MdMYB73的分子克隆及其在苹果织植和拟南芥幼苗中的盐抗性功能鉴定
一个与抗黄萎病和耐干旱、盐胁迫相关的棉花受体类似蛋白激酶基因的克隆与功能鉴定
一个与抗黄萎病和耐干旱、盐胁迫相关的棉花受体类似蛋白激酶基因的克隆与功能鉴定棉花作为世界性的重要经济作物,产生的天然纤维是重要的纺织工业原料。
然而随着环境恶化,棉花在其生长区域频繁遭受着干旱、高盐、低温等非生物以及病害等生物胁迫的侵袭,严重影响着棉花的生长发育和产量。
陆地棉是我国棉花的主栽品种,占棉花栽培面积的95%以上,然而在这些主栽品种中,抗逆性好和品质优良的品种并不多,特别是抗黄萎病品种的培育,由于在陆地棉中找不到免疫或高抗的黄萎病抗源,所以抗黄萎病育种一直是育种家的一大难题。
因此,通过研究棉花抗逆抗病机制,利用基因工程的方法来培育优良的棉花新品种将是今后棉花育种的主要方向。
受体类似蛋白激酶属于蛋白激酶的一个亚家族,在拟南芥体内约有600多个成员,已经发现的激酶有BRI1,CLAVATA1, Pto, SRK和Xa21等。
这些基因在植物自交不亲和,抗病,耐逆,发育调节,以及激素识别等方面发挥重要的作用,但是其中大多数激酶基因功能并不清楚。
本研究中的受体类似蛋白激酶基因是从我国遗传研究和育种广泛利用的抗黄萎病品种海岛棉海7124(Gbarbadense L. cv. Hai7124)为材料克隆获得,基因ORF全长1080bp,编码360个氨基酸,没有内含子,与受体类似蛋白激酶高度同源,包含了受体类似蛋白激酶的11个保守结构域,所以我们将其命名为GbRLK。
从两个二倍体棉花和四倍体海7124的At、Dt亚组的中分别获得了GbRLK基因序列,序列比对发现该基因在二倍体AA以及At亚组中与DD或Dt亚组相比缺失一个碱基,导致基因翻译提前终止。
结合该基因受体类似蛋白激酶的保守域,可知在四倍体棉花海7124基因组中以受体类似蛋白激酶发挥作用的基因来源于Dt亚组,而At亚组的基因变成新基因或变成无效基因。
用该基因的全长ORF与GFP融合,构建植物表达载体,通过转化洋葱表皮细胞,发现该基因定位于细胞膜上。
异源表达CmSAMDC基因拟南芥的耐盐性分析
江西农业学报㊀２０１９，３１（９）：５０ ５４ＡｃｔａＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｅＪｉａｎｇｘｉ㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｊｘｎｙｘｂ．ｃｏｍＤＯＩ：１０．１９３８６／ｊ．ｃｎｋｉ．ｊｘｎｙｘｂ．２０１９．０９．０９异源表达ＣｍＳＡＭＤＣ基因拟南芥的耐盐性分析刘长命，杨娜，文丹，路梦梦，明田田㊀㊀收稿日期：２０１９－０５－１４基金项目：陕西省农业科技创新与攻关项目（２０１６ＮＹ－０３２）；商洛市科技计划项目（ＳＫ２０１５－１３）㊂作者简介：刘长命（１９８０─），男，讲师，博士，主要从事园艺植物种质资源抗逆研究㊂（商洛学院，陕西商洛７２６０００）摘㊀要：利用含５０ｍｇ／Ｌ潮霉素（Ｈｙｇ）的ＭＳ固体培养基成功筛选出转ＣｍＳＡＭＤＣ基因的拟南芥株系ＴＡ１和ＴＢ１，并对Ｔ３代转基因植株的耐盐性进行了分析㊂研究结果表明：转ＳＡＭＤＣ基因的拟南芥在含不同浓度ＮａＣｌ的培养基中发芽率㊁侧根数均显著高于野生型拟南芥的；转ＣｍＳＡＭＤＣ基因拟南芥幼苗在２００ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ条件下能正常生长，且具有较低的丙二醛（ＭＤＡ）含量，而野生型拟南芥在相同胁迫条件下明显萎蔫㊁失绿甚至死亡㊂说明过量表达ＳＡＭＤＣ基因可以显著提高拟南芥的耐盐性㊂关键词：ＣｍＳＡＭＤＣ基因；转基因；拟南芥；耐盐性；抗氧化活性中图分类号：Ｓ３３２．６㊀文献标志码：Ａ㊀文章编号：１００１－８５８１（２０１９）０９－００５０－０５ＳａｌｔＴｏｌｅｒａｎｃｅＡｎａｌｙｓｉｓｏｆＴｒａｎｓｇｅｎｉｃＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａＰｌａｎｔｓｗｉｔｈＨｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＣｍＳＡＭＤＣＧｅｎｅＬＩＵＣｈａｎｇ－ｍｉｎｇ，ＹＡＮＧＮａ，ＷＥＮＤａｎ，ＬＵＭｅｎｇ－ｍｅｎｇ，ＭＩＮＧＴｉａｎ－ｔｉａｎ（ＳｈａｎｇｌｕｏＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈａｎｇｌｕｏ７２６０００，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＴｈｅｔｒａｎｓｇｅｎｉｃＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａｓｔｒａｉｎｓＴＡ１ａｎｄＴＢ１ｗｅｒｅｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙｓｃｒｅｅｎｅｄｂｙｓｏｌｉｄｍｅｄｉｕｍｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ５０ｍｇ／Ｌｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ（Ｈｙｇ），ａｎｄｔｈｅＴ３ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｓｅｅｄｌｉｎｇｓｗｅｒｅｕｓｅｄｔｏａｎａｌｙｚｅｔｈｅｓａｌｔｔｏｌｅｒａｎｃｅ．ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｒａｔｅａｎｄｌａｔｅｒａｌｒｏｏｔｓｏｆｔｒａｎｓｇｅｎｉｃＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａｗｉｔｈＣｍＳＡＭＤＣｇｅｎｅｗｅｒｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈｏｓｅｏｆｗｉｌｄｐｌａｎｔｓｕｎｄｅｒｄｉｆｆｅｒｅｎｔｔｒｅａｔｍｅｎｔｓｏｆＮａＣｌ．Ｆｕｒｔｈｅｒｍｏｒｅ，ｔｈｅｔｒａｎｓｇｅｎｉｃＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａｓｅｅｄｌｉｎｇｓｗｉｔｈＣｍＳＡＭＤＣｇｅｎｅｃｏｕｌｄｇｒｏｗｎｏｒｍａｌｌｙｕｎｄｅｒ２００ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌａｎｄａｐｐｅａｒｅｄａｌｏｗｌｅｖｅｌｏｆｍａｌｏｎｄｉａｌｄｅｈｙｄｅ（ＭＤＡ），ｗｈｉｌｅｗｉｌｄ－ｔｙｐｅｐｌａｎｔｓｗｉｌ⁃ｔｅｄ，ｌｏｓｔｇｒｅｅｎｏｒｅｖｅｎｄｉｅｄ．ＴｈｅｓｅｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＣｍＳＡＭＤＣｇｅｎｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｉｍｐｒｏｖｅｄｔｈｅｓａｌｔｔｏｌｅｒａｎｃｅｏｆＡｒ⁃ａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ＣｍＳＡＭＤＣｇｅｎｅ；Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｓｉｓ；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ；Ｓａｌｔｔｏｌｅｒａｎｃｅ；Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔａｃｔｉｖｉｔｙ㊀㊀盐胁迫是植物生长发育中最为严重的非生物胁迫因素之一㊂目前，全球被盐渍化的陆地面积约占１０％，中国的盐渍土面积近１亿ｈｍ２，并且有日趋扩大的趋势㊂对植物耐盐机理进行深入研究，将有助于培育耐盐性强的植物品种，并对生态环境改善也具有积极的指导意义［１］㊂近年来，多胺代谢途径已被作为植物潜在抗性的研究目标，涉及多胺代谢的相关基因也越来越被重视㊂研究发现，在遭受冷害［２］或盐胁迫［３］时，黄瓜和向日葵的内源多胺合成与代谢途径都发生了改变，并且抗性品种能合成更多的多胺来抵御胁迫［４－６］㊂１９－腺苷甲硫氨酸脱羧酶（ＳＡＭＤＣ）是精胺和亚精胺合成过程中的关键酶，该酶参与了多数植物的抗性反应过程［７］㊂作者前期研究［８－１１］显示，转ＣｍＳＡＭＤＣ基因的拟南芥植株对白粉病的抗性明显增强㊂为了进一步探明ＣｍＳＡＭＤＣ基因在响应非生物胁迫中的作用，本研究以已获得的转基因拟南芥为材料，对其耐盐性进行了分析，以期为利用该基因进行甜瓜耐盐性改良提供参考㊂１㊀材料与方法１．１㊀材料转基因拟南芥株系ＴＡ１㊁ＴＢ１为前期研究获得，将野生型和转基因拟南芥Ｔ３代种子消毒和清洗干净，待用㊂１．２㊀方法１．２．１㊀目标基因的定量和半定量表达分析㊀选取６周龄Ｔ３代转基因拟南芥植株叶片，利用引物Ｃｍ⁃ＳＡＭＤＣＦ：５ᶄ－ＡＴＣＡＡＡＡＣＴＴＧＣＧＧＣＡＣＴＡＣ－３ᶄ和ＣｍＳＡＭＤＣＲ：５ᶄ－ＡＧＣＡＣＣＣＴＣＡＣＡＡＴＣＡＡＣＴＴＡＧ－３ᶄ进行定量和半定量分析㊂实时定量程序为：９５ħ３０ｓ；９５ħ２０ｓ，６０ħ２０ｓ，７２ħ２０ｓ，４０个循环；以拟南芥的Ａｃｔｉｎ２基因作为内参㊂半定量程序为：９４ħ２ｍｉｎ；９４ħ２０ｓ，６０ħ３０ｓ，７２ħ１ｍｉｎ，２５个循环；７２ħ１０ｍｉｎ㊂１．２．２㊀转基因拟南芥发芽率的测定㊀将Ｔ３转基因植株和野生型拟南芥的种子用７５％酒精和１０％ＮａＣｌＯ消毒，然后随机取１００粒，播于含不同浓度（０㊁１００㊁１５０㊁２００㊁３００ｍｍｏｌ／Ｌ）ＮａＣｌ的ＭＳ培养基上，６ｄ后统计发芽情况㊂１．２．３㊀转基因拟南芥幼苗的根长及侧根数测定㊀将ＭＳ培养基上生长１５ｄ的Ｔ３代转基因幼苗和野生型拟南芥幼苗移至含不同浓度（０㊁１００㊁１５０㊁２００㊁３００ｍｍｏｌ／Ｌ）ＮａＣｌ的ＭＳ培养基上，继续生长１５ｄ后测定其根长和侧根数㊂１．２．４㊀转基因拟南芥幼苗的耐盐性鉴定㊀将ＭＳ培养基上生长１５ｄ的Ｔ３代转基因幼苗和野生型拟南芥幼苗移栽入盆（培养基质为蛭石ʒ壤土ʒ草木灰＝１ʒ１ʒ１），培养至４周龄时，每穴分别浇灌１５ｍＬ２００ｍｍｏｌ／Ｌ或４００ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ溶液，每２ｄ浇灌１次，在处理１２ｄ后测定脂质过氧化水平（ＭＤＡ含量）㊂１．２．５㊀转基因拟南芥激素含量的测定㊀油菜素内酯（Ｂｒａｓｓｉｎｏｌｉｄｅ，ＢＲ）㊁茉莉酸甲酯（Ｍｅｔｈｙｌｊａｓｍｏｎａｔｅ，ＪＡ－ｍｅ）㊁脱落酸（Ａｂｓｃｉｓｉｃａｃｉｄ，ＡＢＡ）㊁赤霉素（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌｉｎ，ＧＡ）㊁吲哚丙酸（Ｉｎｄｏｌｅｐｒｏｐｉｏｎｉｃａｃｉｄ，ＩＰＡ）㊁玉米素（Ｚｅａｔｉｎｒｉｂｏｓｉｄｅ，ＺＲ）和吲哚乙酸（Ｉｎｄｏｌｅａｃｅｔｉｃａｃｉｄ，ＩＡＡ）的提取参照黄志［１２］的方法㊂２㊀结果与分析２．１㊀目标基因的表达分析通过转基因植株筛选，并对转基因拟南芥Ｔ３代植株进行ＣｍＳＡＭＤＣ基因表达分析，结果（图１）显示，ＣｍＳＡＭＤＣ基因成功在转基因株系ＴＡ１和ＴＢ１中表达㊂ＴＡ１和ＴＢ１代表转基因株系；ＷＴ代表野生型拟南芥㊂下同㊂图１㊀ＣｍＳＡＭＤＣ基因在拟南芥中表达的半定量（Ａ）和实时定量（Ｂ）分析结果２．２㊀盐胁迫下转基因拟南芥的发芽率对转基因Ｔ３代株系ＴＡ１㊁ＴＢ１和野生型拟南芥植株（ＷＴ）的种子发芽率进行观察，发现：在含１００㊁１５０㊁２００ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ条件下，转基因Ｔ３代种子的发芽率分别为８６％㊁７０％和４５％，而野生型拟南芥种子的发芽率分别为７５％㊁５８％和２５％，Ｔ３代种子的发芽率均显著高于野生型植株的；而在不含盐溶液（０ｍｍｏｌ／Ｌ）的ＭＳ培养基上，两者的种子发芽率无显著性差异（图２）㊂２．３㊀盐胁迫下转基因拟南芥幼苗的根长及侧根数对根系观察结果（图３）显示：在不含盐溶液（０ｍｍｏｌ／Ｌ）的ＭＳ培养基上，转基因Ｔ３代植株的根长略大于野生型植株，但差异未达到显著性水平，侧根数也无显著性差异；在１００ｍｍｏｌ／Ｌ盐胁迫条件下，Ｔ３代植株的侧根数明显多于野生型植株，差异达到了极显著水平，而根长无显著差异；在１５０ｍｍｏｌ／Ｌ盐胁迫条件下，Ｔ３代植株的侧根数和根长均显著高于野生型植株；在２００ｍｍｏｌ／Ｌ盐胁迫条件下，两种材料的根系和侧根生长均受到了明显抑制㊂２．