蚕豆根尖微核测试技术
蚕豆根尖微核检测
蚕豆根尖微核检测一、实验背景和目的本组实验运用蚕豆根尖微核检测技术，分别用不同牌子0.25mg/mL洗发露（欧莱雅、力士、沙宣）对蚕豆根尖做处理，同时以0.25mg/mL的醋酸铅溶液处理蚕豆根尖做阳性对照，自来水作阴性对照。
洗发露是我们生活中的日用品，洗发露主要成分为：界面活性剂，也就洗干净的成分。
以SLS及sls的乙基衍生物类：月桂醇聚醚硫酸酯钠盐、十二酯硫酸铵（月桂酸硫酸酯纳）为主，SLS争议很多，主要表现在对皮肤的刺激性，容易让你头皮变得敏感，虽然SLS也有用在牙膏中，但是在舒适达等国外牙膏中，是没有SLS的存在的，从这一点上，也看出SLS的刺激性是厂商的心知肚明的。
微核（micronucleus, 简称MCN），也叫卫星核，是真核类生物细胞中的一种异常结构，是染色体畸变在间期细胞中的一种表现形式。
微核往往是各种理化因子，如辐射、化学药剂对分裂细胞作用而产生的。
在细胞间期，微核呈圆形或椭圆形，游离于主核之外，大小应在主核1/3以下。
微核的折光率及细胞化学反应性质和主核一样，也具合成DNA的能力。
一般认为微核是由有丝分裂后期丧失着丝粒的染色体断片产生的。
有实验证明，整条染色体或几条染色体也能形成微核。
这些断片或染色体在分裂过程中行动滞后，在分裂末期不能进入主核，便形成了主核之外的核块。
当子细胞进入下一次分裂间期时，它们便浓缩成主核之外的小核，即形成了微核。
已经证实，微核率的大小是和作用因子的剂量或辐射累积效应呈正相关，这一点与染色体畸变的情况一样。
所以许多人认为可用简易的周期微核计数来代替繁杂的中期畸变染色体计数。
由于大量新的化合物的合成，原子能的应用，各种各样工业废物的排出等都存在污染环境的可能性，欲了解这些因素对机体潜在的遗传危害，需要有一套高度灵敏，技术简单易行的测试系统来监测环境的变化。
只有真核类的测试系统更能直接推测诱变物质对人类或其它高等生物的遗传危害，在这方面，微核测试是一种比较理想的方法。
环境污染物的蚕豆根尖微核试验
环境污染物的蚕豆根尖微核试验实验内容随着工农业生产的迅速发展，新的化学物质和工业“三废”不断地进入人们的生活环境，它们中有许多可能对遗传物质产生损害并造成致癌、致畸、致突变等遗传毒理效应的环境致突变物，可对人类健康和生存构成严重危害。
微核试验(Themicro nucleu stest, MN T)是以动植物为材料，采用细胞生物学手段，观测其出现的微核率来表示材料受遗传损伤程度的一种检测遗传毒物的方法。
微核是无着丝点的染色体断片，在有丝分裂后期不能向两极移动，所以游离于细胞质中，在间期细胞核形成时，即可在它附近看到一到几个很小的圆形结构，直径大约是细胞直径的 1 ／20 － 1 ／ 5 ，这就是微核（micronucleus ）。
微核是常用的遗传毒理学指标之一，指示染色体或纺锤体的损伤。
由于这种损伤会因细胞受到的外界诱变因子的作用而加剧，而微核产生的数量又可与诱变因子剂量的强弱呈正比，因此可以用微核出现的频率来评价环境诱变因子对生物遗传物质的损伤程度。
蚕豆(Vicia faba)是一种理想的细胞遗传学研究材料。
蚕豆的染色体大，数量少(2n=12),根尖中含有较多的分裂相细胞，非常适合显微观察，而且蚕豆根尖细胞周期中的大部分时间对诱变剂敏感，便于遗传毒性检测实验，因此，早在1959年，放射生物学家已经用蚕豆的根尖细胞来进行X射线的遗传损伤研究。
到了上世纪70年代，蚕豆根尖染色体畸变技术已发展得相当成熟，作为一种检测化学品遗传学毒性的方法为人们所知并被广泛采用。
蚕豆根尖微核试验在1986 年已被中国环保局列为一种环境生物测试的规范方法，它作为一种环境变异的检测手段，在我国不少地区的环保部门和医疗卫生系统中都有广泛的应用。
