基于DIG_化学发光法的Southernblot方法优化
southernblot知识
一、Southern杂交问题1：电泳后发现凝胶中DNA扩散，导致结果难以确定，如何解决这一问题？解决方案：（1）在操作上：电泳时隔孔上样，电泳后要对凝胶及时处理使凝胶干燥；（2）琼脂糖的质量应该较好，尤其是不应含有内切酶，否则有时将使低拷贝数基因的杂交结果难以解释。
问题2：传统方法中转膜不完全的问题如何克服？解决方案：经典的向上转移法会使凝胶短时间内变薄,此时即使延长转移时间至24小时以上,也不能使大分子DNA良好地转移出去,因此,转膜不完全。
向下转膜法由于不需在吸水纸上增加重量,凝胶基本不变形；加之吸水纸的吸力与水受到的重力方向一致,故可以良好地完成DNA的转移,它不需要特殊的仪器,转移速度较快,转移效率高。
利用地高辛标记探针进行 Southern 杂交时，对于大于15kb的 DNA片断，转膜之前用盐酸进行脱嘌呤可以促进转膜效率, 但脱嘌呤过度可导致分子量相对较小的 DNA 被打断成过小的片段而难以和尼龙膜结合。
如果实验转膜过程中同时含有大于 15kb的DNA(通常为基因组)和小片段DNA(通常是基因组酶切产物)，那么在转移的过程中倾斜容器，仅使凝胶上半部分浸泡于盐酸，这样既可以提高大片断 DNA 的转移效率，又不会打碎小片段DNA。
另外，等采用琼指糖凝胶直接杂交的方法，来解决这一难题：以转基因鼠的检测为例，实验步骤如下：1.转基因鼠的建立：以鼠乳清酸蛋白(WAP)基因5’调控区指导人G-CSF 基因为构件，建立转基因小鼠。
转基因小鼠的检测采用剪取鼠尾DNA做Southern进行鉴定。
2.琼脂糖凝胶直接杂交:(l)用BanHI(150U)对由假孕鼠产生的仔鼠剪尾提取基因组DNA10μg酶切过液，取少量电泳检查酶切完全后，上样电泳8小时，(2)将电泳槽板连同凝胶置50℃放置3小时，用镊子轻轻揭起凝胶，放于变性液(0.5MNaOH，0.5MNaCl)20分钟，转置中和液(0.5MTrisHCl，0.15MNaCl)20分钟，将胶放于玻璃板上沥干液体，室温放置30分钟。
Southern blot
• ddH2O稍加漂洗后空气中自然干燥
实验步骤
六.杂交和洗膜
• 将尼龙膜放入杂交管内, 加预杂交液, 60℃封 闭6小时。
• 倒出预杂交液,加杂交液,60℃杂交过夜。 • 回收杂交液 (可重复使用), 将膜放在洗膜溶
液I中,室温洗2次,每次摇动5分钟。 • 再在洗膜溶液II中(60℃预热后直接倒进表面
16 μl 2 μl 2 μl
总体积
20 μl 总体积
20 μl
37℃保温1.5h。
实验步骤
二. 1％琼脂糖电泳
两组共用一块凝胶，共7个样
1.基因组DNA10 mg
组 2.酶切样品（1）
1
3.酶切样品（2）
4.阳性对照（pSV-c-myc重组质粒经BamH I 酶切 后的8.5 kb线性片段，10pg/ml, 10ml)
影响杂交的因素
4）杂交液的离子强度
低盐浓度时杂交率较低,随着盐浓度增加,杂交率增加(Na+ 的作用)
高浓度的盐使碱基错配的杂交体更稳定,当进行序列不完 全同源的杂交时,必须维持杂交液与洗膜液中较高的盐 浓度;
5）非特异性杂交反应：预杂交的作用
杂交前封闭膜上非特异性杂交位点,减少其对探针的非特 异吸附
实验步骤
• 切除多余凝胶，小心地将凝胶放在滤纸上，赶 走滤纸与胶之间的气泡
实验步骤
• 再将与胶大小相同的尼龙膜放在胶上，同样不 能有气泡，然后放上三张浸湿的滤纸，赶走气 泡
实验步骤
• 紧贴凝胶四周各放一张X光片
实验步骤
• 小心蒙上一张比搪瓷盘大的保鲜膜。保鲜膜要 紧贴滤纸，但不能让滤纸移动
实验步骤
Hale Waihona Puke 1d检测（杂交条带通过抗-DIG-碱性磷酸酶及其酶底物显色）
southern blot 杂交
Sourthern 杂交（1）DIG-DNA标记：a）取1 μg的模板DNA加入灭菌双蒸水至16 μL体积；b）将16 μL的模板DNA置于100℃水浴变性10 min，之后迅速置于冰上冷却；c）加入4 μL混匀后的DIG-High Primer，混合均匀后离心，置于37℃水浴20 h 以上；d）65℃水浴10 min终止反应。
（2）基因组DNA的酶切消化、电泳以及变性：a）用限制性内切酶酶切基因组DNA（30~60 μg），点样跑胶以较低的电压3 v/cm电泳酶切样品；c）将凝胶转移至含1.5 mol/L NaCl，0.5 mol/L NaOH的变性液中，室温轻轻振荡30 min，使凝胶中的基因组DNA变性（注意中间可以换液1次）；d）倒去变性液，用去离子水清洗3次，然后加入0.5 mol/L Tris-HCl，1mol/L NaCl（pH8.0）的中和液室温轻轻摇动洗涤30 min。
