大豆体细胞胚胎发生与农杆菌介导的遗传转化Studies of Somatic Embryogenesis and Genetic Transf
农杆菌介导大豆子叶节遗传转化体系的优化研究
农杆菌介导大豆子叶节遗传转化体系的优化研究姬月梅;陈受宜;李英慧;张丽娟;宋晓华;常汝镇;邱丽娟【期刊名称】《大豆科学》【年(卷),期】2008(27)1【摘要】以大豆品种"中豆32、Peking、早熟18、绥农14"子叶节为受体材料,用农杆菌介导法转入与抗逆相关的小麦Na+/H+逆向转运蛋白基因(TaNHX2),探索外植体大小、培养基主要成分、培养时间等因素对外植体分化的影响,旨在优化遗传转化条件,提高大豆转基因的遗传转化效率。
研究结果表明,以健康外植体获得率、抗性丛生芽获得率和抗性芽伸长比率为指标,筛选并建立的优化转化系统为:大豆萌发和不定芽诱导时分别加入0.5mgL-16-BA和1.0mgL-16-BA,浸染时间为30min、共培养时间为3d;外植体大小为2/3子叶,kan抗性筛选浓度第一阶段和第二阶段分别是60和50mgL-1;利用上述方法,已获得中豆32转基因再生植株,经PCR分子检测,证明目的基因TaNHX2已导入并整合到大豆基因组中,转化率为3.78%。
【总页数】7页(P26-32)【关键词】大豆;遗传转化;子叶节;Na+/H+逆向转运蛋白;再生【作者】姬月梅;陈受宜;李英慧;张丽娟;宋晓华;常汝镇;邱丽娟【作者单位】宁夏大学农学院,宁夏银川750021;中国农业科学院作物科学研究所/农作物基因资源与基因改良国家重大科学工程/农业部作物种质资源与生物技术重点开放实验室,北京100081;中国科学院遗传与发育生物学研究所,国家重点实验室植物基因组学,北京100101【正文语种】中文【中图分类】S513;S511【相关文献】1.一种高效的农杆菌介导大豆子叶节转化体系的建立 [J], 贾光蕾;曹越平2.农杆菌介导大豆未成熟子叶节的遗传转化 [J], 钟磊;王林红;乔亚科;崔姗姗;纪展波;李桂兰3.农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化研究 [J], 皮照兴;廉玉利;李依娜;崔唱;杨楠4.影响农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化的因素 [J], 刘圣君;黄健秋;卫志明5.农杆菌介导大豆子叶节遗传转化的研究 [J], 李桂兰;乔亚科;杨少辉;靳朝霞;李明刚因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
农杆菌介导大豆遗传转化技术的研究进展
蛋白进行磷酸化修饰 ,进而激活 V ir区基因的表达 。
农杆菌介导的植物遗传转化 ,是农杆菌和受体
V irB 蛋白群和 V irD4形成的 T4SS系统可形成跨膜 植物相互作用的过程 [ 11 ] 。受体材料不仅必须具有
通道 ,为 V irD22T2DNA 以及包括 V irE2和 V irF蛋白 在内的其它蛋白的细胞间运输提供通道 。V irD2可 识别 T2DNA 的左 、右边界序列并在边界序列产生切 口 ,结合到单链 DNA 5′端 ,在运输和核定位等过程
胚尖转化系统具有取材便捷 、筛选方便 、转化 周期短等特点 ,适合大规模转化 ,但仍难避免转化 再生植株嵌合体的问题 ,理想外植体的获取也存在 较大技术难度 。在实际操作中 ,转化系统受大豆基 因型和种子活力影响明显 。 2. 2. 4 器官愈伤组织 目前在大豆中尚难通过愈 伤组织进行植株再生 。最近 ,研究人员利用一类特 殊的愈伤组织进行大豆遗传转化和植株再生获得 成功 ,从而建立了器官愈伤组织转化体系 [ 15 ] 。该体 系以去除腋芽的初生叶节或子叶节为外植体 ,诱导 器官愈伤组织 ,再利用菌液对愈伤组织进行侵染 , 经共培养 、恢复培养后 ,进行筛选和芽诱导 ,幼芽原 基形成时将外植体分成小块 ,转入伸长培养基中进 行进一步筛选 ,伸长 、生根后获得转基因再生植株 。
农杆菌易感染性 ,还需有良好的再生能力 。大量的 研究表明 ,不同大豆基因型不但在转化效率和再生 能力上存在很大差异 ,而且要求不同的转化条件 , 如灭菌时间 、发芽时间 、共培养时间 、筛选剂量等 。
中行使重要作用 [ 6 ] 。V irE2 是 T2DNA 单链结合蛋 白 ,起到稳定 T2DNA 单链结构的作用 ,并在核定位 中发挥一定功能 。V irE1 对 V irE2 功能的发挥起辅
农杆菌介导大豆萌动种子遗传转化的影响因素研究
农杆菌介导大豆萌动种子遗传转化的影响因素研究薛仁镐 (青岛农业大学生命科学学院,山东青岛266109)摘要 [目的]提高农杆菌介导大豆遗传转化效率。
[方法]以萌发1d的半片大豆种子为目标组织,通过G US瞬时表达检测,研究乙酰丁香酮、菌液的浓度及侵染时间对转化效率的影响。
[结果]在共培养基中添加200μm ol/L的乙酰丁香酮时,G US瞬时表达效率最高。
当农杆菌生长到对数生长期(D600nm=0.5)时,转化效率最高,平均每个外植体上出现9.4个蓝色斑点。
农杆菌侵染时间不宜过长,以30～60m in较好。
[结论]乙酰丁香酮浓度、农杆菌菌液浓度和侵染时间均影响农杆菌介导大豆遗传转化效率。
