第三章 分子生物学常用技术和基本原理
常用分子生物学技术的原理及其应用
分子生物学技术是生物学领域中的重要工具，广泛应用于基础研究、医学诊断、药物研发等领域。
以下是常用的分子生物学技术及其原理和应用：1. PCR技术：PCR（聚合酶链式反应）是一种体外扩增DNA的方法，基本原理是通过DNA聚合酶酶在体外模拟DNA的复制过程，从而快速扩增目标DNA片段。
PCR技术在基因克隆、基因检测、DNA指纹分析等领域有着广泛的应用。
2. 基因克隆技术：基因克隆是将感兴趣的DNA片段插入到载体DNA 中，构建重组DNA分子的过程。
通过基因克隆技术可以获得大量目的基因的DNA序列，用于研究基因功能、表达调控等方面。
3. 蛋白质表达与纯化技术：蛋白质表达技术是将外源基因导入宿主细胞中，使其表达目的蛋白质的过程。
通过蛋白质表达与纯化技术，可以获得大量纯净的蛋白质样品，用于研究蛋白质结构、功能等。
4. 基因编辑技术：基因编辑技术包括CRISPR-Cas9系统、TALENs和ZFNs等，可以实现对基因组特定区域的精准编辑。
基因编辑技术在疾病治疗、植物育种等领域有着巨大的潜力。
5. RNA干扰技术：RNA干扰是一种通过RNA介导的基因沉默机制，可使目标基因的mRNA水平下降，从而抑制基因表达。
RNA干扰技术在基因功能研究、疾病治疗等方面具有重要应用价值。
6. 蛋白质亲和纯化技术：蛋白质亲和纯化技术利用蛋白质与其结合物质之间的特异性相互作用，实现对目标蛋白质的选择性富集和纯化。
该技术在药物筛选、蛋白质相互作用研究等领域有着广泛应用。
7. 基因芯片技术：基因芯片是一种高通量的生物芯片技术，可同时检测上千个基因的表达水平。
基因芯片技术广泛应用于基因表达谱分析、疾病诊断、药物研发等领域。
8. 蛋白质组学技术：蛋白质组学技术主要包括蛋白质质谱分析、蛋白质组芯片等，用于研究蛋白质在生物体内的表达水平、翻译后修饰等。
蛋白质组学技术在疾病诊断、药物靶点鉴定等方面有着重要应用。
以上是常用的分子生物学技术及其原理和应用。
分子生物学
第一章绪论1.基因治疗：利用基因工程的技术，在基因水平上纠正有缺陷的基因，用来治疗人类遗传性疾病。
2.细胞分化：从受精卵开始的个体发育过程中，后代细胞间在形态、结构和生理功能上发生差异的过程为细胞分化。
3.干细胞：具有分裂和分化潜能的细胞称为干细胞，干细胞再适合的条件下可分化成不同类型的细胞群（全能性，多能型，单能性）4.分子诊断：利用分子生物学的手段（如：PCR、限制性酶切、克隆、核酸杂交等）对多种疾病，特别是遗传性的疾病作出早期诊断的技术，即分子诊断。
5.NA多态性：同一种群的不同个体在同源染色体的相同位置会有不同的序列特（如：不同拷贝的短串联重复序列）6.DNA指纹是指所有能够进行个体识别的DNA多态性（片段）的组成。
7.分子生物学的三条基本原理：构成生物有机大分子的单体在不同生物中都是相同的；生物体内一切有机大分子的建成都遵循着各自特定的规则；某一特定生物体内所拥有的核酸及蛋白质分子决定了它的属性。
第二章原核基因表达调控1.DNA的一级结构：就是指4种核苷酸的连接及其排列顺序，表示了该DNA分子的化学构成。
2.双螺旋的基本特点是：1）DNA分子是由两条平行的脱氧核苷酸长链盘绕而成的。
2）DNA分子中的脱氧核糖和磷酸交替连接，排在外侧，构成基本骨架，碱基排列在内测。
3）两条链上的碱基通过氢键相结合，形成碱基对，它的组成有一定的规律。
3.一个细胞中的全部基因序列及其间隔序列统称为genomes（基因组）。
4.Genotype（基因型）：The genetic constitution of a given organism（指某个特定生物体细胞内的全部遗传物质）。
