。对于那些
较小的球状蛋白质分子或亚基来说，结构域和三
• 侧链都垂直于折叠片的平面 • 平行式(parallel) • 反平行式（antiparallel）
β折叠片
（三）β转角和β凸起
• 自然界的蛋白质大多是球状蛋白质。因此多肽链必须具
有弯曲、回折和重新定向的能力。
• β 转 角 （ β--turn）, 或 β 弯 曲 （ β—bend） 或 发 夹 结 构
然构象，为蛋白质的复性。
（二）氨基酸序列规定蛋白质的三维结构
核糖核酸酶的变性和复性实验 • 牛胰核糖核酸酶（RNA酶）有4个二硫键 • • 8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍+巯基乙醇 酶 无规线团
透析除去变性剂和巯基乙醇
X射线衍射技术与显微镜技术的主要区别是：
X射线衍射原理及应用
X射线衍射原理及应用nλ = 2d sinθ其中，n为衍射级数，λ为X射线的波长，d为晶格的间距，θ为入射角。
这个方程说明了当入射角θ和衍射级数n确定时，衍射波的波长λ会影响到衍射峰的位置。
利用X射线衍射的原理，可以得知物质的晶格参数和晶体结构信息。
1.晶体学研究：X射线衍射是研究晶体结构的重要手段。
通过对晶体的X射线衍射图案进行解析，可以确定晶体的晶格参数、原子结构和晶体对称性。
这对于理解材料的物理和化学性质、控制材料的合成过程以及发展新材料有着非常重要的意义。
2.表面分析：X射线衍射也可以用于表面分析。
通过衍射峰的位置和强度，可以得知材料的表面晶格结构、缺陷和表面形貌等信息。
这对于研究材料的附着性、表面氧化和膜层结构等具有重要意义。
3.蛋白质晶体学：X射线衍射在蛋白质晶体学中有着重要的应用。
蛋白质的晶体结构决定了其功能和相互作用方式。
通过对蛋白质晶体的X射线衍射图案进行解析，可以得到蛋白质的三维结构信息，从而揭示其功能和相互作用的机制。
这对于药物设计和疾病治疗研究具有重要意义。
4.粉末衍射：粉末衍射是指用X射线照射粉末样品，通过衍射图案确定材料的结晶性质。
由于能够快速、非破坏性地分析材料的晶体结构，粉末衍射在材料科学研究中得到了广泛应用。
例如，可以用粉末衍射来研究材料的相变行为、晶体生长过程以及材料的应力和缺陷等。
总之，X射线衍射作为一种高度灵敏的分析方法，已经成为材料科学、化学、生物学等领域中不可或缺的手段。
随着技术的不断发展，X射线衍射将继续为我们揭示材料的微观结构和材料性质之间的关系提供重要的帮助。
蛋白质x射线晶体衍射原理
蛋白质x射线晶体衍射原理蛋白质X射线晶体衍射原理引言蛋白质是生物体内最重要的分子之一，它们在细胞内扮演着重要的角色。
了解蛋白质的结构对于理解其功能至关重要。
然而，直接观察蛋白质的结构是一项极其困难的任务。
幸运的是，蛋白质的结构可以通过X射线晶体衍射技术来解析。
X射线晶体衍射原理蛋白质X射线晶体衍射原理是一种基于蛋白质晶体的结构解析方法。
它利用X射线的特性，通过晶体对入射X射线的衍射来获得蛋白质的结构信息。
该原理背后的基本概念是，晶体中的原子会散射入射的X射线，产生衍射图样。
通过分析衍射图样，可以确定晶体中原子的位置和排列方式，从而推断出蛋白质的结构。
实验过程蛋白质X射线晶体衍射实验通常由以下几个步骤组成：1. 产生蛋白质晶体：首先，需要获得高质量的蛋白质晶体。
这是整个实验的核心步骤，也是最具挑战性的一步。
蛋白质晶体的制备需要优化晶体生长条件，以获得足够大且完整的晶体。
