血管紧张素Ⅱ对乳大鼠心肌细胞时钟基因表达的影响

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血管紧张素II心肌细胞损伤作用

二、方法
（一）SD乳鼠心肌细胞的提取、纯化和培养
采用无菌操作的方法取SD乳鼠心脏，用PBS缓冲液反复清洗，用眼科小剪刀剪成1-2m大小的块状，加入0.25％的胰蛋白酶Ⅱ消化液中，置37℃培养箱孵化5-10min，将上层液体转至DMEM液管中，1000r/min离心3-5min，去上清，用DMEM培养基重悬细胞，保存于37℃CO2培养箱。将未消化完的心肌组织块再加入消化液，重复上述步骤，直至所有心肌组织消化完毕为止。将所得的心肌细胞转至70ml的细胞培养瓶中，37℃ CO2培养箱培养60～90min，待成纤细胞贴壁后，吸取上层细胞悬液至新的培养瓶中，计数后按5×105个/ml将细胞加至96胞培养板，置5％CO2和95％O2的培养箱37℃培养，同时观察和记录心肌细胞的生长状况。
[3] SUN Y，ZHANG J，ZHANG J Q，et a1.Renin expression at sites of repair in the infarcted rat heart [J].Mol Cell Cardiol,2001,33 (5)：995-1003.
[4] LER1 A，CLAUDIO P P，LI Q，et a1.Stretch-mediated release of angiotensin II induces myocyte apoptosis by activating p53 that enhances the local rennin-angiotensin system and decreases the Bcl-2-to-Bax protein ratio in the cell [J].Clin Invest，1998，101(7)：1326-42.
（三）SOD、细胞凋亡率的测定
1、标本收集

血管紧张素-Ⅱ对血管内皮细胞内皮素-1 mRNA表达水平的影响及阿托伐他汀的保护作用

ｔｅｐｏｅｔｎｅｆｔｆｔｒａｔｔｓｌｎｏｈｌｌ；ｌＶＣ．ｔｏｓＣｌｒｄＶＣｗｒｄｖｅｔｈｒｔｃｏｆｃｏｏｖｓｉｉＶａｃａＥｄｔｅａ（ｌ（Ｅ）ＭｅｈｄｕｕｅＥｅｅｉｄｄｉｏ４ｉｅＡａｎｎｕｒｉｅｔｉｎｇｏｐ：ｏｌｌｒｕｏｌｇｖｎｃｌｃｌｒｄｉ）ｎ一ｏｐ（ｉｎＡｇ１ｗｉｈｎｌｏｃｎｒｔｎｂｒｕｓｃｎｒｏｐ（ｎｙｉｅｕｔｅｍｅｕ；Ａｇ１ｇｕｇｅｎ一ｔｔｅｆａｃｎｅｔｉｅｏｇｅｌｕｍ１ｒｖ１ｈｉａｏ
他汀，使阿托伐他汀的终浓度为１／ｏ／）ｍ￣Ｌ。以反转录一ｌ聚合酶链反应（ＴＰＲ）Ｒ —Ｃ方法检测血管内皮细胞的Ｅ－ＴＩｍＲＡ表达水平。结果Ｎ ①与空白对照组相比，单纯Ａ＆１ｎ１组血管内皮细胞的ＥＩｆＮＴ－ｎＬＡ表达水平显著增高（＜ｌＰ
汀的保护作用。方法
培养液，ｌ人ＡｇＩ使其终浓度为１一ｒ／）ＡｇＩ＋４Ｎ量阿托伐他汀组（单纯ＡｇＩ的基础上加入阿托￣Ｊ１ｎ－，Ｉ０Ｌ、ｎ－，在ｎ－组伐他汀，阿托伐他汀的终浓度为０１ｍｌ／）Ａ＆１使．ｔｏＬ、ｎ＋大剂量阿托伐他汀组（ｌ在单纯ＡｇＩ的基础上加入阿托伐ｎ－组
维普资讯
山西医药杂志２００８年９月第３７卷第９期ＳｍｘｄＪＳｐｅｅ０８Ｖｏ３，．ｈ￣ｉＭｅ，ｅｔｍｂｒ０，ｌ７Ｎｏ９２

