极体分析在植入前遗传学诊断中的应用

极体活检是另外一种较常用的方法， 极体是卵 子减数分裂的产物， 卵子在完成第一次减数分裂时
收稿日期： ２００５－ １０－ １７ 修回日期： 极体， 由于卵子减 数分裂同源染色体配对、交换遗传物质， 所以正常变 异的基因都可能出现在极体中。在获卵后取第一极 体， 在精卵结合受精后取第二极体， 或在受精后同时 取第一、二极体， 通过对极体的分析间接推论卵子的 基因型。取极体并不影响卵子的正常发育与受精， 极 体活检后的卵子的受精率、卵裂率、囊胚形成率与未 活检的卵子无显著差异， 其种植率也相似， 对已出生 的 １０９ 例经过极体活检的新生儿进行随访也未发现 异常， 证明极体活检是安全的［３］。而且， 由于其并不 是对胚胎本身进行操作更易在心理和伦理上为一些夫 妇所接受。由于取材较早， 可有更多的时间进行分析。
ＰＧＤ 用单细胞进行聚合酶链式反应（ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ， ＰＣＲ） 扩增， 等位基因脱扣（ ａｌｌｅｌｅ ｄｒｏｐ ｏｕｔ， ＡＤＯ） 是影响基因诊断的主要因素之一， 有研究 证实， ＡＤＯ 的发生率随检测细胞的类型以及待测基 因位点而有所不同［５］。有研究者应用多重 ＰＣＲ 对囊 性纤维性病变和镰状细胞贫血患者进行 ＰＧＤ 诊断， 发现△Ｆ５０８ 突变和 β球蛋白基因在卵裂球、纤维细 胞以及极体的 ＡＤＯ 发生率分别为 ３３．３％／２２．８％， ７．１％ ／７．７％， ５．９％／９．６％， 通过同时扩增和待测基因紧密 连锁的多态性位点， 可以检测出单个卵裂球△Ｆ５０８ 突变和 β球蛋白基因发生的一半以上的 ＡＤＯ（ 分别 为 １９．４％和 １２．３％） ， 而极体的 ＡＤＯ 几乎可全部检 测出［５］， 证明极体 ＰＧＤ 是诊断单基 因 遗 传 病 的 准 确 可靠方法。目前研究人员已对囊性纤维化病、地中海 贫 血 、镰 状 细 胞 贫 血 、鸟 氨 酸 氨 甲 酰 转 移 酶 缺 陷 、血 友病 Ｂ、肌强直性营养不良、脆性 Ｘ 综合征、母性脑 水肿、家族性自主神经异常等单基因病进行极体活 检后 ＰＧＤ 的尝试， 并取得不同程度的成功［６， ７］。
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胞第二次减数分裂中的错误， 推断出卵细胞的基因 型。Ｖｅｒｌｉｎｓｋｙ 等［４］最初仅检测第一极体进行单基因 疾病的诊断， 但是由于第一次减数分裂时同源染色 体间交叉重组的存在， 有超过一半以上卵子的第一 极体携带的致病基因是杂合子， 对于这部分卵子其 次级卵母细胞也同时为杂合子， 只检测第一极体不 能作出诊断， 这部分卵子只能被舍弃， 而被舍弃的这 部分卵子中约有一半是正常的， 因此只检测第一极 体会造成可供移植胚胎数目的减少。现一般结合第 一 、二 极 体 活 检 进 行 单 基 因 遗 传 病 的 诊 断， 其 原 理 如下： 对于携带杂合子致病基因的母方， 所产生的第 一极体的基因型有 ３ 种可能性： 纯合子致病基因， 纯 合子正常基因和杂合子。如果第一次减数分裂时没 有交叉重组， 第一极体基因型为纯合子 （ 正常或异 常） ： 如果第一极体基因型为纯合子致病基因， 其相 应的次级卵母细胞及所产生的胚胎都是正常的， 如 果第一极体基因型为纯合子正常基因， 则次级卵母 细胞携带纯合子致病基因， 所产生的胚胎异常， 不 能移植； 在有交叉重组发生的情况下， 第一极体的 基因型为杂合子， 包含一个致病基因和一个正常基 因， 此时必须进行第二极体的检测来进一步判断卵 细胞的基因型， 如果第二极体携带正常基因， 则卵 细胞异常， 如果第二极体携带致病基因， 卵细胞为 正 常［４］。
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综述
优生遗传与生殖医学
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极体分析在植入前遗传学诊断中的应用