2. 实施衍射实验：将蛋白质晶体置于X射线束下，入射的X射线会与晶体中的原子发生散射。
衍射图样会在探测器上形成。
3. 数据采集与处理：通过旋转晶体，收集一系列的衍射图样。
这些图样会被数字化并存储，然后进行数据处理。
数据处理的目的是从衍射图样中提取出有关晶体结构的信息。
4. 结构建模：通过衍射数据的处理，可以得到一组结构因子。
结构因子是与晶体中原子的位置和散射强度有关的数值。
利用这些结构因子，可以通过计算方法重构出蛋白质的结构。
应用与挑战蛋白质X射线晶体衍射技术在生物化学和结构生物学领域有着广泛的应用。
通过解析蛋白质结构，可以了解蛋白质的功能机制，从而为药物设计和疾病治疗提供重要的依据。
然而，蛋白质X射线晶体衍射技术也面临一些挑战。
首先，获得高质量的蛋白质晶体是一项复杂而耗时的任务。
其次，晶体中的原子散射信号很弱，需要使用强度很高的X射线源来获得足够的散射数据。
此外，对于大型蛋白质和复合物的结构解析，需要克服数据采集和处理的困难。
结论蛋白质X射线晶体衍射原理是一种重要的蛋白质结构解析方法。
X射线晶体衍射测定蛋白质三维结构
• 晶胞(Unit cell)
✓ 空间点阵的单位（大小和形状完全相同的平行六面体）， 是晶体结构的最小单位。
✓ 同一个空间点阵，划分平行六面体的方式是多种多样的。 • 选择平行六面体的原则：
• ①所选平行六面体的对称性应符合整个空间点阵的对称性。 • ② 选择棱与棱之间直角关系为最多的平行六面体 • ③ 所选平行六面体之体积应最小。 • ④ 当对称性规定棱间的交角不能为直角关系时，应选择结点间距
• 为了防止各脏器成像发生的重叠给诊疗带来不便, 科 学家们进一步研究了成像更清晰、灵敏度更高的仪器 。1972年，英国科学家汉斯菲尔德运用计算机和图像 重建理论, 制成了电子计算机射线断层扫描成像装置, 也就是已被广泛应用的CT。
X射线与诺贝尔奖—物理学奖
• 伦琴因发现X射线而获得第一届诺贝尔物理学奖。 • 1903 年诺贝尔物理学奖。 • 1906 年的诺贝尔物理学奖。 • 劳厄获得了1914 年诺贝尔物理学奖。 • 英国的布拉格父子1915 年的诺贝尔物理学奖。 • 英国的巴克拉1917 年的诺贝尔物理学奖。 • 瑞典物理学家西格班1924 年诺贝尔物理学奖。 • 美国的康普顿1927 年诺贝尔物理学奖。 • 前苏联的切连科夫1958 年诺贝尔物理学奖; • 美国的霍夫斯塔特1961 年诺贝尔物理学奖; • 瑞典的西格巴恩1981 年的诺贝尔物理学奖。
rometry, DXMS • 生物玻璃bioglass
边界 硬度 脱水 溶解性 偏光性 染色性 漂浮性
（4）晶体的初步鉴定
小分子晶体
蛋白质晶体
完整，漂亮
常不完整，易出现多晶
偏硬，易碎成2瓣或几瓣 偏软，易碎成粉
不变化
因脱水而变坏
慢
快
强
生物化学蛋白质的三维结构(共44张PPT)
Side view
问题：羊毛衫等羊毛制品在热水中洗涤变长，经枯燥又收缩，而丝制品 经同样处理不收缩，请解释这两种现象。
【解】羊毛纤维多肽链的主要构件单位为连续α-螺旋圈，螺距为0.54nm，在加 热下纤维多肽伸展为 -折叠，相邻R基团之间的距离变为0.7nm，所以变长了； 枯燥后重新由 -折叠转化为α-螺旋，所以收缩了。丝制品是丝心蛋白，为 -折 叠的多肽链，其内含丝氨酸等包装紧密的侧链，比羊毛纤维多肽中的α-螺旋稳 定，所以洗涤枯燥构象根本不变。