蚕豆根尖微核试验在对水体污染物、空气污染物、农药、重金属、化妆品、工业化学品等的致突变性检测方面，都得到了较广泛的应用，在此仅以农药污染的蚕豆微核实验为例介绍其相应的实验方法与步骤，学生在具体开展相关环境污染物的蚕豆根尖微核试验时可参考使用。
蚕豆根尖微核监测法
12.2.5 组装前的注意事项
取出豆种，用调温水浸洗 3 次，每次 5 min，
按照规定的条件恢复培养24 h。
处理6h
处理过程中，根尖如出现相关的急性毒性症
状，则按要求增加试样急性毒性预试验；否 则，直接进行后续试验。
实验步骤
4.根尖固定
用卡诺氏液固定
切取顶端 l.0 cm 左右根尖置于具盖指管内（同一试样处理 的根尖放入一个指管），加卡诺氏液固定 2 h。固定时间 最长不超过 24 h。
8．插拔时不要抓住线缆拔插头，以免损伤线缆。
12.2.6 台式计算机组装基本步骤
1．主机的安装 （1）准备好机箱并安装电源，主要包括打开空机箱和安装电源； （2）驱动器的安装，包括硬盘、光驱的安装； （3）CPU和散热器的安装，在主板处理器插座上安装CPU及散 热风扇； （4）内存条的安装，将内存条插入主板内存插槽内； （5）主板的安装，将主板固定在机箱内； （6）显卡的安装，根据显卡接口类型将显卡安装在主板上合适 的扩展槽内； （7）声卡等的安装，根据声卡的总线类型选择合适的扩展槽将 它们安装在主板上； （8）机箱与主板间连线的连接，是指各种指示灯、电源开关线、 PC喇叭等面板插针的连接，以及硬盘、光驱。
用乙醇保存
如不能及时染色制片，则弃去卡诺氏液，用实验用水洗净， 加入乙醇溶液浸没，于冰箱内冷藏，72h内染色镜检。
33
浸洗根尖
3--蚕豆根尖微核实验
蚕豆根尖微核实验（诱导与检测部分）一、实验目的1、了解环境诱变物对微核产生的原理。
2、掌握微核试验技术。
3、了解毒理遗传学在环境监测中的应用及意义二、实验原理微核是无着丝点的染色体断片，在有丝分裂后期由于不能向两极移动而游离于细胞质中，在间期细胞核形成时，可在它附近看到若干个圆形的结构，直径大约是细胞直径的1/20到1/5，这就是微核。
微核简称(MCN)，是真核生物细胞中的一种异常结构，往往是细胞经辐射或化学药物的作用而产生。
在细胞间期微核呈圆形或椭圆形，游离于主核之外、大小应在主核1/3以下。
微核的折光率及细胞化学反应性质和主核一样。
一般认为微核是由有丝分裂后期丧失着丝粒的断片产生的，但有些实验也证明整条的染色体或多条染色体也能形成微核。
这些断片或染色体在细胞分裂末期被两个子细胞核所排斥便形成了第三个核块。
已经证实微核率的大小是和用药的剂量或辐射累积效应呈正相关，这一点和染色体畸变的情况一样。
所以可用简易的间期微核计数来代替繁杂的中期畸变染色体计数。
由于大量新的化合物的合成，原子能应用，各种各样工业废物的排出，使人们需要有一套高度灵敏、技术简单的测试系统来监视环境的变化。
只有真核的测试系统更能直接推测诱变物质对人类或其它高等生物的遗传危害，在这方面，微核测试是一种比较理想的方法。
且有研究显示以植物进行微核测试与以动物进行的一致率可达99%以上。
目前微核测试已经广泛应用于辐射损伤、辐射防护、化学诱变剂、新药试验、染色体遗传疾病及癌症前期诊断等各方面。
利用蚕豆根尖作为实验材料进行微核测试，可准确的显示各种处理诱发畸变的效果，并可用于污染程度的监测。
微核产生的概率可与诱变因子的剂量成正比，因此可以用微核出现的频率来评价环境诱变因子对生物遗传物质的损伤程度。
三、实验器具、药品1、实验材料蚕豆种子2、实验器材光学显微镜、试管（10ml）、蚕豆发芽盒、镊子、手术刀、载玻片、盖玻片、滤纸等。