４㊀盐胁迫下转基因拟南芥植株的生长情况将ＭＳ培养基上１５日龄的幼苗进行移栽，缓苗３ｄ后隔日浇１次不同浓度的ＮａＣｌ溶液㊂用２００ｍｍｏｌ／Ｌ盐溶液处理８ｄ后，转基因植株与对照植株（ＣＫ）生长基本一致，而野生型植株的叶片呈现轻微黄化；在处理１６ｄ后，野生型植株明显小于转基因植株㊂用４００ｍｍｏｌ／Ｌ盐溶液处理８ｄ后，转基因植株生长受阻，但较野生型植株的受阻程１５㊀９期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀刘长命等：异源表达ＣｍＳＡＭＤＣ基因拟南芥的耐盐性分析度要轻；处理１６ｄ后，野生型植株已经死亡，而转基因植株仍能继续存活（图４Ａ）㊂经不同浓度盐溶液处理后１２ｄ，植株的脂质过氧化程度（ＭＤＡ含量）存在显著性差异，即经２００ｍｍｏｌ／Ｌ与４００ｍｍｏｌ／Ｌ浓度盐溶液处理１２ｄ后，ＴＡ１植株的ＭＤＡ含量比对照分别上升了５０％和１９６％，ＴＢ１比对照分别上升了２８％和１５０％，野生型植株比对照分别上升了９２％和３７６％㊂总体来看，转基因拟南芥植株的耐盐性明显强于野生型拟南芥㊂图２㊀盐胁迫下转基因拟南芥的发芽率Ａ：转基因Ｔ３代和ＷＴ幼苗根系的生长情况；Ｂ：转基因Ｔ３代和ＷＴ幼苗的相对根长；Ｃ：转基因Ｔ３代和ＷＴ幼苗的侧根数㊂图３㊀盐胁迫下转基因拟南芥幼苗的根长和侧根数２５江㊀西㊀农㊀业㊀学㊀报㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀３１卷Ａ：盐胁迫后８ｄ和１６ｄ的植株表型；Ｂ：盐胁迫后１２ｄ的ＭＤＡ含量（鲜重）㊂图４㊀不同浓度ＮａＣｌ灌根对转基因拟南芥植株生长的影响２．５㊀转基因拟南芥植株激素含量的变化对转基因株系ＴＡ１和ＴＢ１的内源激素含量测定的结果（图５）表明：ＧＡ㊁ＺＲ㊁ＩＰＡ㊁ＩＡＡ的含量均表现为ＴＡ１＞ＷＴ＞ＴＢ１；ＢＲ含量表现为两个转基因植株高于ＷＴ植株，而ＪＡ－ｍｅ含量却同时低于ＷＴ；ＡＢＡ的含量呈现为ＷＴ＞ＴＢ１＞ＴＡ１㊂各激素含量在转基因植株和野生型植株间未表现出规律性的对应关系㊂图５㊀转ＣｍＳＡＭＤＣ基因拟南芥植株激素含量（鲜重）的变化３㊀讨论植物在长期进化中，常通过调控细胞内基因表达水平来调节胁迫应答保护机制㊂ＳＡＭＤＣ是Ｓｐｄ和Ｓｐｍ合成的关键基因，它涉及到众多植物对非生物胁迫和生物胁迫的抗性反应过程，在植物生长发育㊁代谢调控及胁迫响应中均具有重要的作用［１３－１５］㊂Ｈａｚａｒｉｋａ研究表明［４］，ＳＡＭＤＣ基因广泛涉及冷害㊁高温及盐胁迫等的抗性反应，且一些转ＳＡＭＤＣ基因的植物表现出了对外界胁迫的广谱抗性㊂ＲｏｙａｎｄＷｕ［１６］利用六倍体小麦的ＳＡＭＤＣ基因进行水稻转化，发现转基因水稻在盐胁迫下仍能正常生长发育，其内源亚精胺和精胺含量增加达３ ４倍㊂Ｆｒａｎｃｅｓｃｈｅｔｔｉ等［１７］将拟南芥的ＳＡＭＤＣ基因转入烟草，发现转基因烟草表现出了多种胁迫抗性㊂ＷａｉｅａｎｄＲａｊａｍ［１８］用人的ＳＡＭＤＣ基因转化烟草，发现转基因烟草对干旱和盐胁迫表现出更高的抗性㊂Ｐｅｒｅｍａｒｔｉ等研究还认为，ｓｐｄ和ｓｐｍ在抵御干旱胁迫中可能起着清除自由基的３５㊀９期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀刘长命等：异源表达ＣｍＳＡＭＤＣ基因拟南芥的耐盐性分析作用［１９］㊂本研究也发现，在１００或１５０ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ胁迫下，转ＣｍＳＡＭＤＣ基因拟南芥植株的根长和侧根数均多于野生型植株；在对４周龄转基因植株幼苗浇灌不同浓度的盐溶液时，发现转基因植株较野生型植株具有更强的耐盐性㊂在植物受到胁迫后，多胺在次生代谢调控及信号转导中起着重要的作用［２０］㊂本研究发现，转基因拟南芥植株在盐胁迫下的ＭＤＡ含量较野生型低，说明转ＣｍＳＡＭＤＣ基因拟南芥植株在受到外界胁迫时，为了减少活性氧积累造成的伤害，会激发多种信号物质，如多胺，协调各种活性氧清除系统，达到体内活性氧的代谢平衡㊂但是，ＣｍＳＡＭＤＣ基因和多胺类物质是如何参与植株的耐盐性调控还不得而知㊂今后有必要对多胺代谢调控网络，以及由其直接或间接调控的潜在抗性基因或物质进行进一步探讨㊂参考文献：［１］ＺｈｕＪＫ．Ｐｌａｎｔｓａｌｔｔｏｌｅｒａｎｃｅ［Ｊ］．ＴｒｅｎｄｓｉｎＰｌａｎｔＳｃｉｅｎｃｅ，２００１，６（２）：６６－７１．［２］ＳｈｅｎＷＹ，ＮａｄａＫ，ＴａｃｈｉｂａｎａＳ．Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔｏｆｐｏｌｙ⁃ａｍｉｎｅｓｉｎｔｈｅｃｈｉｌｌｉｎｇｔｏｌｅｒａｎｃｅｏｆｃｕｃｕｍｂｅｒｃｕｌｔｉｖａｒｓ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２０００，１２４（１）：４３１－４３９．［３］ＭｕｔｌｕＦ，ＢｏｚｃｕｋＳ．Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｂｅｔｗｅｅｎｓａｌｔｓｔｒｅｓｓａｎｄｌｅｖｅｌｓｏｆｆｒｅｅａｎｄｂｏｕｎｄｐｏｌｙａｍｉｎｅｓｉｎｓｕｎｆｌｏｗｅｒｐｌａｎｔｓ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，２００７，１４１（１）：３１－３９．［４］ＨａｚａｒｉｋａＰ，ＲａｊａｍＭＶ．ＢｉｏｔｉｃａｎｄａｂｉｏｔｉｃｓｔｒｅｓｓｔｏｌｅｒａｎｃｅｉｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｔｏｍａｔｏｅｓｂｙｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＳ－ａｄｅｎｏｓｙｌｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅｇｅｎｅ［Ｊ］．ＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙｏｆＰｌａｎｔｓ，２０１１，１７（２）：１１５－１２８．［５］ＨｕｓｓａｉｎＳＳ，ＡｌｉＭ，ＡｈｍａｄＭ，ｅｔａｌ．Ｐｏｌｙａｍｉｎｅｓ：ｎａｔｕｒａｌａｎｄｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄａｂｉｏｔｉｃａｎｄｂｉｏｔｉｃｓｔｒｅｓｓｔｏｌｅｒａｎｃｅｉｎｐｌａｎｔｓ［Ｊ］．ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＡｄｖａｎｃｅｓ，２０１１，２９（３）：３００－３１１．［６］ＳｈａｒｍａＳＳ，ＤｉｅｔｚＫＪ．Ｔｈｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅｏｆａｍｉｎｏａｃｉｄｓａｎｄａｍｉｎｏａｃｉｄ－ｄｅｒｉｖｅｄｍｏｌｅｃｕｌｅｓｉｎｐｌａｎｔｒｅｓｐｏｎｓｅｓａｎｄａｄａｐｔａｔｉｏｎｔｏｈｅａｖｙｍｅｔａｌｓｔｒｅｓｓ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＥｘｐｅｒｉ⁃ｍｅｎｔａｌＢｏｔａｎｙ，２００６，５７（４）：７１１－７２６．