关键词 农杆菌;萌动种子;大豆;遗传转化中图分类号 S565.1 文献标识码 A 文章编号 0517-6611(2008)07-02666-02Study on the F actors A ffecting the G enetic T ransform ation E fficiency of Soybean G erminating Seeds M ediated by Agrobacterium tumefacines XUE R en2gao (C ollege of Life S cience,Qingdao Agricultural University,Qingdao,Shand ong266109)Abstract [Objective]T he aim of the research was to enhance the genetic trans form ation efficiency of s oybean m ediated by Agrobacterium tumefacines. [M eth od]W ith half piece of s oybean seeds germ inated for1d as target tissue,the effects of acetosyring one and A.tumefacines liquid concn.and in fec2 tion tim e on the trans form ation efficiency were studied through G US transient ex pression detection.[Result]W hen200μm ol/L acetosyring one was added to the co2culture m edium,G US transient ex pression efficiency was highest.W hen A.tumefacines grew up to logarithm ic grow th stage(D600nm of0.5), the trans form ation efficiency was highest and9.4blue spots averagely appeared in each ex plant.T oo long in fection tim e was n ot suitable,w ith30～60m in being better.[C onclusion]T he genetic trans form ation efficiency of s oybean m ediated by A.tumefacines was affected by acetosyring one concn.,the liquid concn.of A.tumefacines and the in fection tim eK ey w ords Agrobacterium tumefacines;G erm inating seeds;S oybean;G enetic trans form ation 大豆虽然是双子叶植物,但与其他作物相比,它不易受农杆菌感染。
农杆菌介导的大豆的转化
将预培养 的外植体 放入菌液 中浸染
100rpm, 30min
（5）共培养
❖ 浸染结束后，使用无菌滤纸清除外植体表面多余菌 液，将外植体子叶内面向下平放在表面附有灭菌滤 纸的共培养培养基中进行培养，用 Parafilm 封口， 置于培养室中，温度 24℃，光照时间18小时，共培 养 5天。
共培养培养基
首先获得愈伤组织并诱导成苗，得到再生植株
具体操作步骤
（1）大豆种子的消毒
选取种皮光滑无病斑、无裂痕、无霉变的成熟大豆种子，采 用氯气熏蒸法进行消毒。 ❖ 1. 将种子放入培养皿，将培养皿放入通风橱的干燥器中； ❖ 2. 在干燥器的烧杯中加入100mL
次氯酸钠溶液； ❖ 3. 沿烧杯壁加入4mL浓度
取出外植体
在无菌滤纸 上吸干菌液
Co-culture
（6）生芽诱导
❖ 使用丛生芽诱导液体培养基（含抑菌抗生素）清洗共培养后 的外植体，浸泡 30分钟后，用滤纸吸取表面多余液体培养 基，将子叶内面向上倾斜 30-45度角插入芽诱导培养基 （Shoot Induction Medium I, SIM-I）中，每皿8-10个外植体。 将培养皿置于温度25℃，光照18h的培养室中，培养两周。 将外植体取出，用刀片除去顶芽，保留丛生芽，在下胚轴包 埋面下方进行切面处理，露出新鲜的组织。将外植体插入芽 诱导培养基（Shoot Induction Medium II, SIM-II）中，每皿 8-10个外植体。将培养皿置于温度25℃，光照时数18h培养 室，培养两周。
autoclaving. Pour into sterile 150x25 mm vial (10 ml/vial).
Rooting
（三）转基因植物的检测鉴定方法
农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化研究
农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化研究皮照兴;廉玉利;李依娜;崔唱;杨楠【摘要】大豆遗传转化是目前研究的热点,为提高大豆遗传转化效率提供理论依据,试通过实验确立农杆菌介导大豆遗传转化条件.实验利用含有pCAMBIA3301质粒的农杆菌LBA4404对辽豆-45子叶节进行了侵染,对消毒方法、草铵膦浓度、侵染浓度、侵染时间、乙酰丁香酮浓度、共培养时间等方面进行了优化.实验结果表明:氯气灭菌5h的二次消毒法,可在不影响种子活力的同时把污染率降低为0,确定草铵膦的选择压力为6 mg/L.同时确定辽豆-45子叶节遗传转化的最佳条件为:农杆菌侵染菌液的浓度为OD600=0.6,侵染时间为30 min,暗培养条件下共培养时间为96 h,且共培养液体培养基添加200 μmol/L的乙酰丁香酮有利于转化.经草铵膦抗性筛选、GUS组织化学染色检测、PCR检测,证实pCAMBIA3301质粒的T-DNA 已经整合进了辽豆-45基因组,共获得23株转基因大豆.