3、试剂1）NaN3(叠氮钠)2）卡诺氏固定液（乙醇和冰醋酸按照体积比3：1混合配制）4）6mol/L盐酸：配制：取49.5ml 37.5%的盐酸，再加入50.5ml水稀释至100ml容量瓶.四、实验步骤1、种子处理：蚕豆种子洗涤干净，室温（25℃）下用蒸馏水浸泡发芽24小时，此间至少换水两次，所换水应预温至25℃。
蚕豆根尖细胞微核实验报告
利用蚕豆根细胞微核技术检测洗发水的毒性09生物技术宁伟王晓刚太红桥刘经源摘要微核（micronucleus,MCN）是真核生物细胞经各种理化因子作用后引起染色体畸变，在间期细胞中的一种表现形式。
在细胞间期，微核呈圆形或椭圆形，游离于主核之外，大小应在主核1/3～1/20，染色与主核一样或稍浅。
一般认为微核是由无着丝粒的染色体断片或落后染色体，在分裂末期不能进入主核，便形成了主核之外的核块。
当子细胞进入下一次分裂间期时，它们便浓缩成主核之外的小核，即微核。
[1]蚕豆根尖细胞微核试验(Micronucleustest,MC-NT)技术是一种以染色体断裂及纺锤丝损伤为测试终点的植物微核检测方法。
它是一种应用于监测环境致突变物对人体和其他生物体的遗传物质产生危害的技术,并从细胞遗传学水平上探讨植物遗传物质的改变状况与环境污染，也可以检测淡水环境的质量。
[2]关键词蚕豆根尖微核洗发水千分率蚕豆是一种很好的细胞遗传学研究材料。
它的染色体为六对相当大的染色体，而且根尖含有较多的分裂相细胞，非常适合显微观察。
目前，蚕豆根尖微核技术在环境致突变性检测/监测方面已经形成了一套完整的体系。
它的可靠性和灵敏性较高，且本底较低，这对于一种致突变性检测方法是十分重要的。
此外，它的检测物谱较广。
目前多数学者认为，在镜检细胞微核时，应按下列标准计数微核：（1）凡主核大小1/3以下，与主核分离的小核；（2）小核的着色与主核相当或稍浅；（3）小核形态可为圆形，不规则等。
[3]1. 实验目的掌握蚕豆根尖细胞微核检测技术的一般方法。
并利用蚕豆根尖细胞微核检测技术对洗发水的毒性状况给出客观的评价，同时表明蚕豆根尖细胞MCN对胁迫很敏感，蚕豆根尖微核技术可用于洗漱用品的安全监测。
2. 材料与方法2.1实验材料蚕豆种子、洗发水、显微镜、镊子、培养皿、剪刀、载玻片、盖玻片、烧杯、Carnoys固定液、盐酸酒精解离液、改良苯酚品红染液、NaN3等。
诱变物质的微核检测技术—蚕豆根尖微核检测与应用
v 更多问题……
五、 实验流程——准备工作 ——
v 每个自然班分成4个组
§ §
人数基本相同、确定每小组的组长 确定试验目的、各小组所用的处理因素(阴性 对照、阳性对照、两种污水处理) 上报分组名单(组长)、试验目的、因素 实验开始前提交试验方案(班内协调、统一时 间安排)
§ §Leabharlann 实验工作时间安排参考§
若干种待测诱导物(如不同来源的污水)，由各 组同学采集 阳性对照(NaN3)：已证明可诱导微核形成 阴性对照(洁浄水样)：微核形成率接近于0
§ §
五、 实验流程
准备工作 § 查阅文献 § 确定研究目的 • 如：待测物、蚕豆品种差异等 § 制订试验方案 v 蚕豆发根、取材 v 处理与恢复培养 v 取材制片、镜检观测 v 结果分析、撰写报告(论文)
诱变物质的微核检测技术 诱变物质的微核检测技术
——蚕豆根尖微核检测与应用 —— 蚕豆根尖微核检测与应用 (综合型实验) (
四川农业大学 普通遗传学课程组
提 纲 纲
1. 实验目的 2. 实验原理 3. 实验材料 4. 用具与药品 5. 实验流程
一、 实验目的
v v v
了解诱变物质微核检测技术原理与应用 掌握蚕豆根尖微核检测技术 了解研究性试验开展的基本环节
§ §
实验教学角度：综合性实验 实验内容角度：研究性试验(非验证性实验)
二、 实验原理
u u u
微核的概念与形成 微核检测技术 微核检测的应用
（一）微核的概念与形成