（3）DNA转膜：a）将带电荷的尼龙膜漂浮于含去离子水的平皿中，直至尼龙膜完全浸湿，然后转移至碱性转膜缓冲液（0.4M NaOH, 1M NaCl）中浸没5 min；b）在水平玻璃板放一张厚的滤纸（20 cm × 20 cm）作为滤纸条，待完全湿润后，用玻璃棒轻轻滑动以赶走气泡；c）从转膜缓冲液中取出浸泡过的凝胶，置于滤纸条的中央，用玻璃棒轻轻滑动，使得凝胶与滤纸条之间没有气泡；d）用塑料薄膜封闭凝胶的边缘，确保尼龙膜的边缘不能与滤纸条接触，然后吸取转膜缓冲液将凝胶表明湿润，再将尼龙膜置于凝胶上面，确保尼龙膜与凝胶之间无气泡；e）再取两张与尼龙膜同等大小的厚的滤纸置于尼龙膜的上面，用玻璃棒轻轻滑动赶走气泡；f）剪取一叠同等大小的纸巾置于两张滤纸上，再在上面平放一玻璃板，用400 g砝码压平稳，静置转移约12~24 h，期间需要频繁更换纸巾数次；h）弃纸巾、凝胶以及滤纸，在尼龙膜上用铅笔标记加样孔的位置以及方向，然后浸没于中和缓冲液（0.5M Tris-HCl, 1M NaCl）中，达30min，注意中间换洗1次，然后在10× SSC溶液中浸泡5min；i）将尼龙膜置于1张干净的滤纸上，自然风干；j）将尼龙膜置于紫外交联仪（70000 μJ/cm2）照射，正面朝上，使得DNA 固定交联到尼龙膜上。
生物化学实验southwestern blotting实验步骤 -回复
生物化学实验southwestern blotting实验步骤-回复生物化学实验：southwestern blotting实验步骤南方杂交（southwestern blotting）是一种用于检测DNA结合蛋白的实验技术。
在这项实验中，我们可以确定哪些蛋白与DNA结合，进而揭示它们在基因调控和细胞功能方面的作用。
下面将详细介绍southwestern blotting实验的步骤。
步骤一：制备RNA和DNA探针在进行southernwestern blotting实验之前，首先需要制备两个探针：一个用于检测特定DNA序列的DNA探针，另一个用于检测DNA结合蛋白的RNA探针。
DNA探针可以通过PCR扩增特定的DNA片段，然后用荧光标记的核苷酸或放射性同位素标记的核苷酸标记。
RNA探针则需要用逆转录酶将RNA反转录成cDNA，然后用荧光标记的核苷酸或放射性同位素标记的核苷酸标记。
步骤二：制备细胞核提取物1. 收集细胞：收集含有目标蛋白的细胞样品。
可以根据需要使用贴壁培养的细胞或悬浮培养的细胞。
2. 细胞裂解：将细胞悬液离心后，将细胞沉淀洗涤一次，然后用细胞裂解液裂解。
细胞裂解液可以根据实验要求自制，也可以购买商业提供的细胞裂解液。
3. 离心：将细胞裂解液离心，将上清转移至新离心管中。
4. 蛋白浓度检测：使用BCA或其他蛋白浓度检测试剂盒对离心上清中的蛋白质进行定量。
步骤三：SDS-PAGE凝胶电泳分离1. 准备SDS-PAGE凝胶：根据需要制备聚丙烯酰胺凝胶。
根据样品量的不同，选择不同的均聚丙烯酰胺百分比凝胶。
2. 添加样品和分子量标记物：向凝胶槽中加载约10-50微克的蛋白样品，并加入适当的分子量标记物。
3. 开始电泳：将凝胶槽放入电泳槽中，并加入足够的电泳缓冲液。
启动电泳仪，并根据需要调整电压和电流。
4. 疏水处理：电泳结束后，将凝胶浸入缓冲液中，使凝胶疏水。
步骤四：转移蛋白到NC膜1. 混合转移缓冲液：根据实验需要制备转移缓冲液。
DIG标记与检测
D i a g n o s t i c s绿色环保的DIG 检测技术邹 嵘, Ph.D资深技术顾问, Roche 亚太技术支持中心 免费服务电话：800 820 0577电子邮箱：asc.support@D i a g n o s t i c s内容概要•DIG 系统介绍•DIG 系统的应用•DIG 标记试剂盒的选用•DIG 检测产品的选用•DIG 实验结果D i a g n o s t i c sSouthern/Northern 实验中同位素应用•同位素辐射，损害健康 •探针有效时间短由同位素半衰期决定，不能反复使用•专用同位素实验室，配备安全防护设备，缺点D i a g n o s t i c s非同位素标记法 ---地高辛系统介绍独特性：只存在于洋地黄植物花与叶片中的类 固醇物质，抗原性：可产生抗体检测方法；光学显色法, 荧光或者化学发光法实用性：DIG 修饰后的UTP ， dUTP ，ddUTP可被RNA 转录酶，DNA 聚合酶，末端转移酶用于核酸链的合成 D. purpurea & D. lanataDIG 系统特点Biotin 特点几乎在所有的组织和细胞中内源性表达Biotin 的结合物Streptavidin ，经常与固体支撑物如 MTP 或膜非特异性结合，产生背景---特异性差D i a g n o ng Neo Poly (A) RNA loaded per laneA. probeDIG-labeled RNA 120 ng/mlFilm exposure: 30 min1 0.1 0.01 0.001 C. probeDIG-labeled DNA 50ng/mlFilm exposure: 30 min10 1 0.1 0.01 B. probe32P-labeled RNA 2 x 106 cpm/ml Film exposure: 16 hours1 0.1 0.01 0.001 D. probe32P-labeled DNA 2 x 106 cpm/ml Film exposure: 24 hours10 1 0.1 0.01显色时间短更敏感D i a g n o A S K i 80006990332P-labeled probe, 10 µg total RNA eachlane, exposure: 4hDIG-labeled probe, PCR derived.Exposure: 10 min.DIG-labeled probe, PCR derived.Exposure: 10 min.