【期刊名称】《辽宁师专学报（自然科学版）》【年(卷),期】2016(018)003【总页数】5页(P86-90)【关键词】大豆;子叶节;农杆菌介导;二次消毒;遗传转化【作者】皮照兴;廉玉利;李依娜;崔唱;杨楠【作者单位】朝阳师范高等专科学校,辽宁朝阳122000;朝阳师范高等专科学校,辽宁朝阳122000;朝阳师范高等专科学校,辽宁朝阳122000;朝阳师范高等专科学校,辽宁朝阳122000;朝阳师范高等专科学校,辽宁朝阳122000【正文语种】中文【中图分类】S565.1大豆（Glycine max）原产于中国，种植面积极其广泛，是我国重要的油料作物和经济作物之一，也是世界上食用植物油和饲用蛋白的主要来源［1］，运用遗传转化技术进行遗传改良的基因工程育种以期提高大豆单产、抗性和品质已成为大豆育种的研究热点［2、3］．建立稳定高效的大豆子叶节遗传转化体系是提高大豆遗传转化效率的基础，但针对不同基因型建立高效、稳定的遗传转化体系一直是大豆基因工程育种研究领域的难点之一［4、5］．本实验以辽豆－45子叶节为外植体，对大豆种子消毒方法、草铵膦浓度、农杆菌侵染液浓度、侵染时间、乙酰丁香酮浓度以及共培养时间等因素进行了系统的研究，以期获得高效的遗传转化及再生体系，为提高大豆遗传转化效率提供理论依据，为大豆基因工程育种奠定基础．1．1 大豆品种辽豆－45，由辽宁省农科院提供．1．2 农杆菌与质粒农杆菌菌株为LBA4404，其携带双元载体pCAMBIA3301，该质粒有CaMV35S启动的草铵膦抗性基因（Bar）和CaMV35S启动的β－葡萄糖苷酶基因（gus），由郑州大学生物工程系提供．1．3 培养基（1）萌发培养基：B5盐，B5有机物，MS铁盐，30g蔗糖，8g／L琼脂，pH＝5．8．（2）共培养培养基：1／10B5基本培养基，1．67mg／L 6－苄氨基嘌呤，0．25mg／L赤霉素，3mmol／L 2－吗啉乙磺酸，0～400μmol／L乙酰丁香酮（AS），1mmol／L亚硫酸钠，400mg／L L－半胱氨酸，1mmol／L二硫苏酮糖，30g／L蔗糖，8g／L琼脂，pH＝5．8．（3）芽诱导培养基：B5基本培养基，1．67mg／L 6－苄氨基嘌呤，3mmol／L 2－吗啉乙磺酸，250mg／L羧苄青霉素（Carb），100mg／L头孢青霉素（cef），6mg／L草铵膦（PPT），30g／L蔗糖，8g／L琼脂，pH＝5．8．（4）生根培养基：1／2MS，0．2mg／L萘乙酸，1．5mg／L吲哚丁酸，3mmol／L 2－吗啉乙磺酸，30g／L蔗糖，8g／L琼脂，pH＝5．8．2．1 大豆无菌苗的获得选取表面光滑、大小均一、饱满无病斑的大豆种子，置于250mL氯气集气瓶中（利用高锰酸钾与浓盐酸反应，向上排空气法制备氯气），分别在通风厨内灭菌0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10h后，转至超净工作台将种子倒入无菌培养皿中，放置1h吹走大豆表面残余的氯气，再将种子转入5%（m／V）的NaClO中浸泡2min，用无菌水冲洗3～4次，然后将种子接种于MS培养基中．种子的萌发条件为：温度25±0．5℃，光周期为16h／d，光照强度2000lx．种子萌发7d 后统计萌发率和污染率．2．2 草铵膦筛选剂浓度的确定在芽诱导培养基中添加PPT浓度分别为0、2、4、6、8mg／L．将子叶节插入芽诱导筛选培养基，培养条件与2．1相同，观察子叶节的生长状况，确定合适的PPT筛选浓度［6～8］．2．3 农杆菌侵染液制备以YEP培养基（100mg／L利福平＋100mg／L卡那霉素＋100mg／L链霉素）培养农杆菌OD600＝0．5～0．6，在4℃，5000r／min离心10min，收集菌体，将其重新悬浮于共培养液体培养基．2．4 大豆子叶节的遗传转化去掉种皮和大部分的下胚轴，只留靠近子叶3～5mm的下胚轴，将两片子叶从下胚轴中线处切开，除去顶芽和腋芽，并在子叶节点区域划伤6～8次，放置于无菌培养皿中，与用共培养液体培养基悬浮的农杆菌侵染，农杆菌侵染液浓度OD600分别为0．2、0．4、0．6、0．8、1．0，侵染时间为10、20、30、40、50min，然后用无菌滤纸吸去多余菌液，切面朝下放置在乙酰丁香酮浓度分别为0、100、200、300、400μmol／L的共培养液体培养基中黑暗培养，培养时间为24、48、72、96、120、144h．共培养后的子叶节先用无菌水清洗3次，再用不添加琼脂的液体芽诱导培养洗涤2次，清除过度繁殖的农杆菌菌体，用灭菌滤纸吸干后转移到芽诱导筛选培养基中培养（每瓶10个子叶节，每组实验8瓶），培养条件为25±0．5℃，16h／d光照，光照强度2 000lx，两周继代一次，30d时统计芽再生情况，并计算抗性芽再生率．2．5 抗性芽的生根、移栽经芽诱导培养基培养，长出的抗性芽生长至长度约为3～5cm时，切下抗性牙移入生根培养基诱导生根．生根7d后，将其移出组培室，置于室温培养3d；去掉组培瓶上盖，于室温放置5d后移栽，遮荫培养7d．2．6 抗性植株的检测2．6．1 GUS组织化学染色检测取抗性植株和未处理植株（阴性对照）的大豆叶片经90%丙酮中固定20min后，将叶片置于20μL GUS反应液中37℃恒温过夜，随后将染色的叶片在70%乙醇中停止反应并脱去叶绿素，观察叶片的染色情况并拍照［9］．2．6．2 抗性植株的PCR检测采用CTAB法提取GUS染色呈阳性的植株和未处理植株（阴性对照）叶片DNA ［10］，进行PCR扩增，扩增采用Bar基因的引物，可扩增出750bp的产物．反应产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测．PCR引物为：Bar－F，5′－CGAGTCTACCATGAGCCCAGAACGACGCC－3′；Bar－R，5′－GAAACTCGAGTCAAATCTCGGTGACGGGCAG－3′．PCR扩增程序为：94℃5min，94℃60s，53℃30s，72℃60s，35个循环，72℃10min．3．1 消毒方法对污染率及种子萌发率的影响本文采用氯气和次氯酸钠二次消毒的方法对大豆种子进行消毒．