胚胎活检时机及部位在植入前遗传学诊断中的新进展

胚胎活检时机及部位在植入前遗传学诊断中的新进展北京大学深圳医院生殖医学中心王佳睿，钱卫平【摘要】胚胎活检是胚胎植入前遗传学诊断的重要步骤，胚胎活检既需要获取生物样本以满足遗传学检测的需求，又要尽可能的降低对胚胎的损伤。

它包括极体活检、卵裂球活检和囊胚期滋养外胚层活检；近期发现囊胚腔液及培养基中存在游离DNA可反映胚胎遗传特性，本文将对不同胚胎活检时机及部位的应用及新进展进行详述。

关键词：胚胎植入前遗传学诊断、胚胎活检、无创性活检胚胎植入前遗传学诊断（PGD）指在体外受精过程中，对具有遗传风险患者的胚胎进行种植前活检和遗传学分析，以选择无遗传学疾病的胚胎植入宫腔，从而获得正常胎儿的诊断方法。

广泛应用于携带单基因遗传病、染色体病、性连锁遗传病等疾病的夫妇中。

而胚胎活检是PGD中至关重要的步骤，它既需要获取生物样本以满足遗传学检测的需求，又要尽可能的降低对胚胎的损伤。

故选择一个合适时机及部位进行胚胎活检在PGD技术中显得尤为重要的。

1 极体活检当卵母细胞成熟时，完成第一次减数分裂，排出第一极体；受精后排出第二极体；通过对极体的染色体或基因状态进行分析，可以间接的推测卵子的染色体结构、数目是否异常或者是否携带有致病基因。

由于极体不是胚胎发育所必需的，不影响卵子的受精功能或胚胎的正常发育，不会引起胚胎遗传物质的减少，所以这项技术广泛应用于立法禁止胚胎活检的国家，如德国、奥地利、瑞士和意大利[1]。

分析极体的染色体整倍体性/非整倍体性，可以间接推测胚胎的整倍体/非整倍体性；若母亲为携带遗传病基因的杂合子状态，极体中测出携带有致病基因，则表示卵细胞携带的基因异常。

另外，极体活检可以提供的遗传学诊断时间相对较长，不会错过胚胎移植时间，有利于胚胎在新鲜周期移植。

Feichtinger[2]等对极体活检行PGS推测胚胎的整倍体性，PGS组活产率为35.7%，而对照组（非活检组）活产率为22.7%。

行极体活检PGS可明显提高患者活产率。

Christopikou[3]等对高龄女性（≥35岁，平均年龄39±3岁）的胚胎进行极体活检来判断胚胎染色体整倍体性，发现其准确率为93%。

但是，利用极体活检只能间接反映来自于母亲的遗传信息，不能分析父亲的遗传信息。

而且从胚胎发育的角度看，并不是每一枚卵母细胞都会发育至可利用胚胎，如果进行极体PGD/PGS，有可能会增加无效的工作及诊断花费，造成资源浪费。

因此一定程度上限制了极体活检的应用。

在对子代安全性的研究中，Strom[4]等对109名极体活检后出生的新生儿进行随访，内容包括：出生孕周、出生体重、身长、是否合并出生缺陷等方面，结果提示，极体活检对子代的生长发育没有明显影响。

2 卵裂期胚胎的卵裂球活检采用卵裂期胚胎的1-2个卵裂球活检进行胚胎遗传学分析，可以同时分析来自父母双方的遗传信息，世界首例PGD婴儿即采用的卵裂期胚胎活检[5]。

卵裂期胚胎活检曾经是PGD最主流的活检取材方式,1997-2009年全球86.9%的PGD/PGS 周期及96.8%的PGD采用卵裂球活检;2010年全球83.5%的PGD/PGS周期及95.8%的PGD采用卵裂球活检[6]。

由于卵裂早期的胚胎对显微操作十分敏感，活检时容易受损伤；桑葚期胚胎细胞之间连接紧密，操作困难，故卵裂球胚胎活检即在胚胎发育至6-8个细胞时取1-2个卵裂球进行活检。