［７］ＷａｌｔｅｒｓＤＲ．Ｐｏｌｙａｍｉｎｅｓａｎｄｐｌａｎｔｄｉｓｅａｓｅｓ［Ｊ］．Ｐｈｙｔｏ⁃ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００３，６４：９７－１０７．［８］刘长命，咸丰，田治国，等．野生甜瓜 云甜－９３０ 与白粉病菌互作的基因表达特征［Ｊ］．植物病理学报，２０１３，４４（１）：６５－７３．［９］ＬｉｕＣＭ，ＬｉＸＬ，ＹａｎｇＲＰ，ｅｔａｌ．ＴｈｅｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅｒｏｌｅｓｏｆＳ－ａｄｅｎｏｓｙｌｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ（ＳＡＭＤＣ）ｇｅｎｅｉｎｍｅｌｏｎｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｔｏｐｏｗｄｅｒｙｍｉｌｄｅｗｉｎｆｅｃｔｉｏｎ［Ｊ］．ＨｏｒｔＥｎｖｉｒｏｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０１４，５５（６）：５５７－５６７．［１０］刘长命，杨瑞平，莫言玲，等．外源Ｓｐｄ预处理对甜瓜白粉病抗性及其内源多胺的诱导分析［Ｊ］．西北植物学报，２０１６，３６（１）：８５－９２．［１１］刘长命，张显，王永琦．甜瓜Ｓ－腺苷甲硫氨酸脱羧酶基因的克隆及白粉病诱导表达分析［Ｊ］．生物工程学报，２０１８，３４（４）：１－９．［１２］黄志．丛枝菌根真菌对甜瓜抗旱性的生理效应及分子机制的研究［Ｄ］．杨凌：西北农林科技大学，２０１０．［１３］ＷｉＳＪ，ＫｉｍＷＴ，ＰａｒｋＫＹ．ＯｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｃａｒｎａｔｉｏｎＳ－ａｄｅｎｏｓｙｌｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅｇｅｎｅｇｅｎｅｒａｔｅｓａｂｒｏａｄ－ｓｐｅｃｔｒｕｍｔｏｌｅｒａｎｃｅｔｏａｂｉｏｔｉｃｓｔｒｅｓｓｅｓｉｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｔｏｂａｃｃｏｐｌａｎｔｓ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＣｅｌｌＲｅｐｏｒｔｓ，２００６，２５（１０）：１１１１－１１２１．［１４］ＳｕｎｋａｒＲ，ＢａｒｔｅｌｓＤ，ＫｉｒｃｈＨ．Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆａｓｔｒｅｓｓ－ｉｎｄｕｃｉｂｌｅａｌｄｅｈｙｄｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅｇｅｎｅｆｒｏｍＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａｉｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｌａｎｔｓｉｍｐｒｏｖｅｓｓｔｒｅｓｓｔｏｌｅｒａｎｃｅ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＪｏｕｒｎａｌ，２００３，３５：４５２－４６４．［１５］高树涛，石生伟．盐胁迫对５种抗旱型小麦苗期生理特性的影响［Ｊ］．南方农业学报，２０１７，４８（８）：１３７４－１３８０．［１６］ＲｏｙＭ，ＷｕＲ．ＯｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＳ－ａｄｅｎｏｓｙｌｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅｇｅｎｅｉｎｒｉｃｅｉｎｃｒｅａｓｅｓｐｏｌｙａｍｉｎｅｌｅｖｅｌａｎｄｅｎｈａｎｃｅｓｓｏｄｉｕｍｃｈｌｏｒｉｄｅ－ｓｔｒｅｓｓｔｏｌｅｒａｎｃｅ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＳｃｉｅｎｃｅ，２００２，１６３：９８７－９９２．［１７］ＦｒａｎｃｅｓｃｈｅｔｔｉＭ，ＦｏｒｎａｌｅＳ，ＴａｓｓｏｎｉＡ，ｅｔａｌ．Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆｓｐｅｒｍｉｄｉｎｅｓｙｎｔｈａｓｅｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｎｐｏｌｙａｍｉｎｅｂｉｏｓｙｎ⁃ｔｈｅｔｉｃｐａｔｈｗａｙｉｎｔｏｂａｃｃｏｐｌａｎｔｓ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２００４，１６１：９８９－１００１．［１８］ＷａｉｅＢ，ＲａｊａｍＭＶ．Ｅｆｆｅｃｔｏｆｉｎｃｒｅａｓｅｄｐｏｌｙａｍｉｎｅｂｉｏ⁃ｓｙｎｔｈｅｓｉｓｏｎｓｔｒｅｓｓｒｅｓｐｏｎｓｅｓｉｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｔｏｂａｃｃｏｂｙｉｎ⁃ｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｈｕｍａｎＳ－ａｄｅｎｏｓｙｌｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅｇｅｎｅ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＳｃｉｅｎｃｅ，２００３，１６４：７２７－７３４．［１９］ＰｅｒｅｍａｒｔｉＡ，ＢａｓｓｉｅＬ，ＣｈｒｉｓｔｏｕＰ，ｅｔａｌ．Ｓｐｅｒｍｉｎｅｆａ⁃ｃｉｌｉｔａｔｅｓｒｅｃｏｖｅｒｙｆｒｏｍｄｒｏｕｇｈｔｂｕｔｄｏｅｓｎｏｔｃｏｎｆｅｒｄｒｏｕｇｈｔｔｏｌｅｒａｎｃｅｉｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｒｉｃｅｐｌａｎｔｓｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇＤａ⁃ｔｕｒａｓｔｒａｍｏｎｉｕｍＳ－ａｄｅｎｏｓｙｌｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，２００９，７０（３）：２５３－２６４．