5.Phenotype（表现性）：Visible property of any given organism（某个特定生物体中可观察道德物理或生理现象）。
6.Mutations（突变）：染色体DNA中可遗传的核苷酸序列变化。
7.着丝粒（Centromere）：是细胞有丝分裂期间纺锤体蛋白质与染色体的结合位点（attachment point）。
常用分子生物学技术的原理及其应用
常用分子生物学技术的原理及其应用概述分子生物学技术是现代生物学研究中应用广泛的一系列技术方法。
这些技术能够帮助科学家从分子水平上理解生物学系统的结构和功能，并促进相关研究的进展。
本文将介绍几种常用的分子生物学技术，并详细探讨它们的原理和应用。
1. 聚合酶链式反应（PCR）•原理：聚合酶链式反应（PCR）是一种体外合成DNA的方法，通过循环性反应使DNA的数量迅速扩增。
该技术主要包括三个步骤：变性、退火和延伸。
在变性步骤中，DNA双链被加热使其解旋成两条单链。
在退火步骤中，引物与模板DNA序列互补碱基配对。
在延伸步骤中，热稳定DNA聚合酶将新的DNA链延伸。
•应用：PCR技术在生物学研究和临床诊断中有着广泛的应用。
它可以用于基因克隆、基因突变分析、DNA测序、DNA指纹鉴定等。
此外，PCR还常用于检测病原体、肿瘤标记物以及遗传性疾病的诊断。
2. 凝胶电泳•原理：凝胶电泳是一种分离DNA和蛋白质的常见方法。
该技术基于物质在电场中的迁移速度不同，利用电势差将分子分离开来。
DNA片段在凝胶中迁移速度与其大小有关，大片段迁移较慢，小片段迁移较快。
•应用：凝胶电泳广泛应用于DNA分析、蛋白质分析以及核酸杂交等实验中。
在分子生物学研究中，凝胶电泳可用于确认PCR扩增产物的大小，并进行DNA片段的分离和纯化。
此外，它还可以检测基因突变、遗传关系等。
3. 蛋白质电泳•原理：蛋白质电泳是一种分离和分析蛋白质的技术。
该技术基于蛋白质的大小、电荷和形状差异，利用电势差将蛋白质分离开来。
在电泳过程中，蛋白质样品被加载到聚丙烯酰胺凝胶中，并通过电场迁移。
•应用：蛋白质电泳在生物学研究和临床诊断中具有重要作用。
它可以用于鉴定蛋白质在细胞中的表达水平、研究蛋白质结构和功能以及检测特定蛋白质的存在与否。
此外，蛋白质电泳还用于分离和纯化重组蛋白质。
4. 核酸杂交•原理：核酸杂交是一种通过互补碱基配对而发生的分子相互作用。
通过标记的探针DNA或RNA与靶序列相互结合形成稳定的双链或三链结构，从而可进行检测和定位。
分子生物学的基本原理与方法
分子生物学的基本原理与方法分子生物学是研究生物分子结构、功能和相互作用的学科，是现代生物学的重要分支。
本文将介绍分子生物学的基本原理和常用的实验方法。
一、分子生物学的基本原理分子生物学的基本原理是基于遗传物质DNA的复制、转录和翻译过程。
DNA是生物体内的遗传物质，它携带了生物个体的遗传信息。
DNA的复制是指DNA分子通过自我复制过程，使得每个新合成的DNA分子与原始DNA分子具有相同的遗传信息。
转录是指DNA通过酶的作用，产生RNA分子的过程。
转录产生的RNA可以是信使RNA （mRNA）、转运RNA（tRNA）或核糖体RNA（rRNA），这些RNA 分子在翻译过程中发挥重要的作用。
翻译是指RNA分子通过核糖体的作用，将RNA上的密码子翻译成氨基酸序列，合成蛋白质。
分子生物学的基本原理还包括基因的表达调控机制。
基因表达是指基因通过转录和翻译过程产生蛋白质的过程。
在这个过程中，细胞内的信号分子会识别和结合到基因的启动子区域，调控基因的转录水平。
转录因子是一种可以结合到启动子区域的蛋白质，它们可以促进或抑制基因的转录过程。