(Courtesy of U. Stoeckl, University of Regensburg, Germany) Panel A and B : Blots prepared according to protocol of U. Stoeckl Panel C : Blot prepared according to standard conditions,recommended by ROCHE Application LabCBA1 µg5 µg2,5 µg2,5 µg1 µg5 µg2,5 µg2,5 µgD i a g n o s t i c s(Courtesy of Dr. Peter Hloch, Univ. Homburg, Germany)9.5 7.5 4.4 2.41.3 kb9.5 7.5 4.4 2.41.3kbp68-cDNA probe (radioactive 1 day)p68-cDNA probe (DIG 5min)p68-intron 11 probe (DIG) b -actin probe (DIG)1st rehybridization 2nd rehybridization 3rd rehybridizationMTN 膜，2ug 总RNA膜最多可以反复使用20多次 !!!重复性: DIG 标记的探针D i a g n o s t i c sDIG 标记系统放射性同位素系统安全性 安全存在健康损害风险检测灵敏度 0.1pg for Southern blot好 检测曝光时间几分钟1天到几周探针稳定性> 1 year/半衰期 经济性探针能可以反复使用，好不能反复使用 / 差便利性操作说明完备，技术支持充分，不须特殊实验设备 无技术支持，专用实验室，人员培训上岗，废弃物专项管理DIG 系统的优势D i a g n o s t i c sDIG 标记系统的Southern-Blot 实验流程X-Ray Film32PTarget DNA MembraneX-Ray Film- C - G - T - G - A - T - A - G - C -A - C - U - A - T P PChemiluminescent DetectionCSPD / CDP-StarAntibody-Conjugate（AP 、ＰＯＤ）Labeled-ProbeDigoxigenin AlkalinePhosphataseSubstrateSubstrate32P 标记系统的Southern-Blot 实验流程D i a g n o s t i c s内容概要•DIG 系统介绍•DIG 系统的应用•DIG 标记试剂盒的选用•DIG 检测产品的选用•DIG 实验结果D i a g n o s t i c sDIG 系统的主要应用In Situ Hybridization•检测基因易位,扩增,缺失•基因定位，作图•诊断肿瘤、遗传疾病膜杂交Southern BlotsNorthern Blots Colony Hybr .• 基因组扫描• cDNA 文库筛选• 药物残留检测• 转基因效果检测• 临床疾病监测 (Fragile X)• mRNA 表达分析• mRNA 剪切形式分析D i a g n o s t i c s内容概要•DIG 系统介绍•DIG 系统的应用•DIG 标记试剂盒的选用•DIG 检测产品的选用•DIG 实验结果D i a g n o DNA 探针：稳定，操作方便 随机引物法（ Klenow 酶）缺口平移法 （DNA Polymerase I / DNase I ）PCR 扩增法 （Taq DNA Polymerase, Pwo DNA Polymerase or Expand HF polymerase ）RNA 探针: 灵敏度高，特异性好体外转录法 （SP6-, T3- or T7 RNA Polymerases ）Oligonucleotide 探针：也可化学合成 3´-末端标记或加尾法 （Terminal Transferase ）方法 1：探针的类型D i a g n o In Situ Hybridization• 缺口平移法• 体外转录法• 随机引物标记法• 寡核苷酸3…末端/加尾标记• PCR 方法膜杂交Southern BlotsNorthern BlotsColony Hybr .• PCR 方法标记• 随机引物标记法• PCR 方法• 寡核苷酸3…末端标记• 体外转录法• 寡核苷酸3… 末端标记• 寡核苷酸3‟加尾标记方法 2：探针的用途D i a g n o 模板: 目标基因片段 量：10ng~3ugKlenow 酶六碱基随机引物标记的探针片段(size range: 300-800-1500 bp ）未标记的目标片段优点：产量高，灵敏度高（0.10~0.03pg)应用：Southern blot 、Northern blot 、文库筛选、点杂交DIG High Prime DIG Standard R.P.L a b e l e d D N A (n g )2500 2000 1500 1000 500 0 0200400 6008001000min产品名称Cat. No. DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I11 745 832 910 DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit II11 585 614 910D i a g n o 模板: 质粒或基因组DNA 量：质粒 10pg~100pg ， 基因组DNA 1pg~50pgTaq Polymerase特异性引物 或 多克隆位点的通用引物标记好的探针 “Full -Size”初级延伸产物 (出现于线性扩增阶段!!!)