v
微核(micronuclei, MN/MCN)
天数 工作内容 方案、材料与待测物准备 1 2 3 5 6 7 8+ 浸种(其间换水两次) 第一阶段催芽 第二阶段催芽(其间检查水分) 诱导处理 恢复培养 根尖取材、固定 解离、制片观察 结果分析与报告写作 24h 12~24h 36~48h 12~24h 22~24h 24h 2~4h 大致时间 注意 班、组 自然班 组 组 组 组 组 组 组
蚕豆根尖微核检测技术
五、实验方法
1．实验材料的培育 蚕豆根尖细胞的染色体大,DNA含量高,因而对诱
变因子反应敏感,种子成熟后,晒干贮藏于干燥器内或 4℃冰箱内备用,
2．浸种催芽：
将实验用蚕豆种子按需要量放入盛有蒸馏水的烧杯 中,在25℃下浸泡24小时,种子吸胀后,用纱布松散包裹 置白磁盘中,保持湿度,在25℃恒温箱中催芽12-24小时, 待初生根长出2-3mm时,再取发芽良好的种子,放入铺满 滤纸的磁盘中,25℃继续催芽,经约36-48小时,大部分初 生根长至1-2cm左右,根毛发育良好,这时即可用来进行 检测了,
3．处理
每一处理选取6-8粒初生根生长良好、根长一致的 种子,放入盛有待测物溶液的培养皿中,浸没根尖,用自 来水作对照处理,处理根尖6～24h 处理时间可视实验 需要和被测液浓度而定 ,
4．根尖细胞恢复培养
将处理后的种子用蒸馏水浸洗三次,每次2-3min,将 洗净的种子再放入铺好滤纸或脱脂棉的白磁盘内,25℃ 温箱中恢复培养22-24小时,
9．镜检及微核识别标准
首先在低倍镜下找到分生组织区细胞分散均匀,分裂 相较多的部位,再转高倍镜观察, 微核识别标准： 1 在主核大小的1/3以下,并与主核分离的小核, 2 小核着色与主核相当或稍浅, 3 小核形态为圆形、椭圆形或不规则型,
观察3个根尖,每个根尖计数100个细胞中的微核数并 进行记录,
➢由于大量新的化合物的合成,原子能应用,各种各样工 业废物的排出,使人们需要有一套高度灵敏、技术简单 的测试系统来监视环境的变化,
➢只有真核的测试系统更能直接推测诱变物质对人类 或其它高等生物的遗传危害,在这方面,微核测试是一 种比较理想的方法,
蚕豆细胞微核检测亚硝酸盐的遗传毒性
一、实验目的1．了解微核测试的原理和毒理遗传学在实际生活与工作中的应用范围及意义2．学习蚕豆根尖的微核测试技术二、实验原理微核（micronucleus, 简称MCN），也叫卫星核，是真核类生物细胞中的一种异常结构，是染色体畸变在间期细胞中的一种表现形式。
微核往往是各种理化因子，如辐射、化学药剂对分裂细胞作用而产生的。
在细胞间期，微核呈圆形或椭圆形，游离于主核之外，大小应在主核1/3以下。
微核的折光率及细胞化学反应性质和主核一样，也具合成DNA的能力。
一般认为微核是由有丝分裂后期丧失着丝粒的染色体断片产生的。
有实验证明，整条染色体或几条染色体也能形成微核。
这些断片或染色体在分裂过程中行动滞后，在分裂末期不能进入主核，便形成了主核之外的核块。
当子细胞进入下一次分裂间期时，它们便浓缩成主核之外的小核，即形成了微核。
已经证实，微核率的大小是和作用因子的剂量或辐射累积效应呈正相关，这一点与染色体畸变的情况一样。
蚕豆根尖微(micronucleus，MCN)技术是一种检测化学品对生物毒害的遗传毒理学方法。
不仅具有简便、快速、重复性好和灵敏度高的优势，而且其检测结果与动物试验结果具有很高的一致性。
亚硝酸盐广泛存在于自然环境(水体、土壤、植物)中，许多腌制食品中亦含有亚硝酸盐。
在胃酸等环境下亚硝酸盐与食物中的仲胺、叔胺和酰胺或蛋白质分解产物等反应生成强致癌物N_亚硝胺。
亚硝胺还能够透过胎盘进入胎儿体内，对胎儿有致畸作用。