［２０］ＬａｒｈｅｒＦＲ，ＡｚｉｚＡ，ＧｉｂｏｎＹ，ｅｔａｌ．Ａｎａｓｓｅｓｓｍｅｎｔｏｆｔｈｅｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓｏｆｔｈｅｓｏ－ｃａｌｌｅｄｃｏｍｐａｔｉｂｌｅｓｏｌｕｔｅｓｕｓｉｎｇｉｎｖｉｔｒｏｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓｗｉｔｈｌｅａｆｄｉｓｃｓ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＰｈｙｓ⁃ｉｏｌｏｇｙａｎｄＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００３，４１：６５７－６６６．（责任编辑：黄荣华）４５江㊀西㊀农㊀业㊀学㊀报㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀３１卷。
小麦抗旱耐盐基因的鉴定和克隆
小麦抗旱耐盐基因的鉴定和克隆小麦作为我国主要粮食作物之一，一直面临着严峻的水盐胁迫问题。
为了提高小麦的耐盐、抗旱性能，科研人员们利用分子生物学和遗传学手段，研究小麦抗旱耐盐基因的鉴定和克隆，这将有助于提高小麦的品种改良水平，为我国的农业生产和国家粮食安全做出重要贡献。
I. 背景随着全球气候变暖和人口不断增长，农产品的需求量也在不断增加。
而水和盐的胁迫已成为限制作物生产的主要因素之一，尤其是对于我国干旱和半干旱地区种植的小麦来说，更是一个不可忽视的问题。
因此，研究小麦耐盐、抗旱基因的鉴定和克隆，具有现实意义和重要价值。
II. 鉴定方法小麦的耐盐、抗旱性状是由多个基因控制的复杂性状。
研究人员通常采用遗传分析和分子生物学技术相结合的方法，选择具有不同抗旱、耐盐性的小麦品种进行杂交，通过分离分析得出相关基因。
遗传分析方法主要包括连锁分析和QTL定位。
连锁分析是通过测量基因之间的连锁关系，确定某些基因与耐盐、抗旱性状之间的关联。
而QTL定位则是利用遗传分析和分子标记技术来鉴定影响耐盐、抗旱性状的定位序列。
分子生物学技术主要包括基因鉴定和基因克隆。
基因鉴定是通过PCR扩增、序列分析等手段，对分离出的关键基因进行验证并鉴定。
而基因克隆则是进一步开展分子克隆、转基因等研究，通过体系发育分析和表达特征研究等手段，确定关键基因的功能和作用机理。
III. 关键基因鉴定与克隆在小麦耐盐、抗旱基因鉴定与克隆方面，研究人员主要通过基因表达芯片、蛋白质组学和转录组学等手段，筛选出关键的表达基因和蛋白质、转录体，进而鉴定并克隆出与小麦耐盐、抗旱性状相关的重要基因。
既有研究表明，CDPKs（钙依赖性蛋白激酶）和MYBs（转录因子）等基因家族在小麦耐盐、抗旱性状中具有重要作用。
比如，研究人员确定了TaCPK2的编码区域，证明该基因能够增强光系统II的光合效率，从而促进小麦的生长发育与抗逆性能。
同时，通过对小麦Myb基因家族进行研究，研究人员发现TaMYB44和TaMYB10等基因的表达水平在小麦体内处于优势地位，对于小麦的耐盐、抗旱性状具有显著影响。
拟南芥转录因子MYB73抗核盘菌的分子机制研究
拟南芥转录因子MYB73抗核盘菌的分子机制研究由核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)引起的菌核病常在世界范围内的粮油、蔬菜等作物生产上造成严重的经济损失。
研究植物抗核盘菌的分子机制,对于培育作物抗核盘菌的新品种具有重要意义。
本研究中,我们分离鉴定了1个拟南芥抗核盘菌相关基因MYB73,并研究了MYB73在植物抗病反应中的功能,进一步利用酵母双杂交技术,获得MYB73互作蛋白,为完善植物的抗病信号网络和指导病害防治提供理论依据。
主要研究结果如下:1.通过对myb73进行抗病性测定,发现myb73接种核盘菌后其病斑面积明显大于野生型(WT),且myb73中核盘菌SsTUBULIN的表达水平也明显高于WT,明确了myb73为核盘菌敏感突变体。
进而获得MYB73超表达植株(OE),经抗病性测定发现MYB73超表达植株对核盘菌的抗性明显高于野生型,分析了接种核盘菌后WT,myb73和OE植株中POD活性和MDA含量,确定MYB73为拟南芥抗核盘菌相关基因。
2.对WT、myb73和OE 植株接种致病细菌丁香假单胞杆菌番茄致病变种(Pseudomonas syringae pv tomato DC3000,Pst DC3000),结果发现myb73对Pst DC3000抗性增强,且OE对Pst DC3000的感病程度与WT相似,Real time-PCR分析发现,Pst DC3000侵染WT 后,MYB73表达明显下调,抗病相关基因PR1,PR3,PR5和PDF1.2的表达在接种不同时间均出现上调,表明MYB73为拟南芥抗Pst DC3000的负调控因子。
3.RT-PCR分析发现,myb73中PR1和PDF1.2表达与WT中没有明显差别,表明MYB73基因功能缺失不直接影响PR1和PDF1.2的表达;myb73中SOD,POD和CAT 的表达低于WT,但PAL和PPO的表达高于WT,表明MYB73与抗氧化基因表达相关;myb73中NPR1表达被抑制,同时npr1中MYB73表达被抑制,表明MYB73与NPR1的表达具有相互协同作用;eds5,sid2,npr1和jar1突变体中,MYB73表达低于WT,同时水杨酸(salicylic acid,SA)处理eds5,sid2和nahG及茉莉酸(jasmonic acid,JA)处理jar1突变体后,MYB73表达被诱导,表明MYB73的表达依赖于EDS5,SID2,NahG和JAR1,且受SA和JA信号途径调控。
拟南芥转录因子AtMYB73转录活性区域分析及互作蛋白的筛选_樊锦涛
中国农业科学2014,47(23):4754-4762Scientia Agricultura Sinicadoi:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.23.020收稿日期：2014-07-11；接受日期：2014-08-26基金项目：国家自然科学基金（31200203）、河北省自然科学基金（C2012204032）、高等学校博士学科点专项科研基金（20121302120007）联系方式：樊锦涛，E-mail ：afanjintao@ 。
