第25章-病毒感染的检查方法

第25章病毒感染的检查方法与防治原则第一节病毒的诊断随着对病毒感染从生物学及分子生物学水平的研究进展，病毒的诊断技术已由传统方法扩展至新的快速诊断技术。

病毒感染的快速诊断有利于对病毒感染者的治疗；例如对有些病毒（如疱疹病毒、人类免疫缺陷病毒）感染已有较特异的抗病毒药物治疗。

早期诊断及早期治疗对控制病毒感染十分重要。

此外，从群体感染角度分析，确诊病毒感染的病原在监测病毒的流行病学（如新型流感病毒、肺出血型汉坦病毒的发现等）方面也有重要的现实意义。

标本的采集与送检用于分离病毒或检测病毒及其核酸的标本应采集病人急性期标本。

根据不同病毒感染采取不同部位的标本（如鼻咽分泌物、脑脊液、粪便或血液）。

由于病毒在室温中很易被灭活，应在采集和运送标本中注意冷藏。

如欲检测抗体，早期单份血清可用于检测IgM抗体，而欲检测早期与恢复期的抗体效价的变化，则需采集早期与恢复期双份血清。

血清抗体检测标本应保存于－20℃。

病毒的分离、培养与鉴定目前最常用的方法是细胞培养。

在注明欲检测的病毒后，病毒分离培养的实验室将选择适当的原代培养细胞（敏感性高）及传代细胞系（便于在实验室保存）作病毒分离培养。

接种标本后，细胞可出现病变或也可并不出现病变而需用血细胞吸附等方法检测是否有病毒增殖，并进一步还需用特殊的抗体鉴定病毒的种类，例如用特异荧光抗体染色或抗体中和试验等。

当无病毒增殖时，可能标本中病毒含量较低，未被检出，则需要盲目传代3次后方可明确标本中是否存在病毒。

这一分离与鉴定病毒的全过程有时可长达2～3个月，而且仅在有设备、实验条件及合格工作人员的实验室方可进行。

虽然这种方法所需时间长、步骤多，但在确定病原上是“黄金标准”，即其准确性高而无误。

如我国台湾省确定由肠道病毒71型引起多数患儿发生脑膜炎并致死的研究报道，就是由分离培养及鉴定病毒所确诊。

如欲提高病毒感染细胞培养的敏感性，可将病毒接种于内有盖玻片的细胞培养瓶，经低温离心后，以增加病毒与细胞接触的机率。

再将盖玻片进行培养，并用单克隆抗体染色，藉以通过检测病毒的早期抗原进行诊断。

在流感病毒的分离培养中，最敏感而特异的方法是鸡胚接种，并用血凝和血凝抑制试验以鉴定病毒。

此外，细胞培养也可应用。

分离流感病毒在发现新变异株中具有重要价值。

接种动物分离病毒的方法目前已很少应用，但对狂犬病病毒及乙型脑炎病毒的分离与鉴定中还需应用动物接种，并结合用特异抗体作中和试验或作免疫荧光染色以鉴定病毒种类。

检测病毒抗原及抗体方法对于一些血清型别不多的病毒或在寻常细胞培养系统中还不能成功增殖的病毒，直接检测抗原是快速而实用的方法。

这一方法要求标本中有一定量的抗原和具备高质量的抗体；其原则为免疫学技术，即用特异标记的抗体检测相应的抗原。

可以用免疫荧光或免疫酶标记抗体检测在病毒感染局部脱落细胞或分泌物细胞中的抗原，也可用酶联免疫测定法（ELISA）或乳胶凝集法检测抗原。

这一方法在数小时或一天内可获得结果。

用特异的抗原可以检测病毒感染者血清中的IgM抗体，以快速诊断病原体。

应用的病毒抗原或是利用基因工程表达的重组抗原，也可以是用根据编码基因片段推导的合成肽作为抗原。

一般多用ELISA法检测。

由于IgM抗体出现于病毒感染早期，标本采集的时间对这一方法的检测结果影响很大。

此外，所用抗原的质量与覆盖抗原表位的幅度也会影响检测结果。

用特异抗原也可检测IgG类抗体，但IgG抗体类型用于临床诊断则必须具有早期与恢复期双份血清，并且抗体的效价需有4倍或以上的升高或降低方有诊断价值。

在有些病毒感染中，如获得的血清标本已属感染后期，也可在随访中测定抗体效价，如有4倍降低，可作出辅助诊断。

IgG抗体的检测在调查某一病毒感染在某些地区人群中的感染率也有价值。

此外，还可将病毒蛋白先经凝胶电泳，再转移至膜上，用血清标本与之作用后染色的方法（称Western印迹法、免疫印迹法或蛋白印迹法）检测血清中针对某种病毒抗原亚单位的抗体。