实验结果表明：随着氯气灭菌时间的增加，种子的萌发率呈不变至逐渐下降趋势，污染率显著降低，灭菌5h时种子的萌发率高达95%，污染率为0，因此本实验氯气的灭菌时间采用5h．这主要是因为氯气与种子接触时间长，易渗入种子内部，能杀死更多的病原微生物，而在消毒完毕后，种子内部的气体又迅速释放，对种子活力的影响较小，而二次消毒可清除种子表面顽固的病原体以保证无菌苗的获得．3．2 子叶节外植体芽再生过程中PPT浓度的确定表1实验结果表明，子叶节接种于芽诱导筛选培养基培养10d后，除PPT浓度为0mg／L的芽诱导培养基上的子叶节依然鲜活并产生再生芽点，其余培养基上子叶节分化均受到不同程度的影响．当PPT浓度达到6mg／L时，芽诱导培养基上的子叶节基本全部死亡，因此本实验用PPT浓度为6mg／L作为最终的筛选选择压．3．3 遗传转化条件的优化3．3．1 农杆菌侵染液浓度的优化为了便于后期实验除菌，以达到最大的转化效率且以菌液浓度最小为原则，本实验对侵染子叶节的农杆菌菌液浓度进行了优化．本实验选定侵染时间为35min，共培养时乙酰丁香酮浓度为200μmol／L，暗培养时间96h为转化条件，农杆菌侵染液浓度OD600分别为0．2、0．4、0．6、0．8、1．0．由表2可知，当农杆菌侵染液浓度OD600＝0．6～0．8时，抗性芽再生率最高，且差异不大，当OD600＜0．6时，由于农杆菌菌液侵染能力不足，导致抗性芽再生率不高，而当OD600＞0．8时，高浓度的农杆菌菌液对芽的诱导有抑制作用，使抗性芽再生率降低，所以本实验采用的农杆菌侵染液浓度为OD600＝0．6．3．3．2 农杆菌侵染时间的优化选定农杆菌侵染菌液浓度为OD600＝0．6，共培养时乙酰丁香酮浓度为200μmol／L，暗培养时间96h为转化条件，侵染时间为10、20、30、40、50min．由表3可知，侵染30min处理抗性丛生芽诱导率高达68．8%，侵染时间过长或过短均不利于抗性芽的诱导，因此确定农杆菌的侵染时间为30min．3．3．3 共培养基乙酰丁香酮浓度的优化选定农杆菌侵染菌液浓度为OD600＝0．6，侵染时间为30min，暗室共培养时间96h为转化条件，共培养时乙酰丁香酮浓度分别为0、100、200、300、400μmol／L．由表4可知，在共培养液体培养基中添加乙酰丁香酮，可显著提高抗性芽的再生率，说明分类物质能激活农杆菌的侵染活力，乙酰丁香酮浓度为200μmol／L时诱导转化的效果最佳，但乙酰丁香酮浓度过高亦会抑制转化效率．3．3．4 共培养时间的优化选定农杆菌侵染菌液浓度为OD600＝0．6，侵染时间为30min，共培养时乙酰丁香酮浓度200μmol／L为转化条件，共培养时间为24、48、72、96、120、144h．实验结果由表5可知，随着共培养时间的增加，抗性芽的再生率随之增加，但共培养96h后，抗性芽的再生率不再明显增加，且随着共培养时间的增加子叶节周围农杆菌生长量亦增加，导致实验后期去除农杆菌困难．因此确定实验的共培养时间为96h．3．4 PPT抗性植株的获得大豆子叶节外植体经农杆菌侵染30min，暗室共培养96h后，转入含PPT 6mg／L芽诱导培养基上进行筛选培养，10d后大多数子叶节萎蔫变白，只有部分子叶节切口处长出少量愈伤组织并分化出芽点，长出小芽．当小芽长到3～5cm高时转置于生根培养基中进行生根，最终获得35株具有草铵膦抗性的植株．3．5 转基因植株的检测3．5．1 GUS组织化学染色检测如图1实验结果显示，有23株抗性植株的叶片经GUS组织化学染色染成蓝色，而未经过转化处理的对照植株叶片无显色反应．表明携带gus报告基因pCAMBIA3301质粒的T－DNA已经整合进大豆基因组，并且能够正常表达．3．5．2 抗性植株的PCR检测如图2，PCR检测结果表明，阴性对照没有扩增出Bar基因片段，而GUS组织化学染色呈阳性的植株和pCAMBIA3301阳性对照均能够扩增出750bp的Bar基因片段，再次证实外源基因已经整合到大豆基因组中．本实验以前人对农杆菌介导的大豆和其他作物遗传转化经验为基础，研究了农杆菌介导辽豆－45大豆遗传转化的影响因素，并成功地将pCAMBIA3301质粒的T－DNA导入了辽豆－45基因组，证实了辽豆－45适用于农杆菌介导的遗传转化研究，属于易感基因型．本实验二次消毒法灭菌采用高锰酸钾与浓盐酸混合代替次氯酸钠与浓盐酸混合制备氯气，使灭菌时间从14～18h［11、12］降至5h，种子的萌发率高达95%，污染率为0．这种灭菌方法既保持了种子的活力，降低了种子污染率，又缩短了实验时间，节省了劳动成本．良好的侵染方法是大豆遗传转化的关键，决定转化率的高低．本实验对农杆菌侵染菌液、侵染时间、共培养液体培养基中乙酰丁香酮的浓度、共培养时间四个遗传转化参数进行了优化．实验结果表明：农杆菌侵染菌液的浓度为OD600＝0．6，若农杆菌侵染液浓度过低，与外植体接触的农杆菌细胞数目就少，则不能实现高效转化；而农杆菌侵染液浓度过高，农杆菌细胞之间发生相互抑制使其难以转化；侵染时间和黑暗培养条件下共培养时间分别为30min和96h，这两个因素直接影响了质粒T－DNA向受体细胞转移的几率，若这两个时间过长将影响细胞的呼吸作用使转化率降低，且后期实验抑菌困难；酚类物质积累量不足则难以激活农杆菌的活力，导致农杆菌介导植物遗传转化效率低下，而乙酰丁香酮可诱导农杆菌Vir基因活化，从而促进外源基因的整合，实验研究发现抗性芽再生率随乙酰丁香酮浓度的升高呈先增后减趋势，在200μmol／L时诱导转化效果最佳．上述实验结果与刘晨光［13］、翟锐［11］、贾钰莹［14］等的研究结果基本一致．本实验的抗性植株经GUS组织化学染色和PCR分析，证实pCAMBIA3301质粒的T－DNA已成功整合进大豆基因组，至于其能否稳定遗传表达以及是否存在嵌合现象还有待进一步研究．［1］Stacey G，Vodkin L，Parrott W A，et al．