Ang-(1-7)对AngⅡ诱导培养的乳鼠心肌细胞分泌bFGF的影响

ｔｒｒｕｓＣｎｒｌｏｐｈｅｇｏｐ：① ｏｔｕ；② Ａｇ Ⅱ ｇｏｐｅｏｇｒ “ ｒｕ；③ Ａｇ Ⅱ ａｄＡｇ（－）ｇｕ．Ａｔａｓｈｖｒｄ “ ｎｎ一１７ｒｐｆｒｄｙ，ｔｉｅｔｏｅ２ｅｎｅ
ｍｉｒｓｏｅｏｓｒａｉｎｗａｓｄｔａｕｅｔｅｃｌｓｒａｅａｅｓＩｃｏｃｐｂｅｖｔｓｕｅｏｍｅｓｒｈｅｌｕｆｃｒａ．ｍｍｕｏｒｏｈｍｉｔｙＳＢＣｍｅｈｄｗｓｏｎｃｃｅｓＡｔｏａｉｒ
一
（ — ）细胞表面积较ＡｇＩ组明显减小，１７组ｎＩ但仍大于正常对照组；ｎ组细胞ｂＧＡｇⅡ ＦＦ表达灰度值较
正常对照组明显增加，ｎＡｇⅡ＋Ａｇ一（ — ）ｂＧｎ１７组ＦＦ表达灰度值较ＡｇⅡ组明显减小，ｎ但仍大于正常
Ａｇ Ⅱ组细胞平均表面积较正常对照组明显增大，ｎ Ⅱ ＋ＡｇｎＡｇｎ
ＡｇＩ组和ＡｇⅡ＋Ａｇ（ —７组行加药干预，ｎＩｎｎ一１）加药２ｄ后显微镜下测量细胞表面积，用免疫细胞化学
方法检测心肌细胞ｂＧＦＦ含量。结果
ｕｅｏｄｔｃｈｘｒｓｉｎｆＢＧ．ＲｅｕｔＴｅｓｒａｅａｅｆａｄｏｏｒｅｕｔｒｄｗｔｇ Ⅱ ｉ— ｓｄｔｅｅｔｔｅｅｐｅｓｏｓｏＦｓｌｓｈｕｆｃｒａｏｒｉｍｙｃｓｃｌｅｉＡｎｃｉｕｈｎ
ｃｅｓｄｏｖｕｌｃｍａｄｗｔｃｎｒｌｏｐｎ一１）ｃｕｄｒｕｅｔｅｉｃａｅｄｇｅｆｕｆｃｒａｏｒａｅｂｉｓｏｐｒｉｏｔｕ．Ａｇ（－ｏｌｅｃｒｓｅｅｒｅ３ｆｏｙｅｈｏｇｒ７ｄｈｎｅｒｏｓａｅ

缬沙坦对血管紧张素Ⅱ诱导的大鼠肥大心肌细胞糖蛋白130表达的影响

ｔｅｉｎ（ｇｐ１３０）ｉｎｒａｔｓｗｉｔｈＡｎｇＩＩ — ｉｎｄｕｃｅｄｍｙｏｃａｒｄｉａｌｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｙ．ＭｅｔｈｏｄｓＡｎｉｎｖｔｒｏｍｏｄｅｌｏｆ
ｅｄｉｎｔｏｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ。Ａｎｇ１Ｉｇｒｏｕｐ，，ｖａｌｓａｒｔａｎｇｒｏｕｐＢ，ｖａｌｓａｒｔａｎｇｒｏｕｐＣ．Ｔｈｅ
Ｔａｉｙｕａｎ０３０００１，ＳｈａｎｘｉＰｒｏｖｉｎｃｅ，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＯｂｊｅｃｔｉｖｅＴｏｓｔｕｄｙｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｖａｌｓａｒｔａｎｏｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｐｒｉｍａｒｉｌｙｃｕｌｔｕｒｅｄｇｌｕｃｏｐｒｏ —
诱导的肥大心肌细胞ｇｐｌ３０的表达，延缓了Ａｎｇ１１诱导的心肌肥大的发生、发展，从而对心肌细胞发挥保护作用。关键词：肌细胞，心脏；血管张素 Ⅱ；糖蛋白类；细胞因子受体ｇｐｌ３０
中华老年心脑血管病杂志２Ｏ１３年８月第１５卷第８期
ＣｈｉｎＪＧｅｒｉａｔｒＨｅａｒｔＢｒａｉｎＶｅｓｓｅｌＤｉｓ，Ａｕｇ２０１３，Ｖｏｌ１５，Ｎｏ．８