优点：• 模板用量少，模板纯度要求低 • 实验优化简单• 产量高 （2ul / 102cm 膜杂交） • 适用于小片段探针的标记 (<100 bp)应用：Southern blot 、Northern blot 、 文库筛选、点杂交产品名称Cat. No. PCR DIG Probe Synthesis Kit11 636 090 910D i a g n o s t i c sDNA 探针合成-缺口平移法优点：• 能控制探针的长度 (对 ISH 实验特别重要） • 含有全模板序列的探针应用：ISH模板：质粒DNA 或 纯化后的大片段DNA 量：1ug产品名称 Cat. No.DIG-Nick Translation Mix 11 745 816 910不完全的DNaseI 酶切OH OHHOHOHOHO3’3’5’ HO5’ 3’ 5’OH3’ 5’OHDNA 聚合酶+DIG-dUTP3’ 5’OH3’5’ HO15 C 孵育1.5小时后，变性标记结束后，反应体系内探针量为1ug DNAD i a g n o s t i c sRNA 探针合成-体外转录法REpSPT 18/19insertpromoter包含目的DNA 的转录载体， 通过酶切进行线性化 模板量：质粒：1ug含启动子的片段：100~200ngSP6, T3 or T 7 RNA pol 。
DIG标记与检测
D i a g n o s t i c s绿色环保的DIG 检测技术邹 嵘, Ph.D资深技术顾问, Roche 亚太技术支持中心 免费服务电话：800 820 0577电子邮箱：asc.support@D i a g n o s t i c s内容概要•DIG 系统介绍•DIG 系统的应用•DIG 标记试剂盒的选用•DIG 检测产品的选用•DIG 实验结果D i a g n o s t i c sSouthern/Northern 实验中同位素应用•同位素辐射，损害健康 •探针有效时间短由同位素半衰期决定，不能反复使用•专用同位素实验室，配备安全防护设备，缺点D i a g n o s t i c s非同位素标记法 ---地高辛系统介绍独特性：只存在于洋地黄植物花与叶片中的类 固醇物质，抗原性：可产生抗体检测方法；光学显色法, 荧光或者化学发光法实用性：DIG 修饰后的UTP ， dUTP ，ddUTP可被RNA 转录酶，DNA 聚合酶，末端转移酶用于核酸链的合成 D. purpurea & D. lanataDIG 系统特点Biotin 特点几乎在所有的组织和细胞中内源性表达Biotin 的结合物Streptavidin ，经常与固体支撑物如 MTP 或膜非特异性结合，产生背景---特异性差D i a g n o ng Neo Poly (A) RNA loaded per laneA. probeDIG-labeled RNA 120 ng/mlFilm exposure: 30 min1 0.1 0.01 0.001 C. probeDIG-labeled DNA 50ng/mlFilm exposure: 30 min10 1 0.1 0.01 B. probe32P-labeled RNA 2 x 106 cpm/ml Film exposure: 16 hours1 0.1 0.01 0.001 D. probe32P-labeled DNA 2 x 106 cpm/ml Film exposure: 24 hours10 1 0.1 0.01显色时间短更敏感D i a g n o A S K i 80006990332P-labeled probe, 10 µg total RNA eachlane, exposure: 4hDIG-labeled probe, PCR derived.Exposure: 10 min.DIG-labeled probe, PCR derived.Exposure: 10 min.