负染色法负染色法negativestaining的染色处理过程主要并非针对菌
负染色操作步骤-概述说明以及解释
负染色操作步骤-概述说明以及解释1. 引言概述部分的内容可以按如下方式编写：1.1 概述负染色是一种常用的细胞和组织样品处理技术，它常被应用于生物学和医学研究中，用于观察细胞和组织内部的结构和特征。
相比于传统的正染色方法，负染色操作具有一些独特的优势和特点。
在负染色过程中，样本被浸泡在一种特定的染料溶液中，这种染料溶液往往是一种与样品的成分不相溶的物质。
负染色的关键在于利用染料的物理和化学性质，使其与样品发生作用，从而使样品的细节和特征得以显示。
负染色的操作步骤相对简单，但需要一定的技巧和经验。
本文将详细介绍负染色的操作步骤要点，旨在帮助读者快速掌握负染色技术并正确应用于实验中。
负染色的具体步骤将在接下来的章节中进行介绍，主要包括：样品制备、染料选择、染色操作、观察和分析等环节。
通过正确的操作步骤，可以获得清晰、可靠的负染色结果，从而进一步推进相关研究领域的发展。
总之，负染色作为一种常用的细胞和组织样品处理技术，具有独特的优势和特点。
本文将深入介绍负染色的操作步骤要点，希望能够为读者提供一份实用的参考，帮助其在实验中正确应用负染色技术。
文章结构部分的内容应该是关于整篇文章的组织结构和章节安排的介绍。
可以按照以下方式编写：文章结构：本文将按照以下结构进行叙述：1. 引言1.1 概述1.2 文章结构1.3 目的2. 正文2.1 负染色操作步骤要点12.2 负染色操作步骤要点23. 结论3.1 总结3.2 展望在引言部分，我们将简要说明本文的主题和目的，以及为什么负染色操作步骤的了解对于某些特定应用领域的重要性。
接下来的正文部分将分为两个要点，分别介绍负染色操作的具体步骤，包括所需材料、实验条件等重要信息。
通过对每个步骤要点的详细描述，读者将能够理解负染色操作的基本原理和实施方法。
最后，在结论部分，我们将对整篇文章进行总结，回顾负染色操作的关键步骤和要点，并展望未来在该领域的进一步研究和应用方向。
通过以上的文章结构安排，读者将能够清晰地了解整篇文章的内容组织和章节间的逻辑关系，从而更好地理解和掌握负染色操作步骤的相关知识。
Negative staining 阴性(负)染色法
• 實驗注意事項
– 進行細菌的染色時，樣本於玻片上之塗抹務求 均勻，以免影響染色的效果。 – 進行陰性染色法時，染色前皆必須先確定玻片 樣本呈現乾燥之狀態方可進行染色，否則易影 響實驗之最終結果。 – 進行陰性染色法時，染劑固定步驟不宜以熱固 定的方式進行，需以自然風乾的方法操作。
• 實驗結果
– 請畫出以陰性染色法觀察之菌體。
• 材料與儀器
– Bacteria
• 大腸桿菌(Escherichia coli) • 金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) • 枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)
– Staining agent
• Nigrosine
– An acidic stain which can not be stained onto bacterial cell membrane which contain negative-charged particles.
