gst pull-down protocol
GST pulldown实验技术
➢ 3、以预实验确定的最佳IPTG浓度、时间和温度诱导表达靶蛋 白（IPTG 0.5mM，28℃，200 rpm培养10~16小时）;
➢ 4、诱导适当时间后，4℃，5000 rpm/min离心10min后弃上清 （如需要该步沉淀能保存在-80℃）；
GST pull-downFra bibliotek示意图Western Blot
GST pull-down应用
Western Blot
用于验证两个已知蛋白的相互作用 筛选与已知蛋白相互作用的未知蛋白
GST pull-down流程
GST-A融合蛋白的制备 • B蛋白的制备 • 体外蛋白的结合 • Western blot检测
Western Blot
➢ 1.1 GST-A融合蛋白的表达
➢ 5、重悬沉淀：按10ml菌液沉淀用1ml PBS重悬，并加入PMSF； ➢ 6、冰上超声沉淀重悬液：5S 间隔5S 至悬液透明（一般可容性
蛋白：10ml菌液沉淀用1ml PBS重悬液超声6~9min可透明）; ➢ 7、12000 rpm/min，4℃离心10min，将上清转移至新的离心管，
B蛋白的来源： ➢ 1.1 (His)-B融合蛋白的原核表达与纯化 ➢ 1.2 (HA/Myc/Flag)-B融合蛋白的真核表达
Western Blot
➢ 1.1.1 (His)-B融合蛋白的原核表达
➢ 1、活化冻存菌种His和His-B：按1: 50比例将表达蛋白的冻存菌 液加入5ml LB(Amp＋)，37℃，200 rpm培养过夜；
Western Blot
1. GST-A融合蛋白的制备
GST pull-down实验技术
Western Blot
1. GST-A融合蛋白的制备
1.1 GST-A融合蛋白的表达 1.2 GST-A融合蛋白的纯化
Western Blot
Western Blot
1.1 GST-A融合蛋白的表达
1、活化冻存菌种GST和GST-A：按1: 50比例将表达蛋白的冻存 菌液加入5ml LB(Amp＋)，37℃，200 rpm培养过夜；
GST pull-down 示意图
Western Blot
GST pull-down应用
Western Blot
用于验证两个已知蛋白的相互作用 筛选与已知蛋白相互作用的未知蛋白
GST pull-down流程
GST-A融合蛋白的制备 • B蛋白的制备 • 体外蛋白的结合 • Western blot检测
3、在管中加入预冷的200微升PBS（沿壁加入，小心勿剧烈，以 免打断珠子与蛋白的连接），轻晃悬浮珠子，将Sepharose洗涤 一次， 3000 rpm/min，4℃离心3min，弃上清;
4、重复步骤3三次（最后一次以小枪头吸净珠子表面液体，吸 净但不吸走珠子），即获得结合有GST-A融合蛋白的Sepharose；
1.2 GST-A融合蛋白的纯化
Western Blot
5、如果用于检测，在Sepharose 加入15~20微升1×蛋白电泳上 样缓冲液，于沸水中煮5~10min。
6、12000 rpm/min离心5min，取上清做SDS-PAGE和WB检测。
2. B蛋白的制备
Western Blot
Western Blot
1.1 GST-A融合蛋白的表达
5、重悬沉淀：按10ml菌液沉淀用1ml PBS重悬，并加入PMSF； 6、冰上超声沉淀重悬液：5S 间隔5S 至悬液透明（一般可容性
gst pull down原理
gst pull down原理Gst Pull Down原理Gst Pull Down是一种视频处理技术，用于将24帧/秒的电影转换为30帧/秒的视频。
这种技术可以提高视频的平滑度和流畅度，使观看体验更佳。
本文将详细介绍Gst Pull Down的原理。
一、什么是Gst Pull Down？Gst Pull Down是一种视频处理技术，用于将24帧/秒的电影转换为30帧/秒的视频。
在电影制作中，通常使用24帧/秒来拍摄和编辑电影。
但是，在播放时，大多数电视和显示器都以30帧/秒的速度播放视频。
因此，如果直接播放24帧/秒的电影，则会出现画面抖动或不流畅等问题。
二、为什么需要Gst Pull Down？在播放24帧/秒的电影时，由于每个画面之间存在较长时间间隔，因此画面会出现抖动或不流畅等问题。
而将24帧/秒转换为30帧/秒，则可以使画面更加平滑流畅，提高观看体验。
三、Gst Pull Down原理1. 3:2 Pulldown在进行Gst Pull Down时，通常采用3:2 Pulldown方法。