此外，还有一些表观遗传学的机制，如DNA甲基化和组蛋白修饰等，也参与了基因的表达调控。
二、分子生物学的基本方法1. DNA提取：DNA提取是从生物体组织或细胞中分离纯化DNA的过程。
常用的DNA提取方法包括酚-氯仿法、盐析法和柱层析法等。
2. 聚合酶链式反应（PCR）：PCR是一种用于增加DNA片段数量的方法，它可以在体外通过模拟DNA复制过程，快速地合成大量特定DNA序列。
PCR可以应用于基因检测、DNA序列扩增和基因克隆等领域。
3. 凝胶电泳：凝胶电泳是分子生物学中常用的实验方法，可以将DNA、RNA或蛋白质根据其大小和电荷迁移率分离。
通过观察样品在凝胶上的迁移情况，可以判断目标分子的大小和纯度。
4. 蛋白质表达与纯化：蛋白质表达与纯化是分子生物学中用于获得特定蛋白质的方法。
常用分子生物学技术的原理及应用
常用分子生物学技术的原理及应用一、PCR技术1.PCR（Polymerase Chain Reaction）技术是一种常用的分子生物学技术，主要用于扩增DNA片段。
2.PCR技术的原理是通过添加DNA模板、引物和DNA聚合酶，以及一系列特定的温度循环，迅速扩增目标DNA序列。
3.PCR技术的应用广泛，如基因克隆、基因突变分析、疾病诊断等。
二、蛋白质电泳技术1.蛋白质电泳技术是用于分离和定量蛋白质的常用方法。
2.蛋白质电泳技术包括SDS-PAGE和蛋白质西方印迹等。
3.SDS-PAGE是一种蛋白质分子量分析方法，通过凝胶电泳分离蛋白质。
4.蛋白质西方印迹则用于检测特定蛋白质的表达，并通过特异性抗体与该蛋白质结合，产生特定的信号。
三、原位杂交技术1.原位杂交技术是研究基因表达和基因组结构的重要工具。
2.原位杂交技术通过结合特异性探针和标记物，用于检测目标序列在组织或细胞中的分布。
3.原位杂交技术有多种类型，如荧光原位杂交（FISH）和非放射性原位杂交等。
4.原位杂交技术在遗传学研究、疾病诊断和生物学研究中得到广泛应用。
四、基因克隆技术1.基因克隆技术是将特定DNA片段插入到载体DNA中的技术。
2.基因克隆技术的关键步骤包括：DNA片段的切割、载体DNA的选择和连接、转化等。
3.基因克隆技术在基因工程、重组蛋白质的表达以及基因功能研究等方面具有重要应用。
五、DNA测序技术1.DNA测序技术是用于确定DNA序列的方法。
2.DNA测序技术包括Sanger测序和高通量测序等。
3.Sanger测序是一种经典的测序方法，逐个位置确定DNA序列。
4.高通量测序技术通过并行测序大量的DNA片段，实现快速高效的DNA测序，并被广泛应用于基因组学研究、药物研发等领域。
六、蛋白质质谱技术1.蛋白质质谱技术是分析蛋白质结构和功能的重要方法。
2.蛋白质质谱技术包括质谱仪的使用和蛋白质样品的制备等。
3.蛋白质质谱技术能够快速鉴定蛋白质样品中的蛋白质组分，并定量分析特定蛋白质的表达水平。
分子生物学的原理和实验技术
分子生物学自20世纪50年代以来经历 了飞速的发展，包括DNA双螺旋结构 的发现、基因工程的诞生、人类基因 组计划的完成等重大里程碑事件。
研究对象与内容
研究对象
分子生物学主要研究生物体内的 核酸（DNA和RNA）和蛋白质等 大分子物质。
研究内容
包括基因的结构与功能、基因表 达的调控、DNA复制与修复、 RNA的转录后加工与调控、蛋白 质的合成与功能等。
蛋白质定量与检测
利用BCA法、Bradford法等方法对蛋白质进行定量，并通过 Western blot等技术检测特定蛋白质的表达。
蛋白质相互作用研究
利用免疫共沉淀（Co-IP）、酵母双杂交等技术研究蛋白质之间的 相互作用。
细胞培养与转染技术
细胞培养
在人工环境下培养细胞，提供适 宜的营养物质和生长条件，维持