National science foundation－sponsored workshop report．Draft plan for soybean genomics［J］．Plant Physiol，2004，135（1）：59－70．［2］杨春燕，姚利波，刘兵强，等．国内外大豆品质育种研究方法与最新进展［J］．华北农学报，2009，24（增刊）：75－78．［3］Hartman G L，West E D，Herman T K．Crops that feed the World 2．Soybean－worldwide production，use，and constraints caused by pathogens and pests［J］．Food Security，2011，3（1）：5－17．［4］段莹莹，赵琳，陈李淼，等．农杆菌介导的大豆子叶节和下胚轴转化方法的比较及优化［J］．大豆科学，2010，29（4）：590－597．［5］刘海坤，卫志明．大豆遗传转化研究进展［J］．植物生理与分子生物学学报，2005，31（2）：126－134．［6］邱波，王志坤，孟凡立，等．不同大豆基因型再生性及对农杆菌敏感性的研究［J］．大豆科学，2011，30（5）：752－756．［7］刘清醒．农杆菌介导的GsPHD2基因对大豆的遗传转化研究［D］．哈尔滨：哈尔滨师范大学，2013．［8］李鹏，张磊，胡琳，等．小麦遗传转化中优良受体基因型及L－PPT适宜浓度的筛选［J］．麦类作物学报，2008，28（2）：193－196．［9］王利华．gus基因线性片段花粉管通道法转化大豆的研究［D］．大连：大连理工大学，2004．［10］王月月，范龙，张洁，等．大豆不同生长时期基因组DNA提取方法的优化［J］．中国农学通报，2013，29（36）：319－325．［11］翟锐，高乐，丁雪妮，等．农杆菌介导大豆子叶节遗传转化体系的优化［J］．大豆科学，2015，34（5）：768－774．［12］王芳娟．耐盐转基因大豆遗传转化体系的建立［D］．秦皇岛：河北科技师范学院，2013．［13］刘晨光，董秋平，乔亚科，等．农杆菌介导大豆遗传转化优化的初步研究［J］．河北农业大学学报，2016，（2）：126－130．［14］贾钰莹，蒋滢，赵强，等．农杆菌介导超高产大豆子叶节遗传转化研究［J］．大豆科学，2014，33（5）：634－637．。
大豆的基因转化方法研究进展
大豆的基因转化方法研究进展摘要大豆是重要的油料作物和高蛋白粮饲兼用作物。
转基因大豆是主要的转基因作物，2011年全球转基因作物面积中转基因大豆占有47%。
基因转化技术迅速发展为大豆产业发展奠定了技术支撑。
论述了基因枪法、农杆菌转化法以及花粉管通道法的利弊，并分析了转基因大豆的产业化现状，以期为转基因大豆的生产提供参考。
Abstract Soybeans are important oil crops and high protein grain and forage crops. Transgenic soybeans are the principal biotech crops，occupying 47% hectares of the global biotech areas in 2011. The rapid development of transgenic technology has laid a technical support for the soybeans industry. The advantages and disadvantages of the particle bombardment，agrobacterium tumefaciens and pollen tube pathway were discussed，and the industrialization status of transgenic soybean was analyzed so as to provide the reference for the production for the transgenic soybean.Key words soybeans；gene transformation；methods；status；research progress大豆是重要的油料和高蛋白粮饲兼用作物，转基因大豆是主要的转基因作物，2011年全球转基因作物面积为1.6亿hm2，其中转基因大豆占有47%。
农杆菌介导的作物遗传转化研究进展
展对 改善作 物 的逆境 胁迫耐 受性 和增加 作物 产量 具 有非 常重要 的 意义 。农杆 菌介 导 的遗传 转化 在植 物
转基 因研究 中具 有重 要 的应 用 价值 ， 为此 ， 对其相 关
研究 进展进 行综 述 。
忍 受 的范 围 ， 就构 成 了作 物 生 长 的“ 境 ” 逆 。逆境 包
Ａｇ ｏ ａ ｔ ｒ ｕ ｍｅ ｉｔ ｄ ｍｏ ｅ ｕ ａ ｅ ｈ ｎ ｓ ，ｈ ｐ ｌ ａ ｉ ｎ ｏ ｒ ｎ ｇ ｎ ｃｍａ ｋ ｒｇ ｎ ｓ ｔ ｅ ｄ — ｒ ｂ ｃ ｅ ｉ ｍ— ｄ ａ ｅ ｌ ｃ ｌ ｒｍ ｃ ａ ｉ ｍ ｔ ｅａ ｐ ｉ ｔｏ ｆｔａ ｓ ｅ ｉ ｃ ｒ ｅ ｅ ｅ ，ｈ ｅ
括 病虫 害等 生物 胁迫 和低温 、 干旱 、 高盐 等非 生物胁
迫 ， 使植 物受 到伤害甚 至 死亡 ， 致 严重影 响 了作物 的 产 量和 品质 。随 着人 们 生 活 水平 的提 高 ， 靠 传 统 仅 育种 已难 以 在 作 物 产 量 和 品 质 方 面 满 足 人 们 的 需 求 ， 提高作 物 的产量 和 品质 ， 物 和非生 物胁迫 信 为 生 号传导 中相 关基 因 的研 究 以及 品质基 因和转 基 因研
的 分 子 机 制 、 记 基 因的 应 用 、 物 转 化 研 究 进 展 和 转 基 因 应 用 前 景 。 标 作