这种方法利用了电影制作中使用的24fps（frames per second）与NTSC （National Television System Committee）制定的30fps之间的差异。
具体来说，将24帧/秒的电影转换为30帧/秒的视频，需要将每个电影画面分成两个半画面，然后再将其转换为三个NTSC画面。
2. 操作步骤具体来说，Gst Pull Down的操作步骤如下：（1）将24fps的电影分成两个半画面（Odd Field和Even Field）；（2）将Odd Field插入到第一帧和第二帧之间，形成一个新的NTSC 画面；（3）将Even Field插入到第三帧和第四帧之间，形成另一个新的NTSC画面；（4）重复以上步骤，直到所有24fps电影画面都被转换为30fps视频。
3. 效果通过Gst Pull Down处理后，原本24fps的电影就可以以30fps的速度播放，并且画面更加平滑流畅。
分子生物学常用实验方法原理介绍
分子生物学常用实验方法原理介绍一、GST pull-down实验基本原理:将靶蛋白-GST融合蛋白亲和固化在谷胱甘肽亲和树脂上,作为与目的蛋白亲和的支撑物,充当一种“诱饵蛋白”,目的蛋白溶液过柱,可从中捕获与之相互作用的“捕获蛋白”(目的蛋白),洗脱结合物后通过SDS-PAGE电泳分析,从而证实两种蛋白间的相互作用或筛选相应的目的蛋白,“诱饵蛋白”和“捕获蛋白”均可通过细胞裂解物、纯化的蛋白、表达系统以及体外转录翻译系统等方法获得。
此方法简单易行,操作方便。
注：GST即谷胱甘肽巯基转移酶(glutathione S-transferase)二、足印法（Footprinting）足印法（Footprinting）是一种用来测定DNA-蛋白质专一性结合的方法，用于检测目的DNA序列与特定蛋白质的结合，也可展示蛋白质因子同特定DNA片段之间的结合。
其原理为：DNA和蛋白质结合后，DNA与蛋白的结合区域不能被DNase（脱氧核糖核酸酶）分解，在对目的DNA 序列进行检测时便出现了一段无DNA序列的空白区(即蛋白质结合区)，从而了解与蛋白质结合部位的核苷酸数目及其核苷酸序列。
三、染色质免疫共沉淀技术（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）染色质免疫共沉淀技术（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）是研究体内蛋白质与DNA相互作用的有力工具，利用该技术不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态作用，还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰以及转录因子与基因表达的关系。
染色质免疫沉淀技术的原理是：在生理状态下把细胞内的DNA与蛋白质交联在一起，通过超声或酶处理将染色质切为小片段后，利用抗原抗体的特异性识别反应，将与目的蛋白相结合的DNA 片段沉淀下来。
染色质免疫沉淀技术一般包括细胞固定，染色质断裂，染色质免疫沉淀，交联反应的逆转，DNA的纯化及鉴定。
四、基因芯片（又称 DNA 芯片、生物芯片）技术基因芯片指将大量探针分子固定于支持物上后与标记的样品分子进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度进而获取样品分子的数量和序列信息。
细胞pulldown实验的详细步骤及详细说明
细胞pulldown实验的详细步骤及详细说明利用重组技术将探针蛋白与GST（Glutathione S transferase）融合，融合蛋白通过GST与固相化在载体上的GTH（Glutathione）亲和结合。
因此，当与融合蛋白有相互作用的蛋白通过层析柱时或与此固相复合物混合时就可被吸附而分离。
GST-pulldown主要包括以下三个部分：①利用基因重组技术构建带有GST标签的原核表达载体；②通过原核表达系统表达带有GST标签的融合蛋白；③利用GST亲和纯化柱进行蛋白纯化获得高纯度的融合蛋白，再利用GST亲和纯化柱进行蛋白间的相互作用检测。
细胞蛋白裂解液，洗脱液：PBS及PBS+1%Triton-100PBS （1L）NaCl： 8gKCl：0.2gNa2HPO4： 1.44gKH2PO4：0.24g加入800ml蒸馏水，用HCl调节溶液的pH值至7.4，最后加蒸馏水定容至1L 即可，高温高压灭菌,4℃保存备用。