通信作者董金皋，Tel ：0312-*******；E-mail ：dongjingao@ ；通信作者邢继红，Tel ：0312-*******；E-mail ：xingjihong2000@拟南芥转录因子AtMYB73转录活性区域分析及互作蛋白的筛选樊锦涛1，贾娇2，蒋琛茜1，王冠宇1，张靖1，邢继红1，董金皋1（1河北农业大学真菌毒素与植物分子病理学实验室，河北保定071001；2吉林省农林科学院植物保护研究所，吉林公主岭136100）摘要：【目的】确定拟南芥抗逆转录因子AtMYB73的转录活性区域并筛选获得与其互作的蛋白，为进一步阐明AtMYB73调控拟南芥抗逆的分子机制奠定基础。
【方法】构建转录因子AtMYB73的酵母诱饵表达载体pAS1-AtMYB73，检测pAS1-AtMYB73的自激活性及其对酵母Y190的细胞毒性。
克隆AtMYB73的N 端区域（含有R2R3结构域）和C 端区域（不含R2R3结构域），检测AtMYB73的N 端和C 端的转录激活活性，分析AtMYB73自激活结构域的位置。
利用酵母双杂交技术，以AtMYB73为诱饵筛选拟南芥的cDNA 文库，将阳性克隆进行鉴定、测序；利用TAIR 数据库对筛选获得的AtMYB73的候选互作蛋白进行分析。
构建AtMYB73和F12F1.4的酵母双杂交载体pGBDT7-AtMYB73和pGADT7-F12F1.4，通过酵母双杂交技术，对其互作关系进行分析。
苹果砧木实生后代耐盐性鉴定的分子标记筛选及相关基因片段分析
缩略词目录Table of Abbreviations缩略符号英文名中文名A Adenine 腺嘌呤AFLP Amplified fragment length polymorphism 扩增片段长度多态性Acr Acrylamide 丙烯酰胺Persulfate 过硫酸铵AP AmmoniumBA 6-Benzylaminopurine 6-苄氨基嘌呤BSA Bulked segregation analysis 集团分离分析法Bis Bis-Acrylamide 甲叉双丙烯酰胺C Cytosine 胞嘧啶Bromide 溴代十六烷基三甲胺CTAB Cetyl-Trimethyl-AmmoniumDNA Deoxyribose nucleic acid 脱氧核糖核酸triphosphate 脱氧核糖三磷酸dNTP DeoxynucleosideEDTA Ethylenediaminetetra acetic acid 乙二胺四乙酸EST Expressed Sequence Tags 表达序列标记G Guanine 鸟嘌呤ISSR Inter-simple sequence repeat 简单重复序列间扩增MAS Molecular assistant selection 分子标记进行辅助选择acid 萘乙酸NAA 1-naphthlceticNCBI National Center for Biotechnology Information 美国国立生物技术信息中心OD260 Absorbance at 260nm 260nm处的吸光值OD280 Absorbance at 280nm 280nm处的吸光值ORFs Open reading frames 开放阅读框架PCR Polymerase Chain Reaction 聚合酶链式反应PVP-40 Polyvinylpyrrolidone40 聚乙烯吡咯烷酮RAPD Random Amplified Polymorphic DNA 随机扩增多态性DNA RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism 限制片段长度多态性RNase A Ribonuclease A RNA酶ASCAR Sequenced characterized amplified region 序列特征扩增区域SI Salt injury index 盐害指数SRAP Sequence-related amplified polymorphism 相关序列扩增多态性SSR Simple Sequence Repeats 简单序列重复STS Sequence Tagged Sites 序列标志位点T Thymine 胸腺嘧啶Taq Thermus aquaticus DNA polymerase 栖热水生菌DNA聚合酶TBE Tris/borate acid/EDTA buffer Tris/硼酸/EDTA缓冲液TE Tris base/EDTA buffer Tris/EDTA缓冲液TEMED N，N，N’，N’-tetramethylethylenediamine 四甲基乙二胺temperature 解链温度Tm MeltingTris Tris-hydroxymethyl-Aminomethane 三羟甲基氨基甲烷独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。
转Mn-SOD基因拟南芥、烟草与耐盐性的研究
中国农业大学博士学位论文转Ｍｎ－ＳＯＤ基因拟南芥、烟草与耐盐性的研究摘要盐、渍、干旱和低温等逆境胁迫是农业减产的重要原因。
长期而严重的环境胁迫会引起植物体内活性氧的积累，导致氧化胁迫，给细胞乃至整个植株带来严重伤害。
ＳＯＤ被认为是细胞内的维持活性氧平衡的关键酶，它能快速清除超氧阴离子，防止毒性最强的羟自由基的生成，清除活性氧的毒害。
Ｍｎ—ＳＯＤ位于真核细胞的线粒体中，尽管人们早己认识到线粒体是盐胁迫下最易受到伤害的细胞器之一，但是对于植物的线粒体内Ｍｎ．ＳＯＤ在盐胁迫条件下的适应性调节及其在植物耐盐性中作用还未有详尽的报道，而且在目前有限的研究结果中还存在很多的分岐。
为此本研究构建了ＣａＭＶ３５Ｓ启动子控制下的Ｍｎ．ＳＯＤ重组质粒，通过农杆菌的介导获得了转Ｍｎ－ＳＯＤ的拟南芥和烟草。
通过比较野生型与转基因的拟南芥和烟草的耐盐性、Ｍｎ—ＳＯＤ和其它抗氧化酶类活性和ＭＤＡ含量的差异、以及它们在盐适应反应中的变化，阐明Ｍｎ．ＳＯＤ在维持细胞内活性氧的平衡、保护细胞免受活性氧的伤害中的作用，为进一步改造植物耐盐品种提供理论依据。
／～√采用ＲＴ－ＰＣＲ技术克隆得到拟南芥Ｍｎ－ＳＯＤｅＤＮＡ全序列，并构建Ｍｎ－ＳＯＤ片段的原核表达载体，获得融合蛋白并制备抗体，抗体效价为１：１００００。
同时以Ｍｎ－ＳＯＤｅＤＮＡ全序列构建真核生物表达载体，分别转化拟南芥和烟草，通过ＰＣＲ、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交和ＳＯＤ活性鉴定，得到阳性转基因植株。
Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ鉴定转基因植株的线粒体中有外源的Ｍｎ—ＳＯＤ的表达。