关键 词 ：作物 ；农杆 菌 ； 传 转化 ；标记 基 因 ；转基 因 遗 中图分类 号 ： ８ Ｑ７ 文 献标 识码 ： Ａ 文章 编 号 ：１ ０ ３ ６ （０ １ １ —０ ０ 一Ｏ ０ ４— ２ ８ ２ １ ） ０ ０ ６ ４
农杆菌介导单子叶植物遗传转化研究
种业导刊，2022年第6期Journal of Seed Industry Guidedoi:10.3969/j.issn.1003-4749.2022.06.003农杆菌介导单子叶植物遗传转化研究进展刘文欣（山东农业大学生命科学学院，山东泰安271018）摘要：随着分子生物学的迅猛发展，农杆菌介导技术在转化机制、影响因素、转化率等方面的优势日益为世人所知，其应用也由原来的双子叶植物逐步过渡到以禾本科作物为主的单子叶植物。
基于农杆菌转化的机制，回顾了农杆菌转化技术在小麦、玉米和水稻这3种主要作物上的应用现状，总结了影响转化率的因素并提出了提高转化率的对策，以期为农杆菌转化单子叶植物技术的进一步改进与优化提供有效的借鉴。
关键词：农杆菌介导；单子叶植物；遗传转化；小麦；玉米；水稻中图分类号：S503.53文献标志码：A文章编号：1003-4749（2022）06-0011-06Advances in Agrobacterium ‑mediated Genetic Transformation of MonocotyledonsLIU Wenxin（College of Life Sciences ，Shandong Agricultural University ，Taian 271018，China ）Abstract ：With the rapid develpoment of molecular biology ，Agrobacterium ‑mediated technology has become increasingly known to the world in the transformation mechanism ，influencing factors ，conversion rate and other aspects ，and its application has gradually transferred from the original dicotyledons to monocotyledons dominated by gramineous crops.Based on the mechanism of Agrobacterium transformation ，this paper reviewed the application status of Agrobacterium transformation technology in wheat ，maize ，and rice ，briefly summarized the factors affecting the conversion rate and put forward the countermeasures to improve the conversion rate ，in order to provide effective reference for the further improvement and optimization of Agrobacterium transformation of monocotyledons.Key words ：Agrobacterium mediation ；Monocotyledons ；Genetic transformation ；Wheat ；Corn ；Rice收稿日期：2022-06-09作者简介：刘文欣（2002-），女，山东高密人，在读本科生，研究方向：生物科学。
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遗!传!"#"$%&’(!)*+,+-."!"!#"#"$#!%&&$!&&’研究报告收稿日期!!&&(&()&*"修回日期!!&&(&#)&+基金项目!黑龙江省农科院博士后工作站博士后项目和国家植物转基因中试及产业化基地专项基金!项目编号,$$-.-&&*"资助%/0112345678932:3;<2=/4;4>2?2=92@462A 423$B 5>C 2?:D >;?:E A ;65<82=E :3>A 0C 403;C /A >5?A 5@;?6F >?>@4382=/A >5?A 5;?6G 5A H ?2C 2:82=4H 59521C 5&@I 5107C >A2=J H >?;!>45<?0<753,$$-.-&&*"’作者简介!王!萍!*$#%"$女$博士$教授$专业方向#作物遗传育种与植物基因工程(G 5C #&’(*)"$+"#"()K <;>C #8)1L ;?:"8;H 22M A 2<M A ?通讯作者!王!罡!*$"’"$男$博士$教授$博士导$专业方向#植物分子生物学(G 5C #&!!)+%’&!*%*)K<;>C #L ;?::;?:4D6N "*!"M A 2<大豆体细胞胚胎发生与农杆菌介导的遗传转化王!萍*!(!王!罡!!(!季!静!!(!曾凡亭(!黄彬城(!曹!江(!吴!颖(!*O 黑龙江省农业科学院博士后工作站$哈尔滨*#&&+")!O 天津大学农业与生物工程学院$天津(&&&%!)(O 解放军军需大学植物基因工程研究中心植物分子生物学研究室$长春*(&&"!"摘!要!以##个大豆基因型未成熟子叶为外植体$用高浓度!$’-P 诱导大豆体细胞胚胎发生与植株再生$并对生产上种植面积大*体细胞胚胎发生率高的大豆基因型用农杆菌介导法进行遗传转化(结果表明$东北地区主栽的大豆基因型中有*’个基因型体细胞胚胎发生率超过’&Q (用含有1R .S *!