(Courtesy of U. Stoeckl, University of Regensburg, Germany) Panel A and B : Blots prepared according to protocol of U. Stoeckl Panel C : Blot prepared according to standard conditions,recommended by ROCHE Application LabCBA1 µg5 µg2,5 µg2,5 µg1 µg5 µg2,5 µg2,5 µgD i a g n o s t i c s(Courtesy of Dr. Peter Hloch, Univ. Homburg, Germany)9.5 7.5 4.4 2.41.3 kb9.5 7.5 4.4 2.41.3kbp68-cDNA probe (radioactive 1 day)p68-cDNA probe (DIG 5min)p68-intron 11 probe (DIG) b -actin probe (DIG)1st rehybridization 2nd rehybridization 3rd rehybridizationMTN 膜，2ug 总RNA膜最多可以反复使用20多次 !!!重复性: DIG 标记的探针D i a g n o s t i c sDIG 标记系统放射性同位素系统安全性 安全存在健康损害风险检测灵敏度 0.1pg for Southern blot好 检测曝光时间几分钟1天到几周探针稳定性> 1 year/半衰期 经济性探针能可以反复使用，好不能反复使用 / 差便利性操作说明完备，技术支持充分，不须特殊实验设备 无技术支持，专用实验室，人员培训上岗，废弃物专项管理DIG 系统的优势D i a g n o s t i c sDIG 标记系统的Southern-Blot 实验流程X-Ray Film32PTarget DNA MembraneX-Ray Film- C - G - T - G - A - T - A - G - C -A - C - U - A - T P PChemiluminescent DetectionCSPD / CDP-StarAntibody-Conjugate（AP 、ＰＯＤ）Labeled-ProbeDigoxigenin AlkalinePhosphataseSubstrateSubstrate32P 标记系统的Southern-Blot 实验流程D i a g n o s t i c s内容概要•DIG 系统介绍•DIG 系统的应用•DIG 标记试剂盒的选用•DIG 检测产品的选用•DIG 实验结果D i a g n o s t i c sDIG 系统的主要应用In Situ Hybridization•检测基因易位,扩增,缺失•基因定位，作图•诊断肿瘤、遗传疾病膜杂交Southern BlotsNorthern Blots Colony Hybr .• 基因组扫描• cDNA 文库筛选• 药物残留检测• 转基因效果检测• 临床疾病监测 (Fragile X)• mRNA 表达分析• mRNA 剪切形式分析D i a g n o s t i c s内容概要•DIG 系统介绍•DIG 系统的应用•DIG 标记试剂盒的选用•DIG 检测产品的选用•DIG 实验结果D i a g n o DNA 探针：稳定，操作方便 随机引物法（ Klenow 酶）缺口平移法 （DNA Polymerase I / DNase I ）PCR 扩增法 （Taq DNA Polymerase, Pwo DNA Polymerase or Expand HF polymerase ）RNA 探针: 灵敏度高，特异性好体外转录法 （SP6-, T3- or T7 RNA Polymerases ）Oligonucleotide 探针：也可化学合成 3´-末端标记或加尾法 （Terminal Transferase ）方法 1：探针的类型D i a g n o In Situ Hybridization• 缺口平移法• 体外转录法• 随机引物标记法• 寡核苷酸3…末端/加尾标记• PCR 方法膜杂交Southern BlotsNorthern BlotsColony Hybr .• PCR 方法标记• 随机引物标记法• PCR 方法• 寡核苷酸3…末端标记• 体外转录法• 寡核苷酸3… 末端标记• 寡核苷酸3‟加尾标记方法 2：探针的用途D i a g n o 模板: 目标基因片段 量：10ng~3ugKlenow 酶六碱基随机引物标记的探针片段(size range: 300-800-1500 bp ）未标记的目标片段优点：产量高，灵敏度高（0.10~0.03pg)应用：Southern blot 、Northern blot 、文库筛选、点杂交DIG High Prime DIG Standard R.P.L a b e l e d D N A (n g )2500 2000 1500 1000 500 0 0200400 6008001000min产品名称Cat. No. DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I11 745 832 910 DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit II11 585 614 910D i a g n o 模板: 质粒或基因组DNA 量：质粒 10pg~100pg ， 基因组DNA 1pg~50pgTaq Polymerase特异性引物 或 多克隆位点的通用引物标记好的探针 “Full -Size”初级延伸产物 (出现于线性扩增阶段!!!)