例如这一方法已用于确诊病人所产生的HIV抗体等。

检测病毒核酸的方法由于多数病毒基因均已成功地被克隆及进行了核苷酸序列测定，因此可以利用病毒基因作为探针，用核酸杂交的方法检测标本中有无相应的病毒核酸。

作为探针的病毒核酸可以用同位素或非放射性核素标记。

用探针杂交后，为检测核酸杂交体，可用放射自显影法或用生物素－亲和素系统进行检测。

这一方法的敏感性一般并不高，但对标本中含有病毒核酸量较多时则很实用。

用凝胶电泳将标本中DNA电泳后，转移至膜上（Southen印迹法），再用病毒探针作核酸杂交，可根据分子量大小分辨标本中病毒核酸存在的状态，例如是整合型还是游离型。

对于已测定基因核苷酸序列的病毒，可设计相应的病毒基因的引物，作多聚酶链反应（PCR）。

其原则为先加入标本中提取的核酸（根据待测病毒为RNA 病毒或DNA病毒而加入RNA或DNA），对RNA则需先转录成互补的DNA，加入耐热的DNA多聚酶后，在一定温度及条件下作PCR。

通过扩增病毒基因片段可诊断标本中是否存在病毒核酸。

本法十分敏感可达fg水平，但需注意操作时污染而出现的假阳性。

检测病毒核酸的缺点为，病毒核酸阳性并不等于标本中存在有感染性的活病毒。

此外，对于未知病毒及可能出现的新病毒则因不了解病毒核苷酸序列不能采用这些方法。

第二节抗病毒治疗病毒感染机体引起疾病是病毒与机体相互作用的结果。

因此，抗病毒治疗应采取既针对病毒又针对机体的综合措施，即一方面选用抑制病毒复制的药物或制剂，另一方面需提高机体的免疫应答，促进消灭病毒感染细胞。

抗病毒药物或制剂由于病毒必须进入宿主细胞内复制方显示其生命活性，因此设计抗病毒药物或制剂的策略基本上可分别从病毒感染细胞的吸附、穿入及脱衣壳、病毒核酸复制及装配与释放等不同环节设计不同药物。

虽然对HIV、鼻病毒等已明确其靶细胞表面的受体为CD4及粘附分子ICAM－1，但用重组表达的可溶性CD4并不能有效地抑制HIV复制；模拟ICAM－1的抗病毒制剂尚未用于临床研究。

60年代已发现金刚烷胺（amantadine）可抑制甲型流感病毒脱衣壳，并已用于临床研究，发现有一定的预防作用，但因副作用较大，也未被临床广泛采用。

对抑制病毒基因复制、转录及转译的药物和制剂是开发抗病毒药物的热点，并已取得较好的效果。

1．核苷类药物核苷类化合物是最早用于临床的抗病毒药物。

设计的策略是用合成的异常嘧啶取代病毒DNA前体的胸腺嘧啶，通过使异常嘧啶在病毒DNA分子合成时掺入子代DNA中，阻抑子代病毒结构基因的合成与表达，从而抑制病毒复制或复制出失去感染性的病毒。