随着大数据时代的到来，生物信息学分析方法在分子生物学研究中的地位愈发重要。未 来需要发展更加高效、准确的算法和工具，以应对不断增长的数据分析需求。
THANKS
感谢观看
细胞的生长和增殖。
细胞转染
将外源DNA或RNA导入真核细 胞中，实现基因的表达或调控。 常用的转染方法包括脂质体转染
、电穿孔转染等。
细胞筛选与鉴定
利用选择性培养基、抗体筛选等 方法对转染后的细胞进行筛选和 鉴定，获得具有特定表型的细胞
株。
04
分子生物学在医学领域应用
基因诊断原理与方法
基因诊断原理
蛋白质合成与功能
转录与翻译
01
DNA中的遗传信息通过转录生成RNA，再经过翻译合成蛋白质
。
蛋白质的结构与功能
02
蛋白质的结构决定其功能，包括催化、运输、免疫等。
分子生物学 常用分子生物学技术的原理及应用
（三）基因突变
利用PCR技术可以随意设计引物在体外对目的 基因片段进行嵌和、缺失、点突变等改造。
T G C
（四）DNA序列测定
将PCR技术引入DNA序列测定，使测序工 作大为简化，也提高了测序的速度；
待测DNA片段既可克隆到特定的载体后进 行序列测定，也可直接测定。
（五）基因突变分析
PCR与其他技术的结合可以大大提高基 因突变检测的敏感性 。
▪ 分子杂交： 不同来源的单链核苷酸链根据碱基互补原则形成
杂种双链的过程。
▪ 分子杂交的目的： 检测DNA和RNA
▪ 探针： 分子杂交中和待测核苷酸链碱基互补的被标记的
核苷酸链。
待测DNA或RNA
探针
碱基对间氢键
增色效应： DNA变性伴随260nm吸收值增高
减色效应： DNA复性伴随260nm吸收值降低
Taq
5’
Taq
5’
R
R
R Taq
R
Taq
R
l
R
3’
Extension Step
1. Strand Displacement
3’
5’
2. Cleavage
3’
5’ 3. Polymerization
3’
Complete
4. Detection
5’ 3’
PCR衍生技术
▪ 反向PCR ▪ 逆转录PCR ▪ 原位PCR ▪ 重组PCR ▪ 不对称PCR ▪ 多重PCR
酵母双杂交系统的建立基于对真核生物转录激 活因子结构与功能的认识
真核生物转录激活因子
DNA结合结构域 转录激活结构域
BD
AD
组件式：结构可互相分开 功能互相独立 空间较近时表现活性 中间序列对活性无影响
分子生物学
专题三分子生物学实验室的基本常用技术1 核酸的纯化分离提取的核酸样品，分为DNA和RNA，由于不同的实验要求，需用不同的方法进一步纯化，核酸纯化的主要目标是去除其中的蛋白、多酚、多糖、盐离子等杂质。
核酸纯化的方法很多，不同的方法对应于不同的研究目的。
超速离心、柱层桥、分子杂交、免疫沉淀、凝胶电泳等方法将在核酸分离、提取的有关专题中加以介绍。
在此仅介绍从核酸溶液中去除蛋白质的酚/氯仿抽提法。
这个方法的标准程序，是酚/氯仿(1:1)抽提一次，氯仿抽提一至二次，如果情况需要可再重复几次。
1.1 酚/氯仿抽提法的基本原理混合使用酚、氯仿这两种不同的蛋白质变性剂，以增加去除蛋白杂质的效果。
因为酚虽可有效地变性蛋白质，但它不能完全抑制RNA酶(RNase)的活性，而且酚能溶解10％-15％的水，从而能溶解一部分核酸。
为了克服这两方面的局限，混合使用酚与氯仿，对于核酸提取，显得更加重要，同时氯仿还能加速有机相与液相分层，去除植物色素和蔗糖。
在氯仿中加入少许异戊醇的目的在于减少蛋白质变性操作过程中产生气泡。
最后用氯仿抽提处理，是为了去除核酸溶液中的痕量酚。
如果所提核酸的酶反应条件要求极严格，最可靠的方法是再用水饱和的乙醚抽提一次，以彻底去除核酸样品中的痕量酚与氯仿，然后在68℃水浴中放置10分钟，使痕量乙醚蒸发掉。