优点：• 模板用量少，模板纯度要求低 • 实验优化简单• 产量高 （2ul / 102cm 膜杂交） • 适用于小片段探针的标记 (<100 bp)应用：Southern blot 、Northern blot 、 文库筛选、点杂交产品名称Cat. No. PCR DIG Probe Synthesis Kit11 636 090 910D i a g n o s t i c sDNA 探针合成-缺口平移法优点：• 能控制探针的长度 (对 ISH 实验特别重要） • 含有全模板序列的探针应用：ISH模板：质粒DNA 或 纯化后的大片段DNA 量：1ug产品名称 Cat. No.DIG-Nick Translation Mix 11 745 816 910不完全的DNaseI 酶切OH OHHOHOHOHO3’3’5’ HO5’ 3’ 5’OH3’ 5’OHDNA 聚合酶+DIG-dUTP3’ 5’OH3’5’ HO15 C 孵育1.5小时后，变性标记结束后，反应体系内探针量为1ug DNAD i a g n o s t i c sRNA 探针合成-体外转录法REpSPT 18/19insertpromoter包含目的DNA 的转录载体， 通过酶切进行线性化 模板量：质粒：1ug含启动子的片段：100~200ngSP6, T3 or T 7 RNA pol 。
日本血吸虫(中国大陆株)尾蚴的性别鉴定
登记序号项目编号科研设计书项目名称：日本血吸虫尾蚴性别鉴定应用技术的研究承担单位：单位地址：邮政编码：开户行：帐号： 1103021109000077488项目负责人：电话：职务职称：填报日期 2004年7月28日江苏省地方病协会二○○四年制一、立项依据：血吸虫是一具有两性染色体的吸虫，有8对染色体，其中雌性性染色体为异配子体（ZW），雄性为同配子体（ZZ）。
尽管雌性和雄性成虫阶段具有明显的性别二态性，可用肉眼区别，但在幼虫阶段即毛蚴、胞蚴和尾蚴阶段，无明显的性别二态性，肉眼难以区别。
传统动物感染方法，是在实验室内取感染了血吸虫的鼠或其它啮齿类动物的肝、肠或粪便收集虫卵，孵化毛蚴，用单只毛蚴感染单只钉螺，养殖筛选阳性钉螺，获得单性尾蚴，用以感染啮齿动物，待其发育至成虫阶段，解剖动物收集成虫，用肉眼或在解剖显微镜下根据形态学的差异，确定感染尾蚴性别。
然而，单性雌性尾蚴不能发育到完全成熟的成虫，给鉴别带来一定困难。
同时常规方法需要花费时间长，日本血吸虫从尾蚴感染动物到发育成熟至少需3周。
采用分子生物学的方法，可快速鉴定尾蚴的性别。
代表性差异分析（RDA）方法是基于递减杂交法，用于发现两DNA基因组群间差异，是一种改良的扣除杂交法，并可用于分离基因组间差异性片段。
由于血吸虫为两性染色体的吸虫，其雄性为同性配子体（ZZ），而雌性为异性配子体（ZW）。
RDA方法从宏观上看，系用雄虫染色体ZZ去扣除雌虫染色体中的Z，从而获得W染色体。
Drew A.C.等（1995）采用此方法分离出两段曼氏血吸虫雌性特异性序列，并将其制备成探针，用Southern blot 方法证实只与曼氏血吸虫雌性基因组DNA特异性杂交。
W1重复序列作为雌性特异性序列，存在于曼氏血吸虫波多黎各株生活史的各个阶段。
并根据曼氏血吸虫雌性该特异性序列W1设计出一对引物W1a和W1b。
直接加入该引物对单个尾蚴作PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳。
结果雌性尾蚴呈现扩增产物PCR-W1条带，雄性尾蚴不呈现扩增条带。
生物化学实验southwestern blotting实验步骤
生物化学实验southwestern blotting
实验步骤
Southwestern blotting 是一种用于检测蛋白质与 DNA 相互作用的技术，以下是该实验的基本步骤：
1. 制备 DNA 探针：选择你感兴趣的 DNA 片段，并使用放射性同位素（通常是 32P）或荧光标记对其进行标记。
2. 制备蛋白质样品：将待检测的蛋白质样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离，并通过电转移将蛋白质转移到硝酸纤维素膜或 PVDF 膜上。
3. 膜的预处理：将转移后的膜在Blocking buffer 中孵育，以封闭非特异性结合位点。
4. 杂交：将标记的 DNA 探针与膜上的蛋白质进行杂交。
可以在杂交缓冲液中进行，通常在 42°C 下孵育过夜。
5. 洗膜：在杂交后，用 washing buffer 洗涤膜，以去除未结合的 DNA 探针。
6. 检测：使用放射性自显影或荧光检测方法，检测膜上结合的 DNA 探针。
7. 结果分析：通过观察膜上的杂交信号，确定哪些蛋白质与标记的 DNA 探针发生了相互作用。
需要注意的是，Southwestern blotting 实验步骤可能因具体的实验条件和目的而有所不同。
在进行实验之前，建议仔细阅读相关的实验手册和文献，并根据实际情况进行适当的调整和优化。
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n9 Forward CATGGGAATAGATCTGATACC 59
Reverse CAAAATCGAAATAGCGAAATTC 55
a1 Forward ATTTTCAAGTGGATGAGATCGG 59