假设干β折叠股反平行组合而成，两个β股之间通过一 个发夹链接起来。
六、超二级结构&结构域——结构域：
➢ “结构域〞是在二级结构或超二级结构的根底上形成三级结构的局部折叠区,是相对独立的 紧密球状实体。对那些较小的球状蛋白质分子或亚基来说,结构域和三级结构是一个意思,也 就是说这些蛋白质或亚基是单结构域的如红氧还蛋白等；较大的蛋白质分子或亚基其三级 结构一般含有两个以上的结构域，即多结构域的,其间以柔性的铰链〔hinge〕相连，以便相 对运动。
α-螺旋
肽链像螺旋一样盘曲上升，每3.6个氨基酸残 基螺旋上升一圈，每圈螺旋的高度为0.54nm， 每个氨基酸残基沿轴上升0.15nm，螺旋上升时， 每个残基沿轴旋转100º；
α-螺旋稳定性主要靠氢键来维 持，多肽主链上第n个残基的羰 基和第n+4个残基的酰氨基形成 氢键，环内原子数13，氢键的取 向几乎与轴平行；
肌钙蛋白的两个结构域。
③稳定蛋白质三维结构的作用力——疏水作用和二硫键
➢疏水作用〔hydrophobic interaction)：水介质中球状蛋白质的折叠总是倾向与把疏 水残基埋藏在分子的内部，这一现象称为疏水作用，它在稳定蛋白质的三维结构方面 占有突出地位。疏水作用其实并不是疏水基团之间有什么吸引力的缘故，而是疏水基 团或疏水侧链出自避开水的需要而被迫接近。
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片的冲洗药水或冲洗技术
发现X射线 本质的争论 X射线衍射
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2.X射线的发现及应用
1895年 伦琴（Roentgen）发现故称为伦琴射线。 整理ppt
伦琴夫人的手的X射线照片
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X射线在医学上的应用
伦琴的新发现轰动了全世界, 不到三个月, 维也纳的一 家医院便拍出了应用于医疗的X射线照片.从此, X射线 拍片和射线透视成为医学诊疗中常用的手段。
惠更斯：光波阵面
上每一点都可以看 作新的子波源，以 后任意时刻，这些 子波的包迹就是该 时刻的波阵面。
——1690年
解释不了光强分布！
菲涅耳补充：从同
一波阵面上各点发 出的子波是相干波。
——1818年
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2. X射线的发现历程及应用
失之交臂
1836 法拉第 发现阴极射线 1861 克鲁克斯 阴极射线管在放电时会产生亮光 干
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化学奖
荷兰的物理化学家德拜1936 年诺贝尔化学奖。 美国著名化学家鲍林1954 年诺贝尔化学奖。 英国生物学家肯德鲁与佩鲁茨1962 年诺贝尔化学奖。 英国女化学家霍奇金1964 年诺贝尔化学奖。 美国化学家利普斯科姆1976 年诺贝尔化学奖。 英国化学家桑格和美国化学家吉尔伯特1980 年诺贝尔化学奖。 英国生物化学家克卢格因1982 年诺贝尔化学奖; 美国化学家豪普特曼和卡尔1985 年诺贝尔化学奖; 1988 年,米歇尔等三位德国生物化学家诺贝尔化学奖。
晶体的周期性结构使得我们可以把它抽象成 “点阵”来研究.