1.2 酚/氯仿抽提法的基本步骤如果DNA或RNA体积较小，一般于1.5ml的Eppendorf离心管中进行，若体积较大则于10-50ml 的离心管中进行。
应事先准确测量样品的体积。
1) 在每一样品中加入等体积的酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）溶液。
2) 若DNA片段小于l0kb，可以振荡混合；若大于l0kb，则反复轻柔地转动离心管，形成乳状液。
切勿使用高速的振荡器。
3) 室温下，于10000×g以上（一般要10000-12000 rpm以上）离心l0分钟。
4) 吸取上层水相于一个新的离心管中。
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缺点：灵敏度低 特异性较差
核酸探针
核酸分子技术路线
靶核酸
标记、纯化
分离纯化
液相杂交 固相杂交
原位杂交
预处理
探针-靶反 应
纯化杂交体
放射性核 素检测
非放射性杂 化分子检测
限制性酶切
杂交信 号检测
（二）、印迹技术的类别及应用
1、DNA印迹技术 (Southern blotting)
GCCTAG+
GATCC G
粘端切口
同功异源酶
来源不同的限制酶，但能识别和切割 同一位点，这些酶称同功异源酶。
Bam HⅠ GGATCC CCTAGG
GCCTAG +GATCGC
BstⅠ
GGATCC CCTAGG
GCCTAG+
GATCC G
同尾酶
有些限制性内切酶虽然识别序列不完全 相 同 ， 但 切 割 DNA 后 ， 产 生 相 同 的 粘 性 末 端，称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称 为配伍未端(compatible end)。
2、DNA体外连接
三、其他工具酶
1、大肠杆菌DNA聚合酶 2、耐热DNA聚合酶（Taq酶） 3、逆转录酶 4、甲基化酶：将某些限制位点甲基化，使
DNA不再被某些限制酶切割，在制备重组 DNA时用于修饰目的DNA内部的一些限制位 点，保护目的DNA。
第二节 分子克隆常用载体
克隆(clone)
来自同一、其他载体
酵母人工染色体 (yeast artificial chromosome, YAC) 细菌人工染色体 (bacterial artificial chromosome, BAC) 动物病毒DNA改造的载体 （如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）
载体分类：
转染 transfection 用病毒或病毒DNA感染细胞。
基因表达，尤其 是转录水平
寡核苷酸探 针 人工合成
（1）链短， 杂交时间短 （2）对单核 苷酸变化敏 感
（1）所带标 记物较少， 灵敏度较低
基因点突变 分析
常见的探针标记物
放射性核素
优点：灵敏度高 对酶促反应无影响 假阳性率低
缺点：半衰期短 易造成放射性污染
常见的探针标记物
非放射性标记物 优点：无放射性污染
标记其末端或全链的已知序列的多聚核苷 酸，与固定在NC膜上的核苷酸结合，判断 是否有同源的核酸分子存在。
探针种类：
DNA探针 cDNA探针 RNA探针 寡核苷酸探针
基因组DNA探针
来源 克隆化的基因片 段
优点
（1）制作方法 简便，易获得 （2）不易降解 （3）标记方法 成熟
易因非特异性杂 交出现假阳性结 缺点 果
分子克隆（DNA可隆、基因克隆、重组DNA等） 。
分子克隆（DNA可隆、基因克隆、重组DNA）
一、质粒(plasmid)载体
1、基本特征： 2、类型：F、R、Col 3、命名：例 pBR322 4、 pBR322质粒载体的特点