Reverse GATCACAGAATCCATTGACAGC 61
a6 Forward TATTTCTCATTCACAAATC
收稿日期： 2011-02-22 基金项目： 国家转基因生物新品种培育科技重大专项（ 2008ZX08005-004） 作者简介： 张晓，男，博士研究生，研究方向： 植物基因工程； E-mail： enerrgy@ 126． com 通讯作者： 郭三堆，男，研究员，研究方向： 棉花基因工程研究； E-mail： gsdui@ mail． caas． net． cn
1 061 463
1 304 687 221
1 393 625 791 559 470 333
1． 1． 3 试剂与仪器 DIG high prime labeling and detection starter kit II 购自 Roche 公司。EcoR I，Hind III 限制性内切酶购自 Promega 公司。Taq DNA 聚 合酶购自天根生物公司。琼脂糖购自西班牙。其它 化学试剂购自北京拜尔迪生物技术公司，均为分析 纯。尼龙膜 Hybond-N + 购自 Amersham 公 司； 凝 胶 回收试剂盒购自 Axygene 公司。DNA ladder 0331 购 自 Fermentas 公司。紫外交联仪为 CL-1000 Ultraviolet Crosslinker（ 美国 UVP 公司） 。紫外分光光度计 为 ND-1000（ 美国 NanoDrop 公司） 。 1． 2 方法 1． 2． 1 棉花基因组 DNA 提取 改良的 CTAB 法［2］
关键词： Southern blot DIG 标记 化学发光法 尼龙膜 探针
Optimization of Southern Blot Analysis Based on DIG-Chemiluminescent Detection
Zhang Xiao1，2 Zhang Rui1 Yu Yuanhua2 Shi Ji1 Meng Zhigang1 Sun Guoqing1 Zhou Tao1 Guo Sandui1
（ 1 Biotechnology Research Institute，National Key Facility of Crop Gene Resources and Genetic Improvement，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081； 2 College of Life Science，Changchun University of Science and Technology，Changchun 130022）
·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN
2011 年第 9 期
基于 DIG － 化学发光法的 Southern blot 方法优化
张晓1，2 张锐1 于源华2 史计1 孟志刚1 孙国清1 周焘1 郭三堆1
（ 1 中国农业科学院生物技术研究所 国家农作物基因资源与遗传改良重大科学工程，北京 100081； 2 长春理工大学生命科学技术学院，长春 130022）
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin
2011 年第 9 期
表 1 探针名称及引物序列
探针 引物
引物序列（ 5'→3'）
Tm（ ℃）
产物大 小（ bp）
cb Forward GCATTTGATAGATTATCCAAC 55
Reverse GAATGGGCGTTATGGCAAAG 60
49
Reverse AGCATCATTCAAGTAAATACAG 55
a9 Forward ATGTTAGAAGGTGCAAAATCA 55
Reverse AAAACGAATGAGATCAGAAAG 55
c1 Forward CCACAAGGATATAGGGACTC 60
Reverse GATTGTTACGACCACGAAGAAAC 61
Key words： Southern blot hybridization DIG labeling Chemiluminescence Nylon membrane Probe
Southern blot 方法是分子生物学中的一项基本 技术，它在检测目的基因拷贝数、鉴定转要想得到理想的结果，往往费 时费力。传统 Southern blot 分析的探针通常是用32 P 或35 S 标记。近年来，生物素、DIG 等非放射性标记 物越来越多地用来标记核酸探针，克服了放射性同 位素标记技术的固有缺点，并且能够得到可以与放 射性标记 相 媲 美 的 结 果［1］。 由 于 非 放 射 标 记 法 所 需的步骤更多，因此要得到理想的结果就需要注意 更多的细节。本研究结合具体试验，从探针浓度、样
2011 年第 9 期
张晓等： 基于 DIG － 化学发光法的 Southern blot 方法优化