一维周期性结构与直线点阵 二维周期性结构与平面点阵 三维周期性结构与空间点阵
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一维周期性结构与直线点阵
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二维周期性结构与平面点阵
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三维周期性结构与空间点阵
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晶胞(Unit cell)
✓ 空间点阵的单位（大小和形状完全相同的平行六面体）， 是晶体结构的最小单位。
X射线晶体结构分析？
✓ 使用X射线作为物理工具，依赖X射线衍射现 象为物理原理，以晶体作为研究对象，晶体结 构作为研究结果的一种分析方法。
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5.X射线的获得：
X射线管
激光等离子体
同步辐射
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X射线激光
6.晶体基础
什么是晶体 晶体的周期排布 晶体的对称性
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3.1什么是晶体
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1.光的衍射现象
‘光线’播而出现光强 不均匀 分布的现象
当缝的大小（或障碍物的大小）跟波长相差不多时就 发生明显的衍射现象．如果缝很宽，其宽度远大于波 长，则波通过缝后基本上是沿直线传播的，衍射现象 就很不明显了．
E S
E S
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惠更斯—菲涅耳原理
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单位平行六面体，a、b、c 、、、 是表征它本身形状、 大小的一组参数，称为格子参数或点阵参数。
c
b
a
单位平行六面体参数
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单位平行六面体与坐标轴的关系：棱交角＝坐标轴之间交角。 a、b、c ＝轴单位。
a、b、c、、、 关系有七种情况，与单位平行六面体七种格 子相对应。
立方格子 a=b=c == =90o
固体物质 晶体
相当罕见的东西？
非晶体
晶体(Crystal )
✓ 指离子、原子或分子这些微粒在三维空间中周期性重复 排列形成的、能够给出明锐衍射的固体结构。
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晶体什么样（1）
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晶体什么样（2）
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晶体什么样（3）
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晶体什么样（4）
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2.晶体和点阵结构
粒子具有旋转性
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4.X射线衍射
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X射线衍射的获得
波长范围：10—0.1埃 欲观察其衍射现象则衍射线度应与其波长差不多，晶体的晶格常
数恰是这样的线度 衍射波的两个基本特征—衍射线（束）在空间分布的方位（衍射
方向）和强度与晶体内原子分布规律（晶体结构）密切相关。
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蛋白质结构测定
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2011-3-30
蛋白质三维结构测定方法及数量
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蛋白质三维结构测定年增长图
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第一节：X-射线衍射技术用于蛋白质晶体结构测定
原理 基本过程 优缺点 应用实例
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一、相关原理
光的衍射现象 X射线的发现及应用 本质的争论 X射线衍射的发现 晶体学基础知识 X射线晶体衍射
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三方格子 a=b=c == ≠90o， 60， 109o28'16 "
为了防止各脏器成像发生的重叠给诊疗带来不便, 科 学家们进一步研究了成像更清晰、灵敏度更高的仪器。 1972年，英国科学家汉斯菲尔德运用计算机和图像重 建理论, 制成了电子计算机射线断层扫描成像装置, 也 就是已被广泛应用的CT。
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X射线与诺贝尔奖—物理学奖
伦琴因发现X射线而获得第一届诺贝尔物理学奖。 1903 年诺贝尔物理学奖。 1906 年的诺贝尔物理学奖。 劳厄获得了1914 年诺贝尔物理学奖。 英国的布拉格父子1915 年的诺贝尔物理学奖。 英国的巴克拉1917 年的诺贝尔物理学奖。 瑞典物理学家西格班1924 年诺贝尔物理学奖。 美国的康普顿1927 年诺贝尔物理学奖。 前苏联的切连科夫1958 年诺贝尔物理学奖; 美国的霍夫斯塔特1961 年诺贝尔物理学奖; 瑞典的西格巴恩1981 年的诺贝尔物理学奖。
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3.X射线本质的争论
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X射线本质的争论--波动说
巴克拉： X射线波动性 标识谱线：不管元素已化合成什么化合物，它们总是发射一种硬度的X射线， 当原子量增大时，标识X射线的穿透本领会随着增大。这说明X射线具有标识特 定元素的特性。
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X射线本质的争论—微粒说
布拉克父子 X射线微粒论者
✓ 同一个空间点阵，划分平行六面体的方式是多种多样的。 选择平行六面体的原则：
①所选平行六面体的对称性应符合整个空间点阵的对称性。 ② 选择棱与棱之间直角关系为最多的平行六面体 ③ 所选平行六面体之体积应最小。 ④ 当对称性规定棱间的交角不能为直角关系时，应选择结点间距
小的行列作为平行六面体的棱，且棱间的交角接近于直角的平行六 面体。