bDNA与RT_PCR方法检测艾滋病患者病毒载量结果对比研究_张淑琼

论著·临床辅助检查中国社区医师·医学专业2010年第29期(第12卷总第254期)191　b D N A 与R T -P C R 方法检测艾滋病患者病毒载量结果对比研究张淑琼　吕　浩　穆剑强　李　婷丁　恒661100云南红河州第一人民医院d o i :10.3969/j .i s s n .1007-614x .2010.29.201近几年来,艾滋病(A I D S )呈上升趋势,艾滋病(H I V )感染者人数近100万,因此,对A I D S 病例的及时治疗及疗效观察是当务之急的大事。

艾滋病病毒载量是艾滋病人抗病毒治疗中,疗效观察的两个重要指标之一,并可用于艾滋病人确诊后预示疾病演变,提示开始治疗时间。

目前艾滋病病毒载量检测方法主要有b D -N A 方法(分枝D N A 杂交试验)、N A S B A (自主核酸序列复制)、R T-P C R (逆转录-聚合酶链反应),b D N A 及N A S B A 方法只能用进口仪器及配套试剂进行检测,R T-P C R 方法有多种改进方法,可用进口或国产设备进行检测,我省大部分检测用b D N A 方法。

b D N A 方法检测费用昂贵。

我州属于艾滋病重灾区,为了寻找费用低廉,检测结果准确,重复性检测一致性好、稳定的艾滋病病毒载量检测方法,用于临床艾滋病病人抗病毒疗效观察,红河州第一人民医院用费用较低的巢式P C R 方法进行艾滋病病毒载量检测,并与b D N A 方法检测结果进行比较。

材料和方法标本来源:标本来自红河州第一人民医院2009年1月～2010年6月临床治疗病人250例,男199例,女51例,年龄20～72岁,平均37岁。

所有病人均经过云南省疾病预防控制中心艾滋病确认实验后,或由红河州疾病预防控制中心艾滋病确认实验确认感染H I V-I 。

病人抽静脉血5～10m l 置于以E D T A 真空采血管内颠倒混匀5～10次,1500r p 离心1～5分钟分离血浆,将血浆分装于2～5个冻存管内,立即放-80℃冰箱保存,检测前将标本用冷水解冻后立即进行检测。

检测仪器及试剂方法:使用拜耳公司生产的Q 340荧光讯号测计仪,采用配套H I V-I 载量试剂检测,严格按使用说明书操作。

仪器采用达安公司生产的D A-7600扩增仪,试剂采用达安公司生产的人类免疫缺陷病毒I 型(H I V-I )巢式核酸扩增(巢式P C R )荧光定量检测试剂盒。

严格按使用说明书操作。

检测方法:b D N A 方法:浓缩提纯样本,加50m l 粉红色浓缩指示剂及1000μl 病人样本于1.5m l 离心管内,以相同方法加6个标准品,低阳、高阳质控品,阴性对照品于离心管内,立即置低温高速离心机4℃23000×g 离心1小时,取出离心管弃去上清液,留下20μl 浓缩标本放-80℃冰箱半小时。

裂解病毒及捕捉病毒核酸:从冰箱取出样本加裂解液120μl ,置63℃水浴箱内裂解2小时,裂解后经短暂离心及混匀,加100μl 裂解处理后的标本于包被有捕捉探针的微孔内,放入b D N A 检测仪内53℃孵育16小时。

进行信号放大、测量、计算结果:孵育后进行以下操作,由仪器对微孔清洗,手工加入100μl 前放大器,孵育30分钟;清洗,加入100μl 放大器(b D N A ),孵育30分钟;清洗,加入100μl 碱性磷酸酶,孵育45分钟;清洗,加100μl 荧光底物,孵育30分钟;仪器检测荧光强调,由同时测定的标准曲线计算出标本内病毒载量,结果以C o p i e s (拷贝)/m l 表示,检出限50C o p i e s /m l 。

结果有效性判断,标准曲线呈一条斜向右上的光滑曲线,低阳及高阳质控品检测结果在规定范围,阴性质控检测结果小于检出线。

结果表示:H I V R N A 含量小于检测线50C o p i e s /m l 只报<50,H I V R N A 含量大于50C o p i e s /m l ,报具体数值。

检测方法:巢式P C R 方法:提取R N A :取灭菌的0.5m l 离心管加入10μl R N A 提取液A 及100μl 血浆,再加入200μl R N A 提取液B ,振荡混匀,室温放置5分钟,8000r p m 离心1分钟,吸去上清液。

加200μl R N A 提取液B ,充分混匀。

加预冷的75%乙醇400μl 充分混匀,8000r p m 离心1分钟,弃去上清液,打开管盖,65℃干燥10分钟,盖上盖待用。

逆转录:向干燥后的沉淀管加入18μl 逆转录反应液及逆转录酶系2μl ,37℃放置45分钟,95℃加热3分钟,8000r p m 离心1分钟,待用。

第1次P C R 扩增:取蓝色P C R 反应管(内装扩增体系),加入逆转录产物5μl ,8000r p m 离心数秒,放入仪器样品槽。

循环条件:50℃5分钟,93℃3分钟,93℃30秒……95℃30秒,72℃30秒,15个循环。

第2次P C R 扩增:取无色P C R 反应管(内装扩增体系),加入第1次扩增产物5μl ,同时在外反应管加定量参考品5μl (4个浓度),8000r p m 离心数秒,放入仪器样品槽。