PMSF（苯甲基磺酰氟）MW:174.19 工作浓度0.1-1mM，这里使用1mM，储存浓度100mM，将0.174g PMSF溶于10ml无水乙醇混匀即可。
保持于-20℃或者4℃。
（以下流程仅供研究已知原核蛋白A和真核过表达蛋白B相互作用）1、原核融合蛋白A的获得（1）将编码蛋白A与GST的重组质粒化转BL21（DE3）菌株（2）挑取单个克隆到含有5mlLB（+100ug/mlAmp）的10ml试管里，37℃培养过夜（3）将培养菌液转移到含有500ml LB（+100ug/mlAmp）的1L锥形瓶中，37℃，225rpm培养至OD600≈1.0-1.5左右，加入适当浓度的IPTG，在适当温度下培养适当时间（诱导条件需要根据不同的蛋白做调整），6000g，10分钟，4℃离心收集细菌，去尽上清，将菌体至于-20℃放置O/N（4）室温冻融菌体，马上置于冰上，每500ml培养液加入10-20ml细菌裂解液（PBS+1%Triton-100+PMSF），吹打混匀（5）冰上超声破碎，开2秒，停9秒，总40-60分钟。
GSTpulldown的原理以及具体操作流程
实验目的：体外检测蛋白质与蛋白质之间相互作用。
用于验证两个已知蛋白的相互作用，或者筛选与已知蛋白相互作用的未知蛋白。
实验原理：利用重组技术将探针蛋白与GST (Glutathione S transferase)融合，融合蛋白通过GST与固相化在载体上的GTH( Glutathione )亲和结合。
因此，当与融合蛋白有相互作用的蛋白通过层析柱时或与此固相复合物混合时就可被吸附而分离试齐U： NaCl，KCl，Na2HPO4，KH2PO4，Trit on-100 , IPTG(Merck 分装)，PMSF( Amersco)，Cocktaier ( Merck 539134 ), Immobilized Glutathione ( PIERCE 15160 )实验操作程序：材料及试剂探针蛋白与GST融合的原核蛋白，裂解的细胞蛋白，或者组织蛋白提取物细胞蛋白裂解液，洗脱液：PBS 及PBS+1%Triton-100PBS (1L)NaCl : 8gKCl : 0.2gNa2HPO4: 1.44gKH2PO4 : 0.24g加入800ml蒸馏水，用HCI调节溶液的pH值至7.4,最后加蒸馏水定容至1L即可，高温高压灭菌！ 4 C保存备用！PMSF(苯甲基磺酰氟)MW:174.19工作浓度0.1-1mM，这里使用1mM，储存浓度100mM , 将0.174g PMSF溶于10ml无水乙醇混匀即可！保持于-20 C或者4C(以下流程仅供研究已知原核蛋白A和真核过表达蛋白B相互作用)1:原核融合蛋白A的获得1.1 :将编码蛋白A与GST的重组质粒化转BL21(DE3)菌株1.2：挑取单个克隆到含有5mlLB(+100ug/mlAmp)的10ml试管里，37C培养过夜1.3:将培养菌液转移到含有500ml LB(+100ug/mlAmp)的1L锥形瓶中，37C, 225rpm培养至OD60B 1.0-1.5左右，加入适当浓度的IPTG，在适当温度下培养适当时间(诱导条件需要根据不同的蛋白做调整).6000g, 10分钟，4C离心收集细菌，去尽上清，将菌体至于-20 C 放置O/N1.4 :室温冻融菌体，马上置于冰上，每500ml培养液加入10-20ml细菌裂解液 (PBS+1%Triton-100+PMSF ),吹打混匀1.5:冰上超声破碎，开2秒，停9秒，总40-60分钟。
GST pull-down
百泰派克生物科技
GST pull-down
Pull down（拉下实验）是一种体外亲和纯化蛋白的技术，Pull down技术将已知蛋白（诱饵蛋白）利用亲和试剂标签（如谷胱甘肽-S-转移酶、组氨酸六肽、生物素）进行标记，再特异性识别混合体系中的配体蛋白（靶蛋白），以达到富集、分离、纯化某种配体蛋白质的目的，是在体外研究蛋白与蛋白相互作用的有力工具。
GST pull-down实验，也称GST融合蛋白沉降技术，是利用谷胱甘肽S-转移酶（GST）标记诱饵蛋白进行的Pull down实验。
GST pull-down可用于证实已知的蛋白或肽的相互作用，也可以用来挖掘未知的蛋白或肽的相互作用。
百泰派克生物科技提供高效快速的GST pull-down 蛋白互作分析服务，可用于鉴定两种已知的兴趣蛋白质可能存在的直接相互作用，以及寻找可能与目标蛋白存在相互作用关系的未知蛋白，欢迎免费咨询。
GST pull-down原理及方法
看他是不是没有你不行, 还是可能有其他的新伙伴.