一般认为，这个时期胚胎的卵裂球是具有全能性的，因此活检1-2个卵裂球不会严重影响胚胎的发育潜能。

但是，卵裂期胚胎嵌合比例较高，40-60%的卵裂期胚胎为嵌合体[7]，另外，卵裂期活检可检测的细胞数也较少（1-2个），故使用卵裂球活检进行PGS出现假阳性或假阴性的比例较高。

虽然一般认为卵裂球是具有全能性的，但近年来，越来越多的证据表明，卵裂期活检对胚胎发育有负面影响。

Scott[8]等2013年设计的一项随机对照研究，比较卵裂球活检与囊胚期滋养外胚层活检后胚胎着床率的分析，所有病例均移植2枚胚胎，1枚活检胚胎及1枚未活检胚胎，妊娠后通过母亲血中胚胎DNA指纹验证妊娠胚胎来源，发现卵裂球活检后胚胎着床率显著低于囊胚期活检胚胎，卵裂球活检胚胎着床率较未活检胚胎下降39%，而囊胚期活检胚胎与未活检胚胎着床率无统计学差异。

在对子代安全性的研究中，Desmyttere等对102名卵裂球活检的PGD/PGS子代进行随访，发现该子代在孕期至产后2年内的生长发育指标与常规卵胞浆内单精子注射（Intracytoplasmic sperm injection, ICSI）的子代无差异。

YU Y[9]等发现进行卵裂球活检的小鼠，出生后较对照组相比出现记忆减退，后续对两组小鼠成年后大脑组织进行蛋白组学分析，发现与对照组相比，活检组小鼠大脑组织中有36种蛋白的表达有显著性差异，这些蛋白主要与神经退行性疾病有关，并发现活检组小鼠的神经纤维髓鞘形成减少。

研究认为神经系统的发育可能对卵裂球活检非常敏感，卵裂球活检小鼠后代患有神经退行性疾病的风险增加。

Yu Y[10]等在2013年发现卵裂球活检的小鼠，高龄时的生育力较同龄未活检小鼠有下降，在进一步行蛋白组学研究中发现3中蛋白：PSMB8、ALDH1A1、HSPA4表达异常。

综上所述，由于卵裂期胚胎嵌合现象发生率高，且处于对活检胚胎发育影响及子代安全性考虑，目前卵裂球活检所占比例在逐渐下降。

3 囊胚时期的滋养滋养外胚层活检体外培养的胚胎通常在第5-6天发育至囊胚，此时胚胎的细胞数目明显增多，可以达到100个以上，囊胚滋养外胚层将来会发育成胎盘或胎膜，不参与形成胎儿部分，对滋养外胚层细胞进行活检，不损伤决定胚胎发育的内细胞团细胞。

因此，囊胚期活检不仅能够提供较多的细胞进行遗传学分析，增加遗传检测的可靠性，而且也能够避免对胎儿部分的损伤。

当胚胎发育至囊胚期时，染色体嵌合比例较卵裂期胚胎明显降低，能提高遗传学诊断的准确性，降低误诊率。

Scott[11]等2013年设计的一项随机对照研究，发现对囊胚滋养外胚层活检行染色体筛查后，胚胎种植率为66.4%（89/134），对照组种植率为47.9%（78/163），两者相比，行囊胚滋养外层活检胚胎的种植率较对照组明显升高。

另外，发育至囊胚期的胚胎基因表达更完整，更有利于选择好的胚胎移植，减少移植胚胎的数目，可以有效的减少多胎妊娠。

但是，目前的胚胎培养技术条件下，并不是所有的胚胎都能发育成囊胚，囊胚期活检可能会出现没有囊胚形成，无胚可检的情况。

另外，虽然囊胚期胚胎染色体嵌合体比例显著低于卵裂期胚胎，但仍存在内细胞群与滋养外层细胞的核型不一致的嵌合体现象，有可能导致误诊。

囊胚期活检提供给遗传学分析的时间较短，通常需要冻存胚胎。

4 其他活检方法4.1囊胚腔液活检Chen[12]等在2005年发现，在囊胚玻璃化冷冻时，将囊胚腔液吸出能显著提升囊胚的复苏率；并发现囊胚腔液体积约0.3-0.5nl。