• 染色：將製備完成之玻片樣本置於染色架上，加上一 滴染劑，在加上一滴水，以接種環於塗抹菌體於染色 液中，靜置約3~5分鐘，使菌體上色。 • 可用另一張載玻片，輕放在染液上，將其染液拉開。 • 於無菌操作台內風乾。
• 乾燥：將玻片上多餘的水分輕輕甩乾，並利用濾紙將 其吸乾，接著置於無菌操作台內使其自然風乾（此時 不進行火烤加熱風乾，而以自然風乾為主）後備用。 • 鏡檢：先以低倍數光學顯微鏡找出菌體，然後再逐步 換成高倍數接物鏡最終以油鏡進行菌體的觀察並繪圖 記錄之。
• 討論
– 比較不同菌種間的異同處
– 設備儀器及其他用具
• • • • • • • • • 光學顯微鏡 酒精燈 載玻片 接種環 蒸餾水 染色架 濾紙 75%酒精 乳頭滴管
海南大学生物工程学院2021年《细胞生物学》考试试卷(1474)
海南大学生物工程学院2021年《细胞生物学》课程试卷（含答案）__________学年第___学期考试类型：（闭卷）考试考试时间：90 分钟年级专业_____________学号_____________ 姓名_____________1、判断题（40分，每题5分）1. 通常情况下，体外培养的成纤维细胞的增殖能力与供体年龄有关。
（）答案：正确解析：如从胎儿肺得到的成纤维细胞可在体外条件下传代50次，而从成人肺得到的成纤维细胞只能传代20次。
2. 对绝大多数细胞而言，在特定阶段90以上基因具有转录活性，少部分基因没有活性。
（）答案：错误解析：对绝大多数蛋白质而言，在特定阶段仅10以下基因具有转录活性，90以上基因没有转录活性。
3. 蛋白糖基化时由糖基转移酶将糖基直接转移到肽链上。
（）答案：错误解析：蛋白质糖基化是一个复杂的过程，在糖基化的过程中先形成寡糖链直链的前体，再经间隔的过程形成成熟的糖蛋白。
4. 引起细胞转型的RNA肿瘤病毒其复制过程与DNA病毒及RNA病毒基本一致，没有根本的区别。
（）答案：错误解析：引起细胞转型的RNA肿瘤病毒其复制过程与DNA病毒及RNA病毒有根本不同。
当病毒进入细胞，壳体裂解与释放RNA后，首先以病毒RNA分子为模板，在反转录酶的催化作用下所，反转录出病毒的DNA分子，这种病毒DNA能与宿主蛋白质染色体的DNA链整合，又以整合在细胞DNA上的病毒DNA为模板，转录新的病毒RNA与病毒mRNA，后者与核糖体结合，翻译出各种病毒蛋白，其中包括病毒的结构蛋白与导致宿主转型的蛋白。
5. 网格蛋白有被小泡与溶酶体融合，其包被最后在溶酶体被水解。
（）答案：错误解析：网格蛋白有被小泡在出芽后，网格蛋白包被脱落，并不进入溶酶体。
6. 经冷冻蚀刻技术处理后的样品，在电子显微镜下所观察到的图像是样品本身所形成的。
（）答案：错误解析：在进行碳喷镀后，样品本身被消化液稀释，电镜所的是剩下的碳膜及其构成图形的金属颗粒，所得到的图像并非有样品本身直接形成。
负染色技术
负染色技术负染色又称阴性染色，是相对于普通染色（称正染色）而言的。
负染色首先由Hall在1955年提出。
Hall在病毒研究中用磷鸭酸染色后，发现图像的背景很暗，而病毒象一个亮晶的”空洞”被清楚地显示出来。
在超薄切片的染色中，染色后的样品电子密度因染色而被加强，在图像中呈现黑色。
而背景因未被染色而呈光亮，这种染色称为正染色。
而负染色则相反，由于染液中某些电子密度高的物质（如重金属盐等）”包埋”低电子密度的样品，结果在图像中背景是照暗的，而样品像”透明”地光亮。
两者之间的反差正好相反，故称为负染色。
对于负染色的机制目前还不十分了解。
对颗粒状的生物材料的研究而言，负染色技术与超薄切片方法相比具有分辨率高（可达15A）,简单快速等优点。
因此，在生物学研究中得到越来越广泛的应用。