循环条件:93℃2分钟、93℃45秒、55℃60秒……10个循环,93℃30秒、55℃45秒……30个循环。

分析条件设置:根据分析后图像调节B a s e l i n e 的S t a r t 值设定阈值,使S t dc u r v e 窗口下的标准曲线图达到最佳,即C o r r e t -e l a t i o n 数值介于-0.97到-1.0,在A n a l -y s i s 分析菜单下选择A n a l y z e 自动分析结果。

质量控制:阴性质控品为阴性,阳性质控品:全部阳性,临界值阳性质控品值在1.000×102I U /m l ～2.500×103I U /m l 范围。

阳性定量参考品:全部阳性,且0.97≤︱r ︱≤1。

以上要求需在同一次实验中同时满足,否则本次实验无效,全部实验应重新进行。

结果判定及表示:阴性结果判定:如果增长曲线不呈S 型曲线或C T 值≥30,则实验结果判定为样品的H I VR N A 含量小于检测限100I U /m l ,只报<100I U /m l ;阳性结果判定:如果增长曲线呈S 型曲线,C T 值<30,则判定为阳性,定量由仪器根据同时测定的标准曲线或自动计算,报告具体数值,病毒载量单位:I U /m l 。

结　果两种方法检测艾滋病标本250例,在250份样本中,以b D N A 方法检测结果参照,在b D N A 方法检出250份,巢式P C R 方法检出250份中,检出率达96.8%,见附表。

结果重复性:用巢式P C R 方法20例标本检测2次,检测重复性较好。

详见表1。

讨　论艾滋病病人在抗病毒治疗中,需对病人体内艾滋病病毒载量进行测定,以观察疗效,因此,不仅要求准确的定量结果,而且要求检测结果稳定,以便对比。

b D N A 方法采用信号放大的原理,用覆盖H I V-I 基因全长的捕捉探针包被微孔,捕捉标本内H I V-I 核酸,捕捉的H I V-I 核酸经b D N A 放大并用荧光标记,用荧光测计仪检测荧光,荧光强度与标本内H I V-I 含量成正比,经同时测定的标准曲线,计算论著·临床辅助检查C H I N E S EC O M M U N I T YD O C T O R S 192　中国社区医师·医学专业2010年第29期(第12卷总第出标本内H I V-I 含量,即艾滋病病毒载量。

由于采用信号放大,并使用H I V-I 基因多个保守区多条寡核苷酸探针,能够与H I V-I m 群的A-F 亚型结合,减少基因变异对实验准确性的影响,因此,检测艾滋病病毒载量结果准确可靠,重复性好。

目前在国内较多的用于艾滋病病人抗病毒疗效观察。

但b D N A 方法必须使用进口的配套试剂,检出费用高。

P C R 采用稳定引物,将H I V-I 核酸片断成几何级数扩增,经荧光标记进行检测,同时测定标准曲线,返算出标本内原始拷贝艾滋病病毒载量,巢式P C R 方法采用两次扩增,在第1次扩增15个循环,再将扩增产物加入新的扩增体系扩增40个循环,以提高检测灵敏度,能检出标本中较低拷贝数的病毒。

巢式P C R 方法与b D N A 方法对艾滋病病毒载量检测结果进行对比。

巢式P C R 方法相对于b D N A 方法符合率96.8%,巢式P C R 方法检测试剂稳定性,经过1年多的使用,及对同一标本对次检测结果进行分析,检测结果较稳定。

研究采用的巢式P C R 方法检测试剂盒为国产试剂,费用仅相当于b D N A 方法的1/9。

每次检测附加费用少,易于小批量标本检测,缩短检测周期,及时出报告。

H I V-Ⅰ的病毒感染、传播及A I D S 病程的发展至关重要。

当前全球A I D S 流行日趋严重,特别是在发展中国家。

我国A I D S 的流行正在进入高速发展期,采取有效的预防和治疗措施十分必要。

依据H I V-Ⅰ感染者的疾病状态,对他们进行适时合理的的治疗是预防治疗A I D S 的重要措施。

本次实验提供了两种方法检测艾滋病病毒载量结果客观数据,为临床实际选用检测、及时提供了更多的选用依据。

效益分析:进口试剂的国产化是我国医学检验发展的重要任务之一[1]。

该试剂应用一年余,与进口试剂比较及临床应用效果观察,表明国产试剂完全可以代替进口试剂。

因此,有推广的价值,获得准确结果,起到了与进口试剂同样的作用。

与进口试剂相比,其成本仅为进口试剂的1/9,具有良好的社会效益和明显的经济效益,值得推广应用。

今后努力的方向:经与进口试剂比较及应用,该试剂结果稳定、重复性好,易于小批量标本检测,缩短检测周期,及时发出报告。

我们将采取多种方式积极推广使用,使该项目在我省发挥显著的社会效益和经济效益。

参考文献1　丛玉隆.当代血液分析技术与临床.第1版.北京:人民卫生出版社,1997,12:113-122.表1　250例病毒载量检测结果比较仪器例数检测符合数不符合数符合率%0340荧光检测仪250250096.8P A -7600扩增仪2502428论著·社区中医药温阳解表法治疗肥厚性鼻炎64例吕国洪　王　磊136200辽源市中医院摘　要　目的:通过中药温阳解表法治疗肥厚性鼻炎,免除患者手术之痛苦及其所带来的创伤。

方法:口服中药汤剂,发汗祛风,饮食调理。

结果:通过临床应用,80%患者得到治愈。

结论:温阳解表法对治疗肥厚性鼻炎有显著效果。