去甲肾上腺素和血管紧张素Ⅱ对乳鼠心肌细胞表达肿瘤坏死因子α的影响

ｈｕｓＩｏｒ．ｍｍｕｏｉｔｃｅｓｒ，ｎｈｓｏｈｍｉｔｙＲＴ— ＣＲｎｌｃｒＤｏｅｉｔｆｓｉｓａＥＭＳ）ｒｓｄＰａｄｅｅｔｏｈｒｔｃｍｏｉｈｆａｓｙ（ｔＡｗｅｅｕｅ
ｃｂｔｄｗｉ０ｍｏ／Ａｏｐ，１。ｌＬ（ｏｐｎ０ｍｏ／（ｏｐｕａｅｔ１ｈｌＬ（Ｇｒｕ）０ｍｏ／ＢＧｒｕ）ａｄ１一ｌＬＣＧｒｕ）ＮＥａｄｎ１一０。ｍｏ／（Ｇｒｕ），１ｍｏ／（ｏｐｎ０ｍｏ／（ｏｐｌＬＤｏｐ０ｌＬＥＧｒｕ）ａｄ１ｌＬＦＧｒｕ）Ａｎｆｒ２ｒ４ｇＩｏ４ｏ８Ｉ
中华老年心脑血管病杂志２００８年１月第１１０卷第ｎ期
（ａｒｔａｔｒｉｓｅＤｉ，ｖ２０，ｌ０Ｎ．１ＳｉＪＧｅｉｒＨｅｒａＶｅｓｌｓＮｏ０８Ｖｏ，ｏ１ｌｎａＢｎ１
・８９・４
．
基础研究．
ｔｅｅｔＴＮＦ— ｘｅｓｏｎｄｔｓｉｅｎｌａａｔＦ—ｃｗｈｉｈｃｕｌｅｔａｌｃｔｄｔｏｄｔｃａｅｐｒｓｉｎａｈｅｐｏｓｂｌｕｃｅｒｆｃｏｒＮＩＢｃｏｄｂｒｎｓｏａｅｏｔｕｃｅｎｏｓｒｅｈｅｐｒｂａｌｒｈｅｎｌｕｓａｄｔｃｅｎｔｏｂｅｐｏｍｏｅｆＴＮＦ— ｔｒｏ．ＲｅｕｔＩｍｕｈｉｔｃｍｉａｔｄｙｓｌｓｍｎｏｓｏｈｅｃｌｓｕ

血管紧张素II(AngII)在心力衰竭中作用机制研究进展及A(精)

血管紧张素I I(A n g I I在心力衰竭中作用机制研究进展及治疗比较基础医学院05级临床5班刘梦媛张寅赵登李晓曦吴琼张堃摘要:血管紧张素II(AngII在自主神经活性和心血管功能的中枢调节中扮演重要的角色,其生物学效应的发生与血管紧张素I型受体(AT1R密切相关。

目前认为,AngII主要通过丝裂素活化蛋白激酶(MAPK途径在心力衰竭的发生发展过程中发挥作用。

治疗心力衰竭方面,血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI和血管紧张素受体I 拮抗剂(ARB疗效基本相同,但二者具有不同的作用机制。

关键词:AngII 心力衰竭 AT1R引言心衰是一种临床常见病和多发病,是多种心血管疾病的共同转归。

大量资料显示,肾素一血管紧张素系统(RAS是调节血压、体液容量和电解质平衡的重要系统[1],通过影响血管紧张性、体液和电解质平衡及交感神经活性,在血压及心血管稳态调节中占有极其重要的地位[2]。

RAS的作用主要通过AngII来实现。

AngII有强烈的缩血管作用,还可促进心肌细胞增生,胶原合成,血管平滑肌增生,醛固酮和内皮素分泌及过氧化物的产生,最终造成心血管损害,血流动力学障碍等,引发心力衰竭[1]。

Ang II受体有4种亚型,其中I型受体(AT1R主要分布在人体的血管、心脏、肾脏、脑等部位,主要功能有缩血管、潴钠、抑制肾素分泌、激活交感神经系统,与心肌肥大、纤维化、心律失常等有关,即有心血管、肾脏和中枢神经系统的作用,在心衰的发生发展中起重要作用[3]。