它可以显示生物大分子、细菌、病毒、分离的细胞器以及蛋白质晶体等样品的形状、结构、人小以及表面结构的特征。
尤其在病毒学中，负染色技术成为不可取代的实验技术。
［编辑］负染色液的制备用作负染色的负染色剂应具有：较强的电子散射能力以产生足够的图像反差；熔点高，在电子束的轰击下不会升华；溶解度大，不易析出沉淀；在电镜下不呈现出可观察到的结构；分子小，容易滲入不规则表面的凹陷处；与样品不起化学反应等。
目前最常用的负染液是磷钩酸、磷钩酸钾和磷餌酸钠（分别简称为PTA、KPT、NaPT）o此外醋酸铀、甲酸铀、硅鹄酸、铝酸钱等也常作负染色剂用。
它们的配制方法如下：磷钩酸、磷鹄酸钠、磷钩酸钾溶液通常用双蒸水或磷酸缓冲液配制成1%〜3%的溶液，使用时应用1 mol / L氢氧化钠溶液将负染色液的pH值调至6.4〜7.0或实验所需的值。
醋酸铀：通常使用双蒸水配制成0.2%〜0.5%水溶液（pH4.5）o醋酸铀染色液应是新鲜的，最好使用前配制。
醋酸铀溶解需15〜30分钟，在黑暗中能稳定几小时，使用前用1 mol / L的氢氧化钠溶液将pH值调至4.5。
甲酸铀：用双蒸水配制成0.5%〜1%水溶液，pH值为3.5,使用时用lmol/L的氢氧化钠溶液将pH 值调至4.5〜5.2。
电镜样品的基本制备技术之负染色技术
（二）直接取样法
对于某些皮肤病毒性疱疹（如天花、 水痘及疱疹等）可用毛细吸管直接刺入疱 疹中取样，再将吸管中的泡液滴在带有支 持膜的铜网上，待稍干后立即染色观察。 此法主要用于临床快速诊断．
对于生长在固体培养基上的微生物， 可用白金环刮取，再用缓冲生理盐水稀释 成悬液，即可滴样，待稍干后染色观察。 对于生长在琼脂板上的噬菌体斑，也可采 用直接取样法。
负染色又称阴性反差染色，它是利用 高密度的、且在透射电镜下又显示结构的 重金属盐（如磷钨酸、醋酸铀等），把生 物标本包围起来、在黑暗的背景上显示出 呈现阴性反差样品的微细结构。所以负染 色所显示的电镜图像，正好与超薄切片正 染色相反，其样品结构为透明浅色，而背 底则为无结构的灰色或黑色。对于负染色 的机制，目前还不够清楚。
负染色技术首先，由Ha11（1955）、 Hux1ey（1957）等人所采用，在后来的生 物学研究中得到了越来越广泛的应用。负 染色样品不需经过固定、脱水、包埋和超 薄切片等复杂操作，而是直接对沉降的样 品匀浆悬浮液进行染色。与超薄切片技术 相比，该技术具有操作简便、用药量极少、 省时快速及分辨力高等优点，现广泛用于 细菌、病毒、大分子结构、亚细胞碎片及 分离的细胞器等研究工作。
2．低渗释放法 从培养瓶中刮下所 培养的腺病毒或疱疹病毒，低速离心，弁 上清液，于沉淀物中加入培养液与蒸馏水 的混合液（比例为1：4），使细胞因低渗 破裂而释放出病毒，然后快速冻融数次， 再将冻融后的悬液低速离心，取其上清液 滴膜染色。
3．抗体 病毒凝集沉淀法 某些病毒 如鼻病毒、风疹病毒、小儿腹泻轮状病毒 及甲、乙型肝炎抗原等，可于相应的抗体 形成病ห้องสมุดไป่ตู้一抗体复合物，经离心沉淀而浓 缩，而后取浓缩的沉淀物滴膜染色，可找 到较多的病毒。目前这一技术已广泛用于 病毒疾病的快速诊断。
负染色技术1
异常反差原理： 异常反差原理：
用PTA 对氧化鎂晶体染色时，发现氧化鎂晶体发生 对氧化鎂晶体染色时，发现氧化鎂 了异常反差。在电镜下观察时发现， 了异常反差。在电镜下观察时发现，在同一视野内凡 包绕着的氧化鎂晶体全部变为透明（白色） 是被 PTA 包绕着的氧化鎂晶体全部变为透明（白色） 的晶体， 染色的氧化鎂 的晶体，未被 PTA 染色的氧化鎂晶体则呈现不透明 暗黑色）晶体。这种异常反差可能是因PTA PTA在电 的（暗黑色）晶体。这种异常反差可能是因PTA在电 子束照射下，负荷电子在标本周围形成了静电场， 子束照射下，负荷电子在标本周围形成了静电场，它 起到一个“静电小透镜”的作用， 起到一个“静电小透镜”的作用，把电子聚焦于样品 使样品中的电流密度得到加强， 上，使样品中的电流密度得到加强，结果样品图象的 亮度加强，使不透明的氧化鎂晶体变成透明了。 亮度加强，使不透明的氧化鎂晶体变成透明了。