*/’E .J 质粒的T .E ’’&’农杆菌侵染#个东北地区主栽大豆基因型的!*’%个未成熟子叶$经卡那霉素筛选得到*%株抗性株(经9J I *9J I -/204H 53?检测$有*!株呈阳性反应$证明)/基因已导入到大豆中(关键词!大豆)体细胞胚胎发生)农杆菌)遗传转化中图分类号!U %+!!!文献标识码!E !!!文章编号!&!#()$%%!!!&&’"&#)&"$#)&"!"#$%&’()!(*+"%,-*./0(1&2&’%’+2$3&2&"%,4/+2’)(/*+"%(2.051/(.+,"&/%#*6*&$%+"&$%2!(0.&+2V E W R 9>?:*$($V E W R R ;?:!$($,S ,>?:!$($X K W RY ;?:-G >?:($B Z E W R.>?-J H 5?:($J E [,>;?:$V Z\>?:(!*O (/0/+1-12314/516/17$!*+81-.,+0-.’605*9:12’.7+6;8/;708(6+*-6*4$!07<+-*#&&+"$=>+-0)!O ’.7+6;8/;7*0-5<+181.:*-.+-**7+-.6188*.*$&+0-,+-?-+@*74+/:$&+0-,+-(&&&%!$=>+-0)(A B 0<170/17:12380-/C 18*6;807)+181.:$#*4*076>=*-/*7D 17380-/E *-*/+6"-.+-**7+-.$&>*F ;07/*7904/*7?-+@*74+/:123B ’$=>0-.6>;-*(&&"!$=>+-0"5.’"/+,"#/2<;4>A5<7382:5?5@>@L ;@>?60A 56;?64H 535:5?53;4561C ;?4@L 535274;>?5678H >:H 53A 2?A 5?43;4>2?@2=;0N >?@L >4H ><<;4035A 248C 562?2=##:5?24815@>?@2875;?M .>];C 5?4>?@5A 435@>@4;?4:5?5@L 53543;?@=23<56>?42><-<;4035A 248C 562?2=@2875;?L H >A HH ;]5H >:H =35^05?A 82=@2<;4>A5<7382:5?5@>@]>;’.71<06/*7+;9-<56>;456M G H 535@0C 4@@H 2L 564H ;4*’:5?24815@12@@5@@56H >:H =35^05?A 82=@2<;4>A5<7382:5?5@>@!<2354H ;?’&Q ";<2?:@28-75;?:5?24815@=32<W 234H 5;@4;35;M 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H3>@4>;?@2?#*$+($等%*&’.;3L;C5等#*$+"$%!&和T;‘‘53>等#*$+#$%(&分别以大豆的未成熟胚和未成熟子叶为外植体经组织培养诱导体细胞胚胎发生与植株再生获得成功"但由于生产上栽培品种植株再生频率低’重复性差"大豆被世界公认为是难进行组织培养的作物"它严重地阻碍了大豆遗传转化工作的进展!本文以##东北三省生产上主要栽培和由国外引入的早熟耐冷大豆基因型为材料"以未成熟子叶为外植体"诱导大豆体细胞胚胎发生"从中选择体细胞发生率高’在生产上种植面积大的基因型用农杆菌介导法进行遗传转化"为利用基因工程方法改良大豆产量和品质提供理论依据与物质基础!*!材料和方法9M9!供试大豆基因型供试##个大豆基因型见表*"分别由黑龙江省农科院’吉林省农科院’东北农业大学’沈阳农业大学和解放军军需大学提供!9:;!质粒与农杆菌菌株质粒为1R.S*!*/’E.J"农杆菌菌株为T.E’’&’"均由中国农业科学院生物技术研究中心郭三堆先生提供!质粒1R.S*!*/’E.J内含)/基因’=H&%基因’I3&%%基因和E;4基因"启动子分别为(#/’(#/’W2@和(#/#图*$!形成愈伤组织!但不同基因型的出愈率相差较大!变化在!M&&Q!*&&M&&Q之间"大豆体细胞胚胎发生率变化在&!+#M+(Q之间"其中!东农’&#"%没有诱导出体细胞胚的发生"同时还发现!在基因型间!愈伤形成和体细胞胚胎发生所需要的时间不同!依基因型的不同大豆未成熟子叶在培养’!*&6开始形成愈伤!形成愈伤最迟的I;?_;在培养*#6才有愈伤组织出现"体细胞胚胎的发生一般在*#!!&6!个别基因型体细胞胚胎发生所需时间较长!如呼辐!#*在培养!%6时体细胞胚胎形成!并且!体细胞胚胎发生率也较低"大豆的出愈率和体细胞胚胎发生率均表现出很强的对基因型的依赖性!这与e2<;4@06;等#*$++$%’&’9;33244等#*$+$$%#&和.;>-C58等#*$$($%"&得到的大豆体细胞胚胎发生率受基因型影响的试验结果是一致的"各大豆基因型的出愈率和体细胞胚胎发生率结果见表*"表9!大豆不同基因型未成熟子叶的愈伤组织形成和体细胞胚胎发生4+.C&9!@+C 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"$"!遗!传!"#"$%&’(#)*+,+-.$!&&’!!!!!!!!!!!!!!!!!"卷!不同大豆基因型间的转化率也有差异!在农杆菌浓度为[P"&&f&M""侵染*&<>?"共培养(6转化吉林(#"吉林’(和辽豆**时#仅吉林(#得到&M(!Q的转化率#其他两个品种的转化率均为&!#个品种共计转化!*’%个大豆未成熟子叶#经卡那霉素筛选得到*%株抗性植株#进一步9J I检测#得*!株9J I 阳性株#平均转化率为&M#"Q!对转化株进行了9J I-/204H53?检测#全部表现为阳性$图#%#说明)/基因已经根癌农杆菌介导转入大豆中!在试验中还发现#转化体的9J I带的强弱差异很大#有些转化体的9J I带非常弱#几乎难以观察到#而在9J I-/204H53?