如目前常用于眼疱疹病毒感染的碘尿苷（IDU，商品名疱疹净）即为此类药物。

核苷类药物除可作用于病毒的DNA，同时也可掺入细胞的DNA，阻抑细胞DNA的合成，故具有一定的毒性。

为此，进而开展了如何较特异地作用于病毒或病毒感染细胞的新一代的系列药物。

无环鸟苷（acyclovir，商品名阿昔洛韦）及丙氧鸟苷（ganciclovir, DHPG），就是新一代的核苷类药物。

其作用机制是此类药物进入感染细胞后，需经疱疹病毒特异的胸苷激酶磷酸化成三磷酸型后，方可在病毒DNA复制中发挥作用。

无环鸟苷三磷酸通过与dGPT 竞争疱疹病毒的DNA酶以阻断病毒DNA链的复制与延长。

由于在正常细胞中无环鸟苷并无作用，仅在有病毒感染细胞方可发挥抗病毒作用，对病毒复制有高度选择性，对宿主细胞DNA的合成很少影响，不仅提高了疗效还可降低副作用。

经测定，无环鸟苷抑制单纯疱疹病毒Ⅰ型复制与抑制宿主细胞生长的浓度相差约3000倍。

因此除用于局部外，还可注射；可减少疱疹病毒脑炎的死亡率并延长病人生命。

DHPG虽对病毒的治疗效果比无环鸟苷增强100倍，但其毒性也较高。

因此核苷类药物治疗剂的研制主要关键是提高对病毒感染细胞作用的特异性。

在对逆转录病毒HIV的研究中，进行了对逆转录过程中核苷类药物研究。

曾先后研制出不同结构的二脱氧胸腺嘧啶核苷类药物，如2’、3’二脱氧嘧啶核苷（ddt），2’、3’二脱氧次黄嘌呤核苷（ggI）等。

它们可模拟天然的二脱氧核苷底物，经过一系列磷酸化后，作为类似的底物竞争并抑制病毒的逆转录酶。

三磷酸化的3’－叠氮－2’、3’二脱氧胸腺嘧啶核苷（AZT）早在1987年已被批准用于HIV感染者。

因AZT对病毒逆转录酶的抑制比对细胞DNA多聚酶的抑制强100倍，且可能AZT在某些细胞类型，如CD4＋T细胞中可更有效地被磷酸化，故用于HIV感染者后，能降低艾滋病的发病与病死率。

但是发现治疗后6个月，已开始出现耐药毒株。

最近，另一种核苷类药物（3TC），在临床应用中也正成功地抑制HIV的复制，此外3－氮唑核苷（ribavarin商品名病毒唑）也是需在细胞酶作用下磷酸化的药物。

单磷酸三氮唑核苷酸与肌苷类似，可使细胞和病毒复制所必须的鸟嘌呤核苷减少，故可抑制多种RNA和DNA病毒复制。

主要用于RNA病毒感染的治疗，但因其对细胞核酸也有抑制作用，故副作用较多。

2．病毒蛋白酶的抑制物现已发现有些病毒除本身可编码病毒复制或转录后剪接、加工酶外，还具有降解大分子病毒蛋白的酶。

因此，已根据病毒蛋白酶的结构进行设计并研制病毒蛋白酶的抑制剂。

所用方法均是对基因工程表达病毒蛋白酶的结晶用X线衍射技术，和用电脑模拟技术，寻找酶的活性位点。

在HIV 中已设计出针对逆转录酶及蛋白酶活性位点的抑制剂，经细胞中核实确有抑制病毒蛋白酶的作用后，已开发出药品，并已获准进行临床试验。

其商品名称分别为indinavir及ritonavir。

华裔美国科学家用3TC加蛋白酶抑制剂联合治疗HIV，被称为“鸡尾酒”治疗方案，可较长期抑制病毒复制，受到普遍重视。

3．其他干扰素或干扰素诱生剂以及细胞因子IL－12，TNF和一批中草药等天然药物如黄芪、板蓝根、大青叶等也具有抑制病毒复制作用。

4、抗病毒基因治疗1978年有学者根据病毒基因组设计了部分能特异地与其互补的寡核苷酸（又称反义RNA或asON），在体外发现可有效地抑制Rous 肉瘤中病毒的复制。

现已发展有反义寡核脱氧核酸（asODN）、反义寡核苷酸（asON）、核酶（ribozyme）等不同类型的各种制剂。

发展这类制剂首先需选择病毒基因组中的靶基因，然后设计互补的DNA序列片段，一般为15～30个聚寡核苷酸。

通过asODN与病毒的关键基因结合后，可阻抑病毒DNA的复制与RNA的转录。

对RNA病毒asON是通过与靶基因的mRNA互补结合后，阻碍病毒mRNA与核糖体结合而阻抑转译病毒蛋白。

此外，反义RNA与病毒mRNA 结合形成的二聚体，因对核酸酶敏感而迅速被降解，还间接阻断了病毒蛋白质的合成。

在反义RNA基础上发展的核酶是在设计序列时使其具有双重特性，一方面通过互补序列与靶RNA结合，另一方面设计核酶的序列具有酶的活性，可通过特异的位点切割和降解靶RNA。