针对心衰的治疗,在阻断肾素一血管紧张素系统(RAS方面,血管紧张素I型受体拮抗剂(ARB(如洛沙坦较血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI在临床应用潜力似乎更大。

以下将进行简要阐述。

AngII与心衰的研究进展近年来,针对AngII如何介导心衰转导途径作了大量实验。

目前发现丝裂素活化蛋白激酶(MAPK,包括 c - jun NH2 末端激酶(JNK 、细胞外信号调节酶( ERK 和P38MAPK,是细胞增殖与分化、凋亡与坏死等信号转导的共同通路, JNK、P38MAPK还是机体应激的主要细胞信号转导通路。

心肌组织工程种子细胞的研究进展

心肌组织工程种子细胞的研究进展（作者:___________单位: ___________邮编: ___________）【摘要】目的综述组织工程心肌种子细胞来源的研究现状与存在的问题，并展望其前景。

方法广泛查阅近十年来有关组织工程心肌种子细胞的文献，并进行综述。

结果心肌组织工程的替代治疗具有极其诱人的前景，但还处于起步阶段，仍然需要通过大量的实验找到最佳的细胞来源。

结论组织工程心肌有广阔潜在的临床应用前景，其细胞来源值得进一步研究。

【关键词】心肌组织工程；种子细胞。

组织工程是应用生命科学与工程学的原理与技术，在正确认识哺乳动物的正常及病理两种状态下的组织结构与功能关系的基础上，研究开发用于修复、维护、促进人体各种组织或器官损伤后的功能和形态的生物替代物的一门新兴学科。

其核心是模拟体内组织发生的环境，在体外培养细胞，构建由细胞和生物材料组成的、具有特定功能的三维工程化组织。

组织工程心肌主要涉及种子细胞来源，支架以及体外构建方式和移植。

下面我们主要讨论重点是心肌组织工程种子细胞。

1心肌组织工程的细胞来源构建工程化心肌组织的最佳细胞，应该是容易获得的、能增殖的、无免疫原性的、具有分化为成熟的有功能的心肌细胞的能力的细胞。

遗憾的是，目前还没有发现这样的细胞。

供体(异源的)细胞相对容易获得，但是具有免疫排斥反应的风险；而自体细胞虽然很难获得和扩增，但是没有免疫排斥的困扰。

目前，已报道的应用于心肌组织构建的细胞包括胎儿心肌细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞、骨骼成肌细胞、天然骨髓细胞、间充质千细胞和胚胎干细胞等。