硝酸盐和亚硝酸盐作为化学物质的毒害性多有研究，但把蚕豆根尖细胞微核技术用于食品添加剂的安全评价和检测其对生物体诱变效应的遗传毒理性试验却未见报道。
NaNO2对蚕豆根尖的微核效应，由此证明蚕豆可以作为快速、灵敏检测食品中亚硝酸盐遗传毒性的供试材料。
三、实验材料蚕豆种子、显微镜、载玻片、盖玻片、培养皿、滤纸、蒸馏水NaNO2卡纳氏固定液（3甲醇：1冰醋酸）改良苯酚品红溶液四、实验过程1、被测试剂的配制与分组配制成0．01、0．02、0．04、0．08 mmol/L 4种不同的浓度；用蒸馏水将NaN02另设蒸馏水做对照(CK)组。
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7 镜检及微核识别 找到分生组织区细胞分散均匀、膨大、分裂相对多的部位， 再转到高倍镜（物镜40X）下进行观察 微核的识别标准 （1）凡是主核大小的1/3以下，并与主核分离的小核。 （2）小核着色与主核相当或稍浅。 （3）小核形态可以是圆形、椭圆形、不规则形。 每一处理观察5个根尖，每个根尖观察1000个细胞，并计数 其中有微核的细胞数（微核千分率）
蚕豆根尖微核测试技术
实验原理
蚕豆根尖细胞在分裂时染色体的复制过程中常 发生断裂，断裂下来的片段在正常情况下能自行 复位愈合，如果此时受到外界诱变因子的作用， 会阻碍染色体的愈合，于是会出现微核，由于产 生的微核数量与外界诱变因子的强弱成正比，所 以可用微核出现的百分率来评价环境诱变因子对 生物遗传物质影响的程度。
4 “污染指数”判别：此方法可避免因实验条件等因 素带来的微核千分率本底的波动，故较宜适用。 污染指数=样品实测微核千分率平均值/对照组微 核千分率平均值 0-1.5 基本没有污染 1.5-2.0 轻污染 2-3.5中污染 3.5以上重污染
பைடு நூலகம்
结果分析与报告
1 各测试样品微核千分率的计算 2 如果被检测样品不多，可直接用各样品微核千分率平 均值与对照组比较（t检验），从差异的显著性判断 水质污染与否。 3 如果监测的样品较多，可先用方差分析（F检验）看 各采样点所测的微核千分率平均值和对照的差异显 著性。如差异显著，还可进行各采样点微核差异显 著性的多重比较，看被检样品微核千分率平均值差 异显著性的分组情况，以归纳划分这些不同采样点 不同级别的污染程度。
3 根尖细胞恢复培养 处理后的种子用自来水（或蒸馏水）浸洗三次，每次2～3分 钟。洗净后再置入辅有湿脱脂棉中，25℃下再恢复培养 22～24h。 4 固定 将恢复后的种子，从根尖顶端切下1cm长的幼根，用卡诺 氏固定液固定24小时。固定后的根如不及时制片，可换入 70%的乙醇溶液中置4℃冰箱中保存备用。 5 解离：用蒸馏水浸洗固定好的幼根两次，每次5分钟，吸 净蒸馏水，加入5mol/L盐酸将幼根浸没，室温下酸解10分 钟，幼根软化即可。 6染色 吸去盐酸，用蒸馏水浸洗幼根三次，每次1～2分钟。截下 1～2mm左右长的根尖，滴加席夫氏试剂（在生物实验可 以和经过酸化的DNA 发生反应，DNA 被染成紫红色，而 不和核仁，细胞质发生反应，因此可以来鉴定DNA的存 在。），染色5～8分钟，加盖玻片，压片观察
操作步骤
1 浸种催芽 将实验用蚕豆按需要量放入盛水烧杯中，在25℃下浸泡24 小时，此间至少换水两次，所换水应25℃预温。种子吸胀 后，用纱布松散包裹置瓷盘中，保持温度，在25℃温箱中 催芽12～24小时，待初生根长出2～3mm时，再取发芽良 好的种子，放入铺满滤纸的瓷盘中，25℃继续催芽，经约 36-48小时，大部分初生根长至1～2cm左右，根毛育良好， 此时可用来进行实验。 2 蚕豆根尖染毒 选取初生根生长良好，根长一致的6-8粒种子，放入盛有 被测液的培养皿中，被测液浸没根尖即可，一般染毒6-8h， 另设自来水对照组