野生型拟南芥和烟草组培苗经不同浓度ＮａＣＩ胁迫处理１５天后，发现拟南芥在】５０ｍｍｏｌ／ＬＮａＣＩ下烟草在２００ｍｍｏｌ／ＬＮａＣＩ下植株遇到明显伤害，生长受到抑制。
检测叶片Ｍｎ．ＳＯＤ活性，结果表明拟南芥和烟草叶片中Ｍｎ．ＳＯＤ活性受盐胁迫调节，在一定盐浓度范围内（烟草１５０ｍｍｏｌ／Ｌ、拟南芥１００ｍｍｏｌ／Ｌ）Ｍｎ—ＳＯＤ活性与盐胁迫程度正相关。
MYB111调控拟南芥盐胁迫反应的功能研究
MYB111调控拟南芥盐胁迫反应的功能探究引言：盐胁迫是植物生长和发育中常见的一种逆境条件。
受到盐胁迫的拟南芥植株往往会出现生长缓慢、叶片黄化、根系发育不良等症状。
为了应对盐胁迫导致的和稀失水的状况，植物通常会调整其基因表达，提高其逆境耐受性。
据了解，MYB家族是植物中重要的转录因子家族，参与了许多生长发育和应对逆境的过程。
本文旨在探究转录因子MYB111在拟南芥盐胁迫反应中的功能探究。
材料与方法：1. 拟南芥野生型植株及myb111突变体的构建和培育。
2. 盐胁迫处理。
将拟南芥植株分为两组，一组为常规水培，另一组在含有一定浓度的盐液中培育。
3. 测定株高和根长。
通过测量植株的株高和根长，了解盐胁迫对拟南芥生长发育的影响。
4. 比色法测定叶片叶绿素含量。
通过叶片提取液的比色法，测定叶绿素含量以评估拟南芥叶片的叶绿素降解状况。
5. 稀土矿位数法检测相对水分含量。
通过稀土矿位数法，检测盐胁迫下拟南芥叶片的相对水分含量。
结果与谈论：经过盐胁迫处理后，与野生型相比，myb111突变体植株的株聪明显降低，根长也较野生型植株短。
同时，叶片也呈现出明显的黄化现象，叶绿素含量较野生型植株降低，表明其叶片中的叶绿素降解速度加快。
另外，稀土矿位数法结果显示，myb111突变体叶片的相对水分含量较野生型植株低，说明其在盐胁迫下失去了保持相对水分的能力。
这些结果表明，MYB111在拟南芥盐胁迫反应中起到了重要的调控作用。
通过调控其他基因的表达，MYB111可能参与了拟南芥植株的生长发育以及对盐胁迫的适应反应。
例如，MYB111可能调控了感光色素合成相关基因的表达，导致叶绿素含量降低，从而引起叶片黄化。
此外，MYB111可能还调整了拟南芥根系的发育，使得根长较短。
而通过抑止其他逆境耐受相关基因的表达，MYB111可能导致了水分含量下降，从而使植株在盐胁迫下更易受损。
结论：通过对MYB111在拟南芥盐胁迫反应中的功能探究，我们发现该转录因子的调控在拟南芥植株的盐胁迫反应中至关重要。
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园艺学报，2016，43 (11)：2073–2080.Acta Horticulturae Sinicadoi：10.16420/j.issn.0513-353x.2016-0435；http：//www. ahs. ac. cn 2073MdMYB73的分子克隆及其在苹果愈伤组织和拟南芥幼苗中的盐抗性功能鉴定张全艳，刘晓，于建强，胡大刚*，郝玉金*（山东农业大学园艺科学与工程学院，作物生物学国家重点实验室，农业部黄淮地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室，山东泰安 271018）摘 要：从‘嘎拉’苹果中克隆了一个MYB转录因子基因（序列号：MDP0000894463）。
该基因包含长为729 bp完整的开放阅读框，编码243个氨基酸，预测其蛋白质分子量为26.34 kD，等电点为9.29。
系统进化树分析表明，这一MYB转录因子与拟南芥AtMYB73同源序列相似性最高，因此将其命名为MdMYB73。
功能域分析表明，MdMYB73蛋白含有保守的R2R3-type MYB绑定域。
荧光定量PCR分析表明，MdMYB73在苹果的各个组织均有表达，在叶片和花中表达相对较高；MdMYB73的表达明显受盐胁迫的诱导。
将异位表达MdMYB73的拟南芥幼苗进行抗盐鉴定，结果表明MdMYB73负调控拟南芥盐胁迫抗性；同时，AtSOS1，AtSOS3和AtNHX1抗盐相关基因的表达水平显著降低，表明MdMYB73可能负调控SOS反应，影响拟南芥抵抗高盐胁迫过程。
将MdMYB73基因遗传转化苹果愈伤组织，抗盐表型分析表明，MdMYB73过量表达也明显降低了转基因愈伤组织对盐胁迫的抗性。
关键词：苹果；MYB；MdMYB73；SOS；盐胁迫；基因表达中图分类号：S 661.1 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2016）11-2073-08 Molecular Cloning and Functional Characterization of MdMYB73 Reveals Its Involvement in Salt Tolerance in Apple Callus and ArabidopsisZHANG Quan-yan，LIU Xiao，YU Jian-qiang，HU Da-gang*，and HAO Yu-jin*（State Key Laboratory of Crop Biology，MOA Key Laboratory of Horticultural Crop Biology（Huanghuai Region）and Germplasm Innovation，College of Horticulture Science and Engineering，Shandong Agricultural University，Tai’an，Shandong 271018，China）Abstract：A MYB transcription factor（TF）（GenBank accession number：MDP0000894463）was cloned from Malus × domestica‘Royal Gala’. Sequence analysis showed that the length of this gene was 729 bp，which encoded 243 amino acids. It was predicted that the molecular mass of this protein was 26.34 kD，and pI was 9.29. Phylogenetic tree indicated that our cloned apple MYB TF exhibited the highest sequence