(五).注意的问题 五 注意的问题
1).悬液样品的纯度 悬液样品的纯度 2).悬液样品的浓度 悬液样品的浓度 3).样品和染液的均匀分布问题 样品和染液的均匀分布问题 • 使用分散剂 • 亲水性处理 4).样品悬液和染色液的酸碱度问题 样品悬液和染色液的酸碱度问题 5).染色的时机 染色的时机
负染色剂及其适用的PH范围
负染色剂 磷钨酸钾 醋酸铀 甲酸铀 钼酸铵 钨酸锂 硼酸钨钠 浓度 % 2 0.1~1 0.5~1 2.0~3 2 2 PH范围 PH范围 6.0—7.0 4.0—5.2 4.0—5.2 7.0—7.4 6.0—7.5 5.5—7.0 醋酸氨 醋酸氨
样品缓冲液
醋酸氨
•
负染色可观察样品的范围：um~nm 负染色可观察样品的范围 球状 7 nm 链状 直径 2 nm
海南大学生物工程学院2021年《细胞生物学》考试试卷(255)
海南大学生物工程学院2021年《细胞生物学》课程试卷（含答案）__________学年第___学期考试类型：（闭卷）考试考试时间：90 分钟年级专业_____________学号_____________ 姓名_____________1、判断题（40分，每题5分）1. 细胞中所有的微丝均为动态结构。
（）答案：错误解析：体内有些微丝并不是动态的微观结构，而是永久性的结构中，如肌肉中的细丝及肠上皮细胞微绒毛中的卢戈韦。
2. 各种正常细胞的体积大小不同，但它们细胞核的大小通常差距不大。
（）答案：正确解析：3. 在细胞水平上进行的任何遗传操作，通过细胞培养和植株再生，最终可以将细胞的遗传修饰变成植物的遗传修饰，从而改变整个植物的遗传特性。
（）答案：错误解析：植物细胞具有细胞全能性。
4. 细胞周期蛋白及其磷酸化状态两者决定一个Cdk蛋白是否具有酶活性。
（）答案：正确解析：5. 水是细胞的主要成分，并且多以结合水的形式存在于细胞中。
（）答案：错误解析：细胞中的水分多以游离态存在。
6. 激素受体都具有酪氨酸受体结构域。
（）答案：错误解析：激素受体都具有各自激素的特异结构域。
7. 从细胞生物学的角度看，肿瘤发生的原因是细胞分裂过快。
（）答案：错误解析：是分裂失控，即细胞周期失去控制。
8. 当有动作电位刺激时，轴突的膜电位瞬时变得负值增加。
（）答案：错误解析：动作电位将引发去极化发生去极化（即负值减低向正值转化），并发生电位反转。
2、名词解释（40分，每题5分）1. 微管踏车行为答案：微管踏车行为是指微管组装后处于动态平衡的一种现象。
微管装配动态数学模型认为，微管两端具有GTP帽，微管将继续装配，反之，具GDP帽则解聚。
通常微管持有β微管蛋白的正极（＋）端组装较快，而持有α微管蛋白的负极（－）端组装较慢。
在一定条件下，微管一端出现装配延期使微管延长，而另一端则去喷涂而使微管缩短，但总体仍然继续保持原长，这种现象称为踏车行为或踏车现象。
微生物真题名词解释整理汇总
微生物考研名词解释汇总【20XX年】1.纯培养物（pure culture）：由一种微生物组成的细胞群体，通常是由一个单细胞生长、繁殖所形成。
【2章微生物的纯培养和显微技术】2.负染色（negative staining）：染料使背景颜色加深而样品没有着色的染色法。