2013年Palini[13]首次发现，在囊胚进行玻璃化冷冻时吸取囊胚腔中的液体，90%的囊胚腔液存在可扩增的游离DNA，可用于遗传学检测。

囊胚腔液不是囊胚继续发育所必需的，吸取囊胚腔液并对其中的游离DNA进行遗传学物质检测，避免了直接对胚胎细胞进行活检。

因此，囊胚腔液活检既能达到对胚胎进行遗传学检测的目的，又能避免损伤胚胎，是目前PGD/PGS较为无创的活检方式。

Zhang[14]发现囊胚腔液的游离DNA 利用高通量测序技术，扩增有效率为84%。

Magli[15]等的研究发现，82%的囊胚腔液能够成功检测DNA，与滋养外胚层活检结果相比，囊胚腔液活检与之一致率达97.1%，认为囊胚腔液活检有很好的临床应用前景。

Tobler[16]等通过对60枚胚胎分别行卵裂球活检、囊胚腔液活检及囊胚滋养外胚层活检结果比较发现，70%的卵裂球活检提示非整倍体的胚胎，能发育成整倍体囊胚；囊胚液与滋养外胚层活检染色体不一致率高达52%；囊胚腔液活检阳性预测值为0.41；阴性预测值为0.92。

作者分析囊胚液与滋养外胚层活检结果不一致的原因可能是由于囊胚腔液中游离DNA来源于异常的卵裂球裂解而来，故导致囊胚腔液活检的阳性预测值较低。

目前，囊胚腔液活检仍处於实验阶段，其游离DNA的来源尚未明确，是否能代表内细胞团的DNA仍需更多的实验验证。

另外，在目前的胚胎培养技术条件下，并不是所有的胚胎都能发育成囊胚，且由于囊胚腔液体积较少，部分样本有扩增失败可能。

此项技术目前仍处于实验阶段，有较好的发展和应用前景。

4.2培养基活检培养基活检是利用培养液中游离DNA来推测胚胎的遗传学特征，其游离DNA 来源主要是细胞坏死、细胞凋亡以及细胞分泌而来。

培养基活检的优势在于完全不损伤胚胎细胞，达到真正的无创性检测，同时样本获取方便，收集方法简单。

Assou[17]等2014年首先应用培养基中的游离DNA测定胚胎性染色体。

Xu[18]等利用囊胚期的培养基中游离DNA，对胚胎染色体整倍体性进行分析，相对于囊胚期胚胎外滋养层活检比较，培养基活检的敏感性为0.882，特异性为0.840。

Wu[19]等将培养基活检应用与在α地中海贫血基因的检测中，分析D4-6培养基中游离DNA，与囊胚期活检相比，培养基活检诊断有效率为88.61%；同时作者比较了D4、D5及D6培养基活检的有效性，发现D5培养基诊断有效率最高。

培养基活检具有无创性、样本收集方便、快速等优势，有巨大的发展前景。

但是培养基中游离DNA是否能代表胚胎遗传特性，以及如何清除培养基中添加物、颗粒细胞、精子等外界、母源性、父源性的干扰，仍需更多的临床试验结果来验证其可行性及准确性。

5 小结胚胎活检是PGD/PGS中至关重要的步骤，极体活检由于自身特性在应用上收到限制，卵裂球活检曾是全球应用最广泛的活检方法，但由于卵裂期胚胎嵌合体比例高，且处于对胚胎着床能力及子代安全性考虑，应用逐渐减少。

囊胚滋养外胚层活检由于其可供检测细胞较多、囊胚嵌合体比例低且不影响胚胎后续发育潜能等优势，逐渐成为目前最常用的活检方法。

但上述活检方法对于胚胎、配子而言，仍属于有创性操作。

为寻找更无创且准确、方便等活检方式，近期发现囊胚腔液及培养基中存在游离DNA可反映胚胎遗传特性，但其可行性及准确性仍需更多临床试验验证。

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