不做对照, 一厢情愿的希望, 并相信蛋白间的关系是幼稚的.
生物实验中, 单一的证据都是薄弱的, 无论他貌似多么正确, 要通过对照和多方取证才能确定真实的事实.
大家交朋友, 搞对象也类似于此. 关乎终身快乐, 幸福, 不可不察.
Coimmunoprecipitatio的自由恋爱问题. 一个蛋白在本性上可以同时喜欢很多其他的蛋白, 但是最终还是会有个最喜欢的, 而在Co-ip中就能发现他的喜好. 这种关系可能是直接的, 也可能是间接的, 是更接近于东方的.
两个蛋白可能在生物体内素昧平生, 一个在头上, 一个在脚上. 也许两者之间或许很合辙, 生来却天各一方. 在GST pull down 的环境中, 他们可能相遇, 吸引在一起. 但在现实生活中, 这样的浪漫关系可能是不现实的. 脚上的蛋白若是跑到头上与情人幽会, 人就要出大问题. 还有的情况是, 两个蛋白即使独处在一起 在其他蛋白, 各种因素适当的辅助下, 却有可能形成稳定的搭档关系.
白溶液过柱,可从中捕获与之相互作用的“捕获蛋白”(目的蛋白),洗脱结合物后通过SDS-PAGE电泳分析,从而证实两种蛋白间的相互作用或筛选相应的目的蛋白,“诱饵蛋白”和“捕获蛋白”均可通过细胞裂解物、纯化的蛋白、表达系统以及体外转录翻译系统等方法获得。此方法简单易行,操作方便。
GST：谷胱甘肽巯基转移酶(glutathione S-transferase)
所以, 随缘, 就是像蛋白一样单纯, 却不简单.
有关Control和多方取证.
我们做试验, 都要有实验组, 阴性对照, 阳性对照. 即使体外生化实验都达成了, 还要通过多方取证来确定两个蛋白之间确定的生理关系.
gstpulldown实验技术
gstpulldown实验技术汇报人：2023-12-25•实验简介•材料准备•实验操作目录•结果分析•实验结论01实验简介验证已知的蛋白质相互作用gstpulldown实验可以用于验证已知的蛋白质相互作用，例如验证某个蛋白质是否与特定的结合蛋白相互作用。
发现新的蛋白质相互作用通过gstpulldown实验可以发现新的蛋白质相互作用，从而为研究新的生物学过程和疾病机制提供线索。
确定蛋白质之间的相互作用通过gstpulldown实验可以检测到与特定蛋白质结合的其他蛋白质，从而确定蛋白质之间的相互作用。
蛋白质相互作用gstpulldown实验利用GST（谷胱甘肽巯基转移酶）融合蛋白作为诱饵，与细胞或组织提取物中的目标蛋白质进行结合，从而检测到与诱饵蛋白结合的目标蛋白。
分离和纯化通过将GST融合蛋白与谷胱甘肽结合的琼脂糖珠结合，可以分离和纯化与目标蛋白结合的复合物。
检测目标蛋白通过Western blot等技术对分离和纯化的复合物进行检测，从而确定与诱饵蛋白结合的目标蛋白。
实验步骤准备GST融合蛋白和谷胱甘肽结合的琼脂糖珠将GST融合蛋白与琼脂糖珠结合，形成用于捕获目标蛋白的诱饵。
细胞或组织提取从感兴趣的细胞或组织中提取蛋白质混合物。
孵育将细胞或组织提取物与GST融合蛋白结合的琼脂糖珠孵育，使目标蛋白与诱饵蛋白结合。
洗脱和检测洗脱与诱饵蛋白结合的目标蛋白，并利用Western blot等技术进行检测和分析。
02材料准备GST琼脂糖珠磷酸化激酶洗涤液抗体01020304用于绑定目的蛋白，是实验的关键试剂。
用于磷酸化目的蛋白，确保实验的准确性。
用于清洗实验中使用的各种仪器和试剂。
用于检测目的蛋白的表达和磷酸化状态。
离心机用于分离和纯化目的蛋白。
摇床用于孵育实验中的各种反应。
超声波破碎仪用于破碎细胞，释放细胞内的目的蛋白。
凝胶电泳仪和电泳槽用于检测目的蛋白的表达和磷酸化状态。
所需样本细胞或组织样本实验所需的生物样本，需确保其质量和活性。
gst pull down原理
GST Pull Down原理1. 什么是GST Pull DownGST拉伸消除（Pull Down）是一种视频处理技术，常见于旧电影转换为数字格式时使用。
它的目的是将常见的24帧每秒（FPS）的电影转换为更高的电视标准（例如30 FPS）。
Pull Down可以实现补偿和时序调整，以确保电影在更高的帧率下播放时没有抖动或重复帧。