1.1心肌细胞胎儿心肌细胞是研究的最早最广泛，被认为是目前干细胞研究领域的一个重要方面。

Soonpa等［1］最早将胎儿心肌细胞移植到鼠的心肌。

Scorsin等［2］将胎儿心肌细胞注射到心肌梗死模型鼠的左心室心肌，研究表明有50％的鼠的梗死边缘区有被注射的心肌细胞。

胎儿心肌细胞移植能改善左心室功能，提高射血分数和心输出量。

长期耐力训练后大鼠心脏血管紧张素Ⅱ对心肌细胞凋亡的影响

ＷａｇＧｕｎｐｉｇ，ａｇｎａｇｎＺｈｎ
（ａｙｎｏｍａＵｉｒｔ，ａｙｎ２００ＭｉａｇＮｒｌｎｖｓｙＭｉａｇ１０）ｎｅｉｎ６
ＡｓａｔＯｊｃｖ：ｏｓｄｈｆｃｏｃｌａｇｏｎｉＩｏａｄａｐｐｏｉａｅｎｂｔｃ：ｂｔｅＴｔｙｔｅｅｆｔｆｏａｎｉｅｓＩｎｃｒｉｃａｏｔｓｆｒｌｇ—ｔｍｅｄｒｎｅｒｅｉｕｅｌｔｎｓｔｏｅｎｕａｃｒｔｉｉｇｒｎ．Ｍｅｏｓａｎｈｔｄ：Ｍａｏｔｌ３ｍｎｈ—ｏＤｒｔｗｒｎｏｙｄｖｄｄｉｔｃｎｏｇｏｐ（ｅｌＳａｅｅｒｄｍｌｉｉｅｏｏｔｌｒｕｎ＝１）ａｄｌｇ—ｔｍｅ — ｄｓａｎｒｎｏ２ｎｅｎｒｄｒｎｅｔｉｉｇｇｏｐ（ｕａｃａｎｒｕｎ＝１）ｆｒｎｕｉｇｔｅａｉｌｄｌｙｓｏｔ —ｅｄｒｎｅｔｉｉｇｕｉｇｔｅｉｍｕｒｎ．Ａｔｄｃｎｍａｍｏｅｂｉｍｎｓｎｕａｃａｎ，ｓ２ｅｉｎｈｘｈｒｎｎｈｍ —
ｎｈｓｏｈｅｓｒｎｏｕｔｒｚｄｉａｅｓｓｅｔｂｅｖｈｉｔｉｕｉｎａｄｅｐｒｓｉｎｏｏａｎｉｔｎｉＩｉａｏｉｔｃｍｉｔｙａｄｃｍｐｅｉｅｍｇｙｔｍｏｏｓｒｅｔｅｄｓｒｂｔｏｎｘｅｓｏｆｌｃｌａｇｏｅｓｎＩｎｒｔｈａｔｏａｈｇｏｐ，ｕｉｇｔｅＲｅｌ—ＴｉｅｒｆｅｃｒｕｓｎｈａｍｅＰＣＲｙｔｍｏａａｙｉｈｅｍＲＮＡｘｒｓｉｎｏｌ一２ａｄＢａｎｒｔｈａｓｓｅｔｎｌｓｓｔｅｐｅｓｏｆＢｃｎｘｉａｅｒｔｏａｈｇｏｆｅｃｒｕｐ，ｕｓｎｈｉａｓｓｅｔｎａｙｉｈｅｅｆｓｒｍＳｏａｈｇｏｐ．ＲｅｕｔｉｇｔｅＥｌｙｔｍｏａｌｓｓｔｅｌｖｌｏｅｕＧＳＧｆｅｃｒｕｓｓｌ：Ｔｈｍｍｕｎｔｓｔｅｅｉｉｐｏｉｉｙｖ