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1 /6（ 如果不需要指示条带的精确大小，Marker 探针 也可以不加） 。将杂交液用 0． 22 μmol / L 或 0． 45 μmol / L 滤膜进行过滤后，便可用来杂交尼龙膜。 1． 2． 8 杂交 杂交时间为 20 － 36 h，杂交液体积为 3． 5 mL /100 cm2 尼龙膜。探针浓度 25 ng / mL。即： 配置 3． 5 mL 杂 交 液，则 所 需 的 探 针 量 为 ［（ 25 × 3． 5） /2 300］× 20 = 0． 76 μL。 1． 2． 9 洗膜 2 × SSC /0． 1% SDS，室温，5 min，洗 两次。0． 5 × SSC /0． 1% SDS，66℃ ，每次 45 min － 2 h，洗两次。 1． 2． 10 封闭 100 mL blocking buffer，室温，1 h。 抗体： 1 ∶ 12 500，1． 6 μL antibody，20 mL blocking buffer。 1． 2． 11 洗 涤 washing buffer （ blocking buffer， 0. 3% Tween 20） 洗 2 h 后过夜。 1． 2． 12 加反应底物 洗涤完成后，将膜浸到 detection buffer 中充分浸透，然后尼龙膜放到保鲜膜 上，迅速均匀滴加上 CSPD，然后用尼龙膜覆盖保鲜 膜。置于 37℃ 培养箱中孵育 15 min。 1． 2． 13 压片 根据尼龙膜上信号强弱，将 X 光胶 片曝光 15 min － 2． 5 h。 1． 2． 14 X 光胶片的冲洗 显影 3 min； 定影 45 s， 然后用清水反复冲洗。 1． 2． 15 探针剥离方法 用尼龙膜完成对一个基因 探针的检测后，及时将之置于无菌水中浸泡 5 min， 然后放 入 杂 交 管 中，加 入 适 量 0． 2 mol / L NaOH / 0. 1% SDS 溶液，37℃ ，慢速转动，洗两 次，每 次 15 min； 用足量 2 × SSC 浸泡两次，然后用保鲜膜包裹， 置 4℃ 冰箱中保存。
摘 要： 目前，基于 DIG-化学发光法的 Southern blot 技术已在生物实验室广泛应用，但在试验过程中经常会遇到背景 黑、目的信号弱等问题，以致不能获得理想结果。在棉花线粒体基因组 RFLP 分析过程中结合前人经验对基于 DIG-化学发光 法的 Southern blot 技术在探针标记、探针浓度、探针剥离等方面进行了优化。优化后的方法重复性好，一张转好的尼龙膜最多 可以反复使用 11 次； 一份杂交液在两年内至少可以反复使用 5 次且不会明显降低杂交效果。
提取棉花嫩叶。液氮研磨时要做到快速充分，苯酚： 氯仿抽提时要多抽提几次，尽量使有机相和水相之 间无白色物质。 1． 2． 2 基因组的酶切 电泳检测提取的基因组 DNA，确保没有明显的蛋白、RNA 残留后，用紫外分 光光度计进行定量。每个样品取 40 μg 进行酶切， 酶切体系为 400 μL，其中包含 40 μL 10 × buffer，300 U 的限制性内切酶，4 μL 的 100 × BSA。酶切时，先 将基因组 DNA、ddH2 O、10 × buffer 加好，反复混匀， 然后再加 入 BSA 和 内 切 酶，再 充 分 混 匀［3］。然 后 37℃ 反应 6 － 8 h。期间每隔 2 h 弹动混匀一次。反 应结束后，取 5 μL 进行电泳检测，一是看酶切是否 完全，二是看各样品间亮度是否一致，若某个样品亮 度明显弱，则应再补切适量的基因组 DNA。若酶切 完全且各样品间 DNA 量一致，则用 0． 8 倍体积异丙 醇和 0． 1 倍体积 3 mol / L NaAc 沉淀酶切产物，然后 用 75% 乙醇涮洗 1 次，晾干后加入 30 － 40 μL ddH2 O 重溶，准备上样。 1． 2． 3 电泳 使用大孔梳齿和大胶板配胶，梳孔容 量要达到 40 μL 以上； 缓冲液为 1 × TAE，琼脂糖浓 度为 0． 8% ； 电泳条件为 35 V，16 h，即通常要跑足 500 Vh。 1． 2． 4 转膜 电泳结束后，用 0． 25 mol / L HCl 溶 液浸 泡 凝 胶 15 min 后，用 碱 变 性 液 （ 1． 5 mol / L NaCl，0. 5 mol / L NaOH） 处 理 1 h。然 后 使 用 BioRad 公司的 785 型真空转印仪进行转膜。转膜条 件： 5 inch Hg，75 min。10 × SSC 转膜，转完后，用 2 × SSC 涮洗尼龙膜 2 － 3 次。 1． 2． 5 紫外交联 将尼龙膜放到紫外交联仪中交 联 1 min，照射剂量大约为 0． 1 J / cm2 。 1． 2． 6 预杂交 交联结束后，直接将尼龙膜放入杂 交管中，加入预杂交液，在杂交炉中慢速转动 1 h。 1． 2． 7 探针的制备与处理 做 4 管 50 μL 的 PCR 反应体系来扩增目的基因片段，凝胶回收后用紫外 分光光度计进行定量，取 1 μg DNA 按照试剂盒中 的要求进行标记，标记条件为 37℃ ，20 h，期间弹动 混匀数次。同时，将 DNA Marker 也进行标记。标记 结束后，沸水浴处理 10 min，－ 20℃ 冻存备用。使用 时，将目的基因探针和 Marker 探针同时加到预杂交 液中，探针总浓度为 25 ng / mL，其中 Marker 探针占