中山大学附属第一医院生殖中心（ ５１００８０） 任秀莲综述 庄广伦审校
摘 要 极体活检是植入前遗传学诊断常用的一种取材方法。极体是卵母细胞减数分裂的产物， 含有和卵母细胞 互补的遗传物质， 通过对极体的分析可以间接推测相应卵母细胞的染色体状态。极体活检具有对胚胎的损伤小、在 伦理上易于被接受的特点， 而且极体具有自身特有的生物学属性。可用极体分析进行植入前遗传学诊断的情况包括 女方单基因遗传疾病、染色体结构异常以及非整倍体的 筛 查 等 ， 尤 其 对 母 源 性 遗 传 携 带 患 者 具 有 独 特 优 势 ， 在 植 入 前遗传学诊断中有着不可替代的地位。对近年来极体活检在植入前遗传学诊断中的研究进展做综述。
极体分析诊断染色体结构异常在 ＰＧＤ 中的应用 一、第一极体全染色体涂抹探针分析
染色体异常是不孕不育的重要原因之一， 其中 染色体结构异常占很大一部分。染色体结构异常包 括易位、倒位、染色体内部重组和微缺失等。染色体 易位是最常见的染色体结构异常， 这种异常携带者 一 般 都 没 有 遗 传 物 质 丢 失 （如 相 互 易 位 ）或 是 丢 失 不 多（如罗伯逊易位）， 因而表型正常， 但可将不平衡的 染色体传给子代， 导致流产、死胎、畸形儿或不孕不 育等。据报道， 在表型正常人群中， 染色体平衡易位 患 者 占 ０．１％， 在 不 孕 夫 妇 中 占 ０．６％， 在 有 １０ 次 以 上体外受精（ ＩＶＦ） 周期失败夫妇中达 ３．２％， 在习惯 性流产夫妇中更是高达 ９．２％［８］。这种高生殖危险性 使其成为寻求 ＰＧＤ 的重要人群， 而对于习惯性流产 和不孕不育的易位携带者， ＰＧＤ 已成为其获得正常 妊娠的惟一选择。但由于缺乏方便、快速、准确的方 法， 染色体易位 ＰＧＤ 进展缓慢。
关键词 植入前遗传学诊断 极体 卵母细胞 聚合酶链反应 原位杂交 荧光
植 入 前 遗 传 学 诊 断 （ ｐｒｅｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ， ＰＧＤ） 是 一 种 早 期 的 产 前 诊 断 方 法 ， 为 不 愿接受终止妊娠的遗传病高危夫妇提供了可选择的 手段。自 １９９０ 年， Ｈａｎｄｙｓｉｄｅ 成功地完成了世界上首 例 ＰＧＤ， 现该技术已广泛应用于性连锁遗传疾病、 单基因遗传疾病、染色体数目和结构异常的检测， 还 可用于人类肿瘤易感综合征的易感性分析及一些迟 发性疾病的基因预测以及应用 ＰＧＤ 技术进行人类 白细胞抗原（ｈｕｍａｎ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ， ＨＬＡ）配型。目 前 ＰＧＤ 取材的主要来源有 ３ 个方面： 极体、６￣８ 细 胞期卵裂球及囊胚期滋养层细胞。３ 种取材方法各 有其优缺点及相应的适用范围。
卵裂球活检是目前常用的方法， 这种方法的缺 点是卵裂阶段的胚胎嵌合体发生率很高， 卵裂阶段 单个卵裂球的检测结果并不能代表整个胚胎的状 态， 可能造成漏诊和误诊［１］。而且卵裂球活检由于直 接对胚胎进行操作， 在心理和伦理上很难被一些患 者接受， 在一些国家禁止进行胚胎期的活检。
囊胚是胚胎进行活检的最后阶段， 囊胚期滋养 层细胞可获得充足的样本量， 提高 ＰＧＤ 的准确性； 同时， 活检只取将来发育成胎盘的部分细胞， 从而避 免活检过程对胎儿发育的任何不利影响。但是， 由于 没有理想的体外培养条件， 受精后仅 ２５％￣５０％的胚 胎可发育到囊胚阶段， 从而限制了可供 ＰＧＤ 诊断的 胚胎数目［２］。而且囊胚期活检， 因为胚胎必须在受精 后 ５￣６ｄ 进行移植， 使得诊断时间受到严格的限制。