【2章微生物的纯培养和显微技术】（2013、2007）3.糖被(glycocalyx)：指包被于某些细菌细胞壁外的一层厚度不定的胶状物质。
糖被有数种：1.形态固定、层次厚的为荚膜。
2.形态固定、层次薄的为微荚膜。
3.形态不固定、结构松散的为粘液层。
4.包裹在细胞群体上有一定形态的糖被称为菌胶团。
糖被的主要功能是保护菌体免受干旱损伤或宿主免疫活性细胞的吞噬。
荚膜的功能：1、保护作用2、贮藏养料3、保护屏障4、表面附着5、信息识别6、堆积代谢物【3章微生物细胞的结构域功能】4.PHB（poly-β-hydroxybutyrate，聚β-羟丁酸）:PHR是存在于许多细菌细胞质内属于类脂性质的碳源类贮藏物。
具有贮藏能量、碳源和降低细胞内渗透压的作用。
是细菌独有的可作为医用材料。
【3章微生物细胞的结构域功能】5.原养型微生物（prototroph）：与自然发生的同种其他个体一样，具有相同营养需求的微生物。
【4章微生物的营养】6.基因转位（group translocation）：物质通过载体帮助，在一个较复杂的运输系统的作用下进行的跨膜主动运输，被运输物质在该过程中化学性质发生改变。
【4章微生物的营养】（2013、2011、2009）7.对数生长期(logarithmic phase)：微生物经过延滞期后，以最大的速度进行生长和分裂至微生物数量呈对数增加的时期。
在对数生长期微生物各成分按比例有规律增加，微生物呈平衡生长。
（也称指数生长期或指数期。
）【6章微生物的生长繁殖及其控制】（2013、2010）8.同步培养（synchronous culture）：使群体中不同步的细胞转变成能同时进行生长或分裂的群体细胞的培养方法称为同步培养。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
2.湿墨水法
（1）制菌液：加1滴墨水于洁净的载玻片上，挑少量菌体与其充分混合均匀。
（2）加盖玻片 放一清洁盖玻片于混合液上，然后在盖玻片上放一张滤纸，向下轻压，吸去多余的菌液。
（3）镜检：先用低倍镜、再用高倍镜观察。
结果：背景灰色，菌体较暗，在其周围呈现一明亮的透明圈即为荚膜。
结果：背景蓝紫色，菌体紫色，荚膜无色或浅紫色。
（五）实验作业：
绘出Bacillusmucilaginosus的形态图，并注明各部位的名称
（六）注意事项
1.加盖玻片时不可有气泡，否则会影响观察。
2.应用干墨水法时，涂片要放在火焰较高处并用文火干燥，不可使玻片发热。
3.在采用Tyler法染色时，标本经染色后不可用水洗，必须用20%CuSO4冲洗。
以油镜观察之。
（一）实验目的：学习细菌的荚膜染色法：
（二）实验原理：由于荚膜与染料间的亲和力弱，不易着色，通常采用负染色法染荚膜，即设法使菌体和背景着色而荚膜不着色，从而使荚膜在菌体周围呈一透明圈。由于荚膜的含水量在90%以上，故染色时一般不加热固定，以免荚膜皱缩变形。
（三）实验器材
1.活材料：培养3-5天的胶质芽胞杆菌（Bacillusmucilaginosus，俗称“钾细菌”）。该菌在甘露醇作碳源的培养基上生长时，荚膜丰厚。
最早由S.Brenner和R.Horne，（1959）用于病毒粒子的观察，以后利用此法很快地积累了病毒、细菌以及分层蛋白质的微细结构等方面的知识。
负染色法需要使用酸性染料来染色，如伊红或苯胺黑。因为细菌体表面带负电，而酸性染料的色原也带负电，所以色原只能将背景染色。没有染色的细胞在染色背景下就能很容易的观察到。在负染色法中，标本不需要热固定，细胞不会因为化学药物的影响而变形，对于不易染色的细菌或病毒也能观察。
（2）干燥：在空气中自然干燥。
（3）染色：用Tyler染色液染5—7min。