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至获得足量的细胞。每次消化５ｍ，弃去第一次消ｉｎ化的上清，收集以后消化的上清，转移到含有血清的ＤＭＥＭ培养基中以终止胰酶作用。３００×ｇ离心７，弃上清取细胞沉淀加入含１ｍｉｎ５％新生牛血清（）的Ｄ在３ＮＢＳＭＥＭ培养基制备成细胞悬液，７ ℃，
２．１建立肥大心肌细胞心肌细胞生长７长成单层，同步搏动。经７２ｈ２
－１ ·Ｌ诱导，组间心肌细胞数量无明ｈＡｎｇ．１ｍｏｌ Ⅱ０ μ 显差异，说明Ａ而心肌细胞表ｎｇ Ⅱ不引起细胞增殖，２面积对照组为（），）２２０ ±３０ｍＡｎｇ３７０ ±７０ Ⅱ 组为（ μ ２表明Ａｍ，ｎｇ Ⅱ具有诱导心肌细胞体积肥大的作用 μ
３组织块，１～３ｍｍ０．１％胰蛋白酶３７℃反复消化直
哺乳动物心血管活动（血压、心率、心输出量、血管张力）表现出明显的日周期节律现象。病理状况
收稿日期：２，接受日期２００４１２２０００５０２０４基金项目：国家自然科学基金资助项目（）３０２７１５０６作者简介：黄新艳（，女，硕士研究生。Ｅ：１９７８－）ｍａｉｌ；李庆平，女，博士，教授，硕士生导师，研究ｈｘｙ７８＠ｓｏｈｕ．ｃｏｍ方向为心血管药理学。
黄新艳１，魏
立１，李晓林１，朱东亚２，李庆平１
（南京医科大学１心血管药理学研究室，２药学院药理学教研室，江苏南京．．摘要：目的为研究血管紧张素 Ⅱ （致左心Ａｎｇ Ⅱ）分离纯化培养
）２１００２９
下，几乎所有的急性心血管事件都表现出明显的日周期节律，例如急性心肌梗死、室性心律失常、心源
Ａｎｇ Ⅱ对心肌细胞时钟基因转录上调的作用。结论在正常培养乳大鼠心肌细胞中，时钟基因以日周期节律方式振荡表达，从受ＡｎｇＴｅｌ Ⅱ诱导其表达增强，体水平拮抗Ａｎｇ Ⅱ的诱导作用。关键词：血管紧张素 Ⅱ；心肌；生物钟；时钟基因；替米沙坦中图分类号：Ｒ９６文献标识码：Ａ文章编号：１（）０００３００２２００５０３０１９４０５昼夜生物节律是广泛存在的生命现象，是由体内的生物钟决定的。中枢生物钟位于下丘脑视交叉上核，而外周组织甚至体外培养的细胞亦拥有生物钟。生物钟主要的分子基础是时钟基因，包括，ｍ，Ｃ，Ｂ，ｍＰｅｒＣｒｙｌｏｃｋｍａｌ１和时钟输出基因Ｄｂｐ，Ｔ；时钟基因及其蛋白质产物构成的自主调节Ｈｌｆｅｆ的转录和翻译反馈循环，是生物钟运转的分子基
－１使心肌细胞时钟基因转录水平ＬＡｎｇ２ｈ Ⅱ处理７－１－１ ·Ｌ能拮抗０ ·Ｌ显著上调；０．１ｍｏｌＴｅｌ．１ｍｏｌ μ μ
心血管参数及心血管事件的日周期节律性，暗示心血管功能和生物钟时钟基因之间可能存在密切
］４。生物钟的紊乱，很可能促进心血管疾病的联系［
－１加入Ｔ和Ａ其终浓度均为０ ·Ｌ。细ｅｌｎｇ．１ｍｏｌ Ⅱ， μ 胞培养７以后开始在每日固定时间（每日下午６２ｈ－１
以上述ｃ。ＰＣＲ反应：ＤＮＡ产物为模板进行ＰＣＲ上游５ｍＰｅｒ２其扩增引物： ′ ＧＣＡＧＣＣＴＴＴＣＧＡＴＴＡ；下游３ＴＴＣＴＴＣ３ ′ ′ ＧＡＡＧＴＡＧＴＴＧＧＧＣＡＣＣＴＣＧ；片段长度９。Ｂ上游５５ ′ ５ｂｐｍａｌ１扩增引物： ′ ＡＧＧ；下游３ＡＴＧＴＧＡＣＣＧＡＧＧＧＡＡＧＡ３ ′ ′ ＧＡＡＧＣＧ；片段长度３。ＤＧＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＧＴ５ ′ ２５ｂｐｂｐ其扩增引物：上游５ ′ ＴＧＧＣＡＣＴＴＣＡＧＧＡＧＡＡＣＡＡＡ；下游３；片段３ ′ ′ ＡＧＧＧＡＣＡＧＴＡＣＧＧＡＴＧＧＡＡ５ ′ 长度３。退火温度分别为５５２ｂｐ７ ℃，５７ ℃，５８ ℃。总循环数为３肌动蛋白（）。０次。内参照为 β ａｃｔｉｎ β ［］５ＰＣＲ详细反应条件见文献。取Ｒ１．５％琼脂糖凝胶电泳：ＴＰＣＲ产物５Ｌ加 μ －１ ·Ｌ溴化乙锭的１Ｌ上样缓冲液，在含５００ｇ μ μ ，，用凝胶成像１．５％琼脂糖凝胶上电泳，１００Ｖ２０ｍｉｎ系统拍摄打印实验结果，条带用计算机图像分析系统扫描定量。所有实验均重复３次。１．６统计学方法每一基因的ｍ每个时间点３ＲＮＡ半定量分析，个样品，扩增后的条带灰度校正后以珋表示，采ｘ±ｓ用ｔ检验。