二、第二极体核转移在 ＰＧＤ 中的应用 由于第一极体的诊断可能有误， 如能结合第二 极体的诊断， 则能大大提高 ＰＧＤ 的准确性。但不同 于第一极体的是， 第二极体在排出时保持了胞质的 染色体去凝集能力， 染色体进入间期， 形成核， 甚至 开始 ＤＮＡ 复制， 为了使第二极体的核转化为分裂中 期 以 能 观 察 第 二 极 体 的 染 色 体 结 构 ， Ｖｅｒｌｉｎｓｋｙ 等［４］ 将第二极体注入去核的成熟卵子中， 用电激活的方 法获得重构的胚胎， 激活 ２４ ｈ 后， 每 ３０ ｍｉｎ 观察一 次， 在第二极体消失后 ４５ ｍｉｎ 进行固定。或者用稀 释的冈田酸（ ＯＡ） 处理获得的重建胚胎， 诱发早熟染 色体凝集（ ＰＣＣ） ， 该方法的有效率为 ７７％～９４％［１０， １１］， 第二极体的诊断可以用全染色体涂抹探针结合 ＣＥＰ 及特殊位点探针。第二极体核转移整个过程大 约需要 ２ ｄ， 适合 ＰＧＤ 临床工作的时间安排， 可以验 证第一极体诊断结果， 提高 ＰＧＤ 诊断准确性。 极体分析筛查非整倍体诊断在 ＰＧＤ 中的应用 研究表明， 早期胚胎中的染色体非整倍体异常 是造成辅助生育技术后低着床率和高流产率的主要 原因， 对女方年龄＞３５ 岁、反复流产、反复种植失败的不 孕夫妇进行胚胎植入前染色体非整倍体诊断可以显 著提高其着床率， 降低自发流产率［１２－１４］。Ｖｅｒｌｉｎｓｋｙ 等［１４］ 总结世界上最大的芝加哥生育遗传学研究所等 ３ 家 ＰＧＤ 中心 １２ 年的资料， 其中一半以上的周期进行的 是非整倍体筛查（ ３７４７／４７４８） ， 在 ＰＧＤ 筛 查 非整倍体 后， 妊娠率可达到 ２３．３％（ 平均年龄＞３９ 岁） ， 明 显 高 于相应年龄组的非 ＰＧＤ 周期（ ＜２０％） 。 目前， 对于非整倍体的筛查主要采取极体活检 和卵裂期胚胎活检两种方法。应用卵裂期胚胎进行 非整倍体筛查最主要的一个受限因素是此期的胚胎 嵌合型比例较高， 在世界各国应用卵裂期胚胎筛查 非整倍体的报道中， 发现至少有 ６０％的胚胎存在染 色体异常， 尽管各研究报道的染色体异常不尽相同， 但是可以肯定的是大约有一半的染色体异常表现为 嵌合型， 报道的的嵌合型比例可高达 ７０％［１５］。 极体筛查非整倍体避免了胚胎期嵌合体的影
对于相互易位的染色体结构异常， 现在多数采 用的是端粒探针和其中一条染色体的着丝粒探针联 合 进 行 荧 光 原 位 杂 交 （ ＦＩＳＨ） 的 方 案［９］， 但 对 处 于 分 裂间期的单个卵裂球， 端粒探针不能区分正常和平 衡易位的胚胎。大多数平衡易位的患者表型正常， 但 部分平衡易位者由于染色体断裂点直接影响到基 因， 或者影响了基因的调控导致某些功能异常， 所以 对于染色体结构异常的患者而言， 选择正常的胚胎 才是 ＰＧＤ 的最终目的。跨断裂点探针筛选跨越或临 近断裂点的克隆， 并标记上不同的颜色， 通过不同颜 色信号的分离和重叠， 可分辨各种染色体结构异常， 包括染色体平衡和非平衡易位、倒位、染色体内部重 组和微缺失等， 但于跨断裂点探针制作周期较长， 费 用较高， 该技术并未广泛应用于临床。对于女性易位 携带者， 还可利用第一极体诊断解决该难题。其理论 基础是取卵后 ６ ｈ 内， 约 ９１％第一极体染色体处于 中期， 用相应的全染色体涂抹探针（ｗｈｏｌｅ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ｐａｉｎｔｉｎｇ ｐｒｏｂｅ， ＷＣＰ）分析易位携带者的第一极体， 可 区 分 不 平 衡 、 平 衡 及 正 常 卵 母 细 胞 。Ｍｕｎｎé等 于 １９９８ 年首次报道将此方法用于 ３ 例 女 性 易 位 携 带 者， 分别移植 ３ 个正常胚胎， ２ 个正常、１ 个平衡胚 胎及 ２ 个平衡胚胎后均获得妊娠， 除第 ３ 例于妊娠 ７ 周自然流产 （流产胚胎经证实确为平衡易位核型） 外， 余 ２ 例均分娩正常婴儿。此后， 该法广泛用于女 性易位携带者， 并进行了改进： 除全染色体涂抹探针 外， 加 １ 个或 ２ 个着丝粒探针（ ｃｅｎｔｒｏｍｅｒｅ ｅｎｕｍｅｒａｔｉｏｎ ｐｒｏｂｅ， ＣＥＰ） ， 以明确染色体中姐妹染色单体的提前 分离， 避免因单价染色体与单个染色单体混淆而造 成误诊； 而且， 因全染色体涂抹探针尚不能准确描述