中可见明显带纹#这也可能是在遗传转化试验中常常转化率较低的原因之一!图G!转化株的H@I和H@I6!(#"F&/2检测A%1:G!H@I+2$H@I6!(#"F&/2$&"&,"%(2()"/+2’)(/*&$<C+2"C&"’(!讨!!论D:9!大豆未成熟子叶体细胞胚胎发生与植株萌发大豆组织培养与植株再生主要是经器官发生和体细胞胚胎发生两种途径!器官发生途径再生植株多以真叶"下胚轴和未成熟子叶为外植体#因其重复性差#再生频率低等原因研究得不多#并主要集中在国内!体细胞胚胎发生途径研究所用外植体有下胚轴"成熟胚"成熟子叶"未成熟胚和未成熟子叶等#其中#大部分研究以未成熟子叶为外植体#国内外均有许多报道!当以未成熟子叶为外植体时#用F/" F/.或T!培养基附加高浓度的生长素$!#’-P或W E E%可诱导大豆体细胞胚胎发生#并获再生植株!但在以往的研究中所用材料生产上主栽的基因型较少#这些基因型的体细胞胚胎发生率往往不高!本研究以东北地区主栽大豆基因型为材料#成功地诱导了未成熟子叶体细胞胚胎发生#并从中筛选出体细胞胚胎发生率高于’&Q的大豆基因型*’个#说明在生产上大面积栽培的大豆基因型有易于进行组织培养的材料#这为进一步进行大豆的遗传转化与利用基因工程方法培育优良的大豆品种奠定了坚实的理论和物质基础!D:;!根癌农杆菌介导大豆未成熟子叶的遗传转化根癌农杆菌介导的遗传转化方法因具有转化外源P W E结构完整"整合位点稳定"转化片段较大和整合后的外源基因结构变异较小等优点已成为大豆遗传转化所采用的主要方法之一#截止到!&&!年#在大豆转基因研究的"!篇报道中有((篇采用了农杆菌介导法#占#(M!(Q!其中#以未成熟子叶为外植体进行农杆菌介导的遗传转化研究较少#仅有#篇报道!9;33244等用T.E’’&’$1B#9X(P%和K B E*&*$1B#9X(P%两个根癌农杆菌菌株对*’个大豆品种的$+&&个未成熟子叶进行遗传转化#经*&<:&TR’*+筛选#得到了*+株抗性植株’%(!T55 V5?7>?等用T.E’’&’$9G I E’*#%和K B E*&* $9/E[I*!!*%对’个大豆基因型的未成熟子叶进行转化#经T.E’’&’$9G I E’*#%转化的’个基因型没有得到转化株)而K B E*&*$9/E[I*!!*%对’个大豆基因型的转化率为&!#M("Q之间’+(!苏彦辉等用含有1R.*’E.质粒的T.E’’&’对中黄’号"中黄+号"中科"号和科丰("号’个大豆品种的未成熟子叶进行转化#在筛选培养基上产生了体细胞胚#但未诱导成完整的植株’$(!\;?等以,;A_大豆未成熟子叶为外植体#采用直接筛选方法得到了&O&(Q的转化率’*&(!赵桂兰等选用%个吉林省大豆品种#用T.E’’&’$1.S(#/72N%对未成熟子叶进行转化#经卡那霉素筛选得到*!株抗性植株#经9J I 检测#有’株为阳性植株’**(!关于大豆基因型对农杆菌介导的遗传转化影响的研究报道有%篇#所用的外植体有未成熟子叶’%("下胚轴’*!!*’(以及子叶节’*#!*%(#尽管各研究者所采用的外植体不同#但得出的结论基本相似#认为基因型间的转化率存在差异#大豆基因型与农杆菌菌株相互作用影响农杆菌转化效率!在本试验中以大豆未成熟子叶为外植体#选用#个生产上大面积栽培的基因型进行农杆菌介导的遗传转化#经抗性筛选"9J I和9J I-/204H53?检测#得到了&M#"Q的转化率!同时还注意到#大豆的基因型间转化效果存在着较大差异!吉林’(的转化效率最高#为&M+%Q#而在相同的试验中#合丰!#和辽豆**没有得到转化苗!这个试验结果与我们""!!#期!!!!!!!!!!!!!!王!萍等*大豆体细胞胚胎发生与农杆菌介导的遗传转化以下胚轴为外植体进行的遗传转化试验结果相似!*+"#说明用不同外植体进行的转化时转化率具有相似性#吉林’(是农杆菌介导遗传转化较好的基因型$除大豆外植体种类与基因型对遗传转化率有影响外#农杆菌侵染时间%农杆菌菌液浓度以及外植体与农杆菌共培养天数等因素对大豆遗传转化率也有一定的影响#有关研究见另文报道$参考文献!I&)&/&2,&’"#!*"!J H3>@4>;?@2?FT#V;3?>A_PE#J;3C@2?9/M E<231H2:5?54>-A;C C8A2<1545?4@2875;?@0@15?@>2?A0C4035M(6+*-6*#*$+(# !!!&"(!!"(’M!!"!.;3L;C5Z.#e53?@BI#V>6H2C<,FM9C;?435:5?53;4>2?=32< A;C C0@A0C4035@2=@5]53;C@2875;?:5?24815@]>;5<7382:5?5@>@ ;?623:;?2:5?5@>@M380-/0#*$+"#*"%&’%(!’+*A!("!T;‘‘53>9E#B>C6573;?6PY#J2C C>?@R.M E132A56035=231C;?4 35:5?53;4>2?=32<><<;4035A248C562?4>@@052=@2875;?M380-/ C18A)+18A I51M#*$+##(&*"&!*"%M!’"!e2<;4@06;G#[H8;<;e M R5?24815@2=H>:HA2<1545?A5=23 @2<;4>A5<7382:5?5@>@;?61C;?435:5?53;4>2?>?@2875;?R C8-A>?5<;N M&>*71’H H8E*-*/#*$++#%#&"$#!%&&A!#"!9;33244V E#V>C C>;<KR#B>C6573;?6PY#J2C C>?@R.M K==5A4 2=:5?248152?@2<;4>A5<7382:5?5@>@=32<><<;4035A248C562?@ 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