similarity to Arabidopsis AtMYB73，so named MdMYB73. Analysis of functional domain showed that the MdMYB73 protein included the conserved R2R3-type MYB domain. Quantitative real-time PCR（qRT-PCR）analysis demonstrated that the MdMYB73 gene was extensively expressed in different tissues and organs of apple. Specially，the expression level of MdMYB73 was relatively higher in收稿日期：2016–07–27；修回日期：2016–10–10基金项目：国家自然科学基金项目（31601728）；山东农业大学科技创新基金项目（24024）* 通信作者Author for correspondence（E-mail：haoyujin@；fap_296566@）Zhang Quan-yan，Liu Xiao，Yu Jian-qiang，Hu Da-gang，Hao Yu-jin.Molecular cloning and functional characterization of MdMYB73 reveals its involvement in salt tolerance in apple callus and Arabidopsis. 2074Acta Horticulturae Sinica，2016，43 (11)：2073–2080. apple leaves and flowers. Meanwhile，the expression of MdMYB73 was obviously induced by salt stress. In addition，ectopic expression of MdMYB73 decreased salt stress resistance in Arabidopsis，indicating that MdMYB73 negatively regulated the salt tolerance. qRT-PCR analysis showed that the expression levels of salt stress-related genes AtSOS1，AtSOS3 and AtNHX1 were significantly decreased in transgenic Arabidopsis plants，suggesting that MdMYB73 negatively regulated SOS pathway. Finally，salt-tolerance assay indicated that overexpression of MdMYB73 remarkably decreased the tolerance of transgenic apple callus to high salinity，further supporting that MdMYB73 negatively control salt tolerance in apple.Key words: apple；MYB；MdMYB73；SOS；salt stress；gene expressionMYB转录因子广泛存在于动物和植物体中，参与植物生长发育过程、生物钟节律、气孔开闭、细胞识别、响应非生物胁迫等（Xu et al.，2015；Nguyen&Lee，2016）。
MYB转录因子具有高度保守的DNA binding结合结构域，含有1 ~ 4个串联的不完全重复单元（R）。
在植物体中，MYB 蛋白根据它含有的相邻不完全重复区域数将其划分为不同的亚家族，即R1R2R3-MYB、R2R3-MYB、R1-MYB和4R-MYB（Xu et al.，2015）。
目前研究表明，一些R2R3-MYBs类的转录因子参与到调控花青素的合成，例如AtMYB11/ PFG1、AtMYB12/PEG1、AtMYB111/PEG3、AtMYB75/PAP1和AtMYB90/PAP2（Dubos et al.，2010)；一些R2R3-MYB转录因子调控花药发育，包括拟南芥中AtMYB21、AtMYB24、AtMYB57等（Song et al.，2011；Qi et al.，2015）；AtMYB5和TT2相互作用调控外种皮的分化（Gonzalez et al.，2009）。
MYB转录因子除了具有以上功能外，还是一类非常重要的逆境响应基因（Dubos et al.，2010）。
目前在很多物种中，例如拟南芥、小麦、烟草、水稻、大豆等模式植物中已经鉴定出一些MYB转录因子具有抵抗生物胁迫和非生物胁迫的功能。
例如水稻中OsMYB91参与盐胁迫抵抗力（Zhu et al.，2015）；棉花中GbMYB5提高植株的抗干旱能力（Chen et al.，2015）。
在拟南芥中，R2R3-MYB家族转录因子的功能涉及植物的生长发育、细胞形态的建成、初生和次生代谢及响应环境中生物和非生物胁迫等过程。
转录因子AtMYB73属于R2R3-MYB转录因子家族第22亚族，该亚族中AtMYB44、AtMYB77、AtMYB73和AtMYB70基因参与抵抗生物和非生物胁迫过程，并存在明显的共表达现象。
研究发现，AtMYB44、AtMYB77、AtMYB73均受病原菌、激素及机械损伤的诱导（Cheong，et al.，2002；Dubos et al.，2010；Jia et al.，2011；Kim et al.，2013）。
低温可以诱导AtMYB73长时间持续表达，推测AtMYB73在拟南芥抵抗低温胁迫过程中具有重要功能（Fowler & Thomashow，2002）。
对拟南芥进行脱水再复水试验，发现AtMYB73在脱水过程中的表达水平没有明显变化，而在复水过程会被显著诱导表达，表明AtMYB73参与调控拟南芥响应干旱胁迫过程（Seki et al.，2002）。
用300 mmol · L-1 NaCl处理拟南芥，AtMYB73的表达水平会随着时间的延长而增强，在6 h达到最大值；同时盐胁迫过程中SOS1和SOS3在myb73突变体中的表达水平明显增强，表明AtMYB73可能负调控SOS反应，影响拟南芥抵抗高盐胁迫过程（Kim et al.，2013）。