（4）脱色：用20%CuSO4水溶液洗去结晶紫，脱色要适度（冲洗2遍）。用吸水纸吸干，并立即加1—2滴香柏油于涂片处，以防止CuSO4结晶的形成。
（5）镜检：先用低倍镜再用高倍镜观察。观察完毕后注意用二甲苯擦去镜头上的香柏油。
1.负染色法：
（1）制片：取洁净的载玻片一块，加蒸馏水一滴，取少量菌体放入水滴中混匀并涂布。
（2）干燥：将涂片放在空气中晾干或用电吹风冷风吹干。
（3）染色：在涂面上加复红染色液染色2—3min。
（4）水洗：用水洗去复红染液。
（5）干燥：将染色片放空气中晾干或用电吹风冷风吹干。
（6）涂黑素：在染色涂面左边加一小滴黑素，用一边缘光滑的载玻片轻轻接触黑素，使黑素沿玻片边缘散开，然后向右一拖，使黑素在染色涂面上成为一薄层，并迅速风干。
负染色法
负染色法negative staining的染色处理过程主要并非针对菌体本身，故又称“衬托染色法”。是一种易于在电子显微镜下观察试样的微细结构的方法。它是用磷钨酸钠、醋酸氧铀等电子密度高的物质，嵌入生物试样的间隙，根据产生的对比进行观察，而非原来意义上的物质染色。它与通常在电子显微镜中所得的阳面物像不同，而是阴面物像，因而有此名称。解像力可达0.5微米以下。
2.染色液和试剂 ：Tyler法染色液：（见附二、（一）、14）、用滤纸过滤后的绘图墨水、复红染色液（见附二、（一）、2）、黑素（见附二、（一）、7）、6%葡萄糖水溶液、1%甲基紫水溶液、甲醇、20%CuSO4水溶液、香柏油、二甲苯。
3.器材： 载玻片、玻片搁架，擦镜纸、显微镜等。
（四）实验方法
推荐以下四种染色法，其中以湿墨水方法较简便，并且适用于各种有荚膜的细菌。如用相差显微镜检查则效果更佳。
（4）固定：用甲醇浸没涂片，固定1 min，立即倾去甲醇。
（5）干燥：在酒精灯上方，用文火干燥。
（6）染色：用甲基紫染1—2min。
（7）水洗：用自来水轻洗，自然干燥。
（8）镜检：先用低倍镜再高倍镜观察。
结果：背景灰色，菌体紫色，荚膜呈一清晰透明圈。
4.Tyler法
（1）涂片：按常规法涂片，可多挑些菌体与水充分混合，并将粘稠的菌液尽量涂开，但涂布的面积不宜过大。
材料：
试剂
苯胺黑染色液
器材
酒精灯（或本生灯）、接种环、染色盘、玻片、拭镜纸及显微镜。
步骤：
取一小滴苯胺黑染色液，滴于洁净玻片之一端。
以无菌操作取一接种环之培养，置入苯胺黑染色液中，混匀。
取另一玻片（或盖玻片）其一端置于苯胺黑色液之前，并呈30度状态，向他端推去，使混和液成一薄涂膜。
将玻片置空气中干燥，不宜以热固定。
5荧光染色法用荧光染料，如金胺、吖啶橙等进行染色。细菌用荧光染料着色后在荧光显微镜下检查，可在黑的背景中观察到细菌发出明亮的荧光。用荧光染色法检查细菌，有加快检查速度和提高阳性率等优点。
负染色法此种染色法之染色处理过程主要并非针对菌体本身，故又称「间接染色法」。所用之染剂系因阴离子呈色，所以无法对同样带阴电荷之菌体细胞呈色，而于染色处理时会在细胞周围形成沉淀，这种情形即称为阴性或间接染色。
又称背景染色法
原理：
背景染色需用酸性染料如伊红或苯胺黑。因细菌体表带负电荷，而酸性染料之呈色原（chromogen）也带负电荷，故不能渗入细胞内。背景染色之实际应用有二，一为标本不需以热固定，细胞不至因化学药物之影响而变形，可观其自然之大小与型态，二乃可借以观察不易染色之细菌如螺旋菌。
3.干墨水法
（1）制菌液：加1滴6%葡萄糖液于洁净载玻片一端，挑少量胶质芽胞杆菌与其充分混合，再加1环墨水，充分混匀。
（2）制片：左手执玻片，右手另拿一边缘光滑的载玻片，将载玻片的一边与菌液接触，使菌液沿玻片接触处散开，然后以30度角，迅速而均匀地将菌液拉向玻片的一端，使菌液铺成一薄膜。
（3）干燥：空气中自然干燥。