第二节 分子克隆常用载体
二、噬菌体载体
1、一般特征：是一类细菌病毒的总称，结构 比质粒复杂，感染效率很高。
基本原理
DNA加 热变性
DNA冷却 复性
DNA/RNA 杂交
变性
复性
RNA
DNA
二、核酸分子杂交的基本分类
DNA-DNA杂交
杂交
DNA-RNA杂交
杂交的基本分类
根据杂交介质的不同
液相杂交 固相杂交 原位杂交 基因芯片技术
三、核酸分子杂交与印迹技术
（一）、核酸探针
探针 (probe) 一小段用同位素、生物素或荧光染料标
克隆化(cloning)
获取同一拷贝的过程，即无性繁殖。
技术水平： ①分子克隆(molecular clone)，即DNA 克隆 ②细胞克隆 ③个体克隆（动物或植物）
DNA克隆
视频
应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质 （同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人 工的DNA）与载体DNA接合成一具有自我复制能 力的DNA分子——复制子(replicon)，继而通过转 化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子 细胞，再进行扩增提取获得大量同一DNA分子， 也称基因克隆或重组DNA (recombinant DNA)
Bam HⅠ GGATCC CCTAGG
Bg lⅡ AGATCT TCTAGA
G CCTAG
+
GATCC G
ATCTAG+GATCTA
使用注意
二、DNA连接酶和DNA分子的体外连接
1、DNA连接酶 : 1967年首先发现，能催化2 条DNA链之间形成磷酸二酯键。
根据来源分： ①大肠杆菌 ②T4噬菌体
2、定义： 2、命名：
3、分类：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ （基因工程技术中常用Ⅱ型）
4、 II 型限制酶的特点 Ⅱ类酶识别序列特点—— 回文结构(palindrome)
GGATCC CCTAGG
切口 ：平端切口、粘端切口
HindⅡ
GTCGAC CAGCTG
GTC CAG
+
GAC CTG
平端切口
Bam HⅠ
GGATCC CCTAGG
第三章 分子生物学常用 技术和基本原理
第一节 分子生物学常用工具酶
一、限制性核酸内切酶与DNA分子的体外切割
1、来源与作用：是原核生物中的一类防御武器，可 以将外源性DNA分子切割成大小不同的片断，而细 菌本身的DNA由于修饰酶（通常为甲基化酶）的保 护作用，免受降解。与甲基化酶共同构成细菌的限 制修饰系统，限制外源DNA， 保护自身DNA。1970 年首先在流感嗜血杆菌中发现Hind Ⅲ 。
微生物诊断 应用 中药鉴定
cDNA探针 RNA的逆转录 （1）不含内 含子 （2）杂交特 异性高
制备复杂，不 易获得
基因表达
RNA探针
mRNA、病毒 RNA
（1）杂交体稳定 （2）不存在互补 双链的竞争性结 合 （3）杂交特异性 高 （4）杂交后本底 低
（1）易降解 （2）标记方法较 复杂 （3）polyA影响 杂交特异性
转导 transduction 以噬菌体为媒介，转移遗传物质。
转化 transformation 以质粒将外源性DNA引入细胞的过程。
第三节 核酸分子杂交 (nucleic acid hybridization )
一、基本原理 在DNA复性过程中，如果把不同DNA
单链分子放在同一溶液中，或把DNA与 RNA放在一起，只要在DNA或RNA的单链 分子之间有一定的碱基配对关系，就可以 在不同的分子之间形成杂化双链 (heteroduplex) 。