2. Pull Down标准在了解GST Pull Down的原理之前，我们先来了解一下电影和电视的帧率标准。
2.1 电影帧率电影一般采用每秒24帧的拍摄速度进行录制。
这种帧率被广泛接受为电影的标准，因为它能够提供良好的视觉效果，并且在大屏幕上播放时不会引起观看者的不适。
2.2 电视帧率电视的帧率标准因地区不同而略有差异。
常见的帧率标准有30 FPS和60 FPS。
30 FPS被广泛应用于美国和其他一些国家的电视系统，而60 FPS则较常见于游戏和高清电视等应用中。
3. Pull Down原理为了将24 FPS的电影转换为电视标准的30 FPS或60 FPS，Pull Down技术通过在电影的每一帧之间插入额外的帧来实现。
这样可以在不改变原始影像的前提下，将电影平滑地转换为电视标准。
3.1 3:2 Pull Down3:2 Pull Down是最常用的Pull Down技术。
它使用一个3帧和一个2帧的模式来转换电影帧。
1.首先，将电影的第一帧复制两次，形成一个3帧序列（AAA）；2.然后，将电影的下一帧复制两次，形成一个2帧序列（BB）；3.重复以上步骤，直到整部电影被转换完毕。
这样，24 FPS的电影就可以按照30 FPS的标准进行播放。
可以按照相同的原理，将电影转换为60 FPS，只需要重复每一帧的处理即可。
3.2 2:2 Pull Down2:2 Pull Down是另一种常见的Pull Down技术，用于将24 FPS的电影转换为60 FPS。
1.首先，将电影的第一帧复制两次，形成一个2帧序列（AA）；2.然后，将电影的下一帧复制两次，形成另一个2帧序列（BB）；3.交替播放AA和BB序列，每秒播放60帧。
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...1 制备GST蛋白
A. 将GST、GST-p53菌种按1:50比例加入5ml LB（AMP+）培养基中，
37o C，220rpm过夜培养。
B. 将过夜培养的菌液按照1:100比例接入10ml LB（AMP+）培养基
中，37 o C，220rpm培养至OD600=0.4-0.6.
C. 达到OD后，按照1:2000的比例加入IPTG(1M)，37 o C，220rpm诱导
2h。
D. 4 o C，2000rpm离心5min，弃上清。
E. 用1ml RIPA buffer（50mM Tris(pH 7.4)，150mM NaCl，1% NP-
40，0.5% sodium deoxycholate，0.1% SDS，0.1mM PMSF）重悬菌液，冰上放置20min。
F. 冰上超声E中重悬的菌液，小功率8S间隔8s，超声至菌液透明。
G. 4 o C ，12000rpm离心10min，上清转移至新的EP管中。
...2 预处理谷胱甘肽-琼脂糖树脂
将谷胱甘肽-琼脂糖树脂混合均匀后，取适量谷胱甘肽-琼脂糖树脂匀浆至EP管中，加1ml RIPA buffer（或者PBS），颠倒混匀后，4 o C，100rpm离心5min，弃上清，置冰上待用。
...3 结合GST蛋白
A. 将2.2.5.1中的上清转移至2.2.5.2处理好的谷胱甘肽-琼脂糖树脂中，4 o C旋转
孵育2h或者过夜。
B. 4 o C，1000rpm离心5min弃上清。
C. 向沉淀中加入800μl RIPA buffer，颠倒混匀（可旋转混匀5min）后，
o C,1000rpm离心5min弃上清，重复4次。
4
...4 细胞裂解液的制备
细胞按照实验要求转染36h后，收集细胞，用免疫沉淀实验中的细胞裂解液裂解细胞，离心后将上清转移至新的EP管中待用。
...5 检测蛋白与蛋白的相互作用
A. 将2.2.5.4中制备的细胞裂解液加入到2.2.5.3中结合有GST-p53蛋白
的谷胱甘肽-琼脂糖树脂中，如果体积小于1ml，用细胞裂解液补加体积到1ml。
4 o C旋转孵育2h或者过夜。
B. 4 o C，1000rpm离心1min，弃上清，用1ml细胞裂解液清洗谷胱甘
肽-琼脂糖树脂三次。
C. 加入适量的蛋白上样缓冲液，混匀后，95 o C煮样5-10min。
...6 Western blot检测。