，］１２础［。
１材料和方法
试剂与仪器１．１动物、新生７ｄ清洁级ＳＤ大鼠购自南京医科大学实验动物中心；溴脱氧尿苷、替米沙坦（５Ａｎｇｔｅｌｍｉ Ⅱ、，Ｔ）购于美国Ｓ购于美国ｓａｒｔａｎｅｌｉｇｍａ公司，Ｔｒｉｚｏｌ公司；ＧｉｂｃｏＭＭＬＶ反转录酶、ＴａｑＤＮＡ聚合酶购于公司；）购于上海美国ＰｒｏｍｅｇａＲＮＡ酶抑制剂（ＲＮａｓｉｎ华美公司；ＰＣＲ引物由上海生工公司合成；其余试剂均为国产分析纯。江苏捷达凝胶图像分析仪。１．２乳大鼠心肌细胞体外培养取出生后７ｄ的Ｓ无菌条件下开胸剪Ｄ乳大鼠，取心尖部分，液清洗去除残血，将其剪成ＤＨａｎｋｓ
时整）换液给药，并以此时间作为生理节律时间０（，Ｃ）。Ｃ指每一日周期的起始ｃｉｒｃａｄｉａｎｔｉｍｅ０Ｔ０Ｔ０指起始后４ｈ，依此类推。通常将换液给药点，ＣＴ４时间点作为起始点。每２按上述方案连续换液３４ｈ次后，换不含血清、的ｄ７的ＣＴ０时，Ａｎｇｅｌ Ⅱ及Ｔ并开始每隔４ｈ收取细胞提取总ＤＭＥＭ培养基，。ＲＮＡ１．４心肌细胞肥大鉴定１．４．１心肌细胞表面积测定－１心肌细胞经Ａ · 诱导７后加ｎｇ．１ｍｏｌＬ２ｈ Ⅱ０ μ 后将贴壁生长的心肌细胞消换无血清培养液，２４ｈ化脱落，收集细胞。用激光共聚焦显微镜扫描，ＬＳＭ软件测定细胞表面积，每次测１每视５１００个视野，野测１个细胞。０１．４．２心肌细胞蛋白质含量测定参照南京建成生物工程公司考马斯亮蓝蛋白检测试剂盒说明测定心肌细胞蛋白质含量，蛋白含量
，以差速贴壁法纯化心５％ＣＯ０ｍｉｎ２培养箱中培养９
９－肌细胞，以１的细胞密度接种至２培养 × １０Ｌ１５ｍＬ
开始实验。培养的前７加入０瓶继续培养７２ｈ２ｈ．１ · 溴脱氧尿苷。ｍｍｏｌＬ５１．３实验分组在原代培养７后，将细胞分为３组：对照组，２ｈ含１）培养基培养细胞；以ＤＭＥＭ（０％ＮＢＳＡｎｇ Ⅱ 组，（含１）培养基中加入Ａ终浓度为ＤＭＥＭ０％ＮＢＳｎｇ Ⅱ，－１ · 组，（含１）培养基中０．１ｍｏｌＬ；ＴｅｌＤＭＥＭ０％ＮＢＳ μ
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（）０２５８６８６２８８３
中国药理学与毒理学杂志
年６月；１（）２００５９３
·１ · ９５
－１，反应条件为３，ＬＭＭＬＶ２Ｌ７ ℃孵育１ｈ９５ ℃孵 μ 育１，０ｍｉｎ４℃保温，－２０ ℃保存。
应用Ｒ，Ｂ，ＤＴＰＣＲ法对心肌细胞ｍＰｅｒ２ｍａｌ１ｂｐ个时间点（，，，ｍＲＮＡ进行半定量。在７ＣＴ０ＣＴ４ＣＴ８，，，）按Ｔ说明书步骤提取ＣＴ１２ＣＴ１６ＣＴ２０ＣＴ２４ｒｉｚｏｌ每瓶心肌细胞的总Ｒ，用紫外分光光度计测Ａ和ＮＡ２６０，确定的浓度和纯度，重复测定次，计算样ＡＲＮＡ３２８０品总Ｒ：比值为１。ＮＡ浓度，ＡＡ．８～２．０２６０２８０逆转录：以Ｏ（）为随机引物，ｌｉｇｏｄｔ１０ＬＲＮＡ＋ μ （）在管内混匀，孵育０．１５ｇＯｌｉｇｏｄｔ０．２ｍＬＰＣＲ７０ ℃ μ ，打开二级结构，立即冰水浴。然后加入５ｍｉｎＲＮＡ，无核酸酶水６， · ５ × ＭＭＬＶ缓冲液６Ｌ．５Ｌ１０ｍｍｏｌ μ μ －１－１， ·ＬＲ， · ＬｄＮＴＰ２Ｌ４０ＵＮａｓｉｎ０．５Ｌ０．２ｍＵ μ μ μ
－１ ·Ｌ）＝（标准（ｇＡ／Ａ测定管－Ａ空白管）标准管－Ａ空白管／管浓度／稀释倍数。根据细胞计数结果，将蛋白含量－１９单位（ · ）换算为蛋白含量单位（）。ｇＬｇ／１０ｃｅｌｌｓ１．５心肌细胞时钟基因表达检测