胶质瘤细胞的培养及应用(终审稿)

胶质瘤细胞的培养及应

用

文稿归稿存档编号：[KKUY-KKIO69-OTM243-OLUI129-G00I-FDQS58-

胶质瘤细胞的培养及其应用

【摘要】胶质瘤细胞及组织培养的方法日益成熟，近些年来有了一些新的改进，已经广泛应用于胶质瘤实验的多方面研究：放疗、化疗、生物治疗等方面细胞学实验以及的建立。

【关键词】胶质瘤；；应用

据统计大约9%的人类肿瘤是脑肿瘤，而脑肿瘤中90%是胶质瘤［1］。脑胶质瘤是来源于神经上皮的肿瘤。在成人致命原发脑肿瘤中，高级别恶性胶质瘤最常见，确诊后中位生存期为9~12个月［2］，而且这些患者是经过积极治疗的，包括外科切除、放疗、化疗等。这些治疗的失败部分归咎于胶质瘤细胞侵袭性生长以及与周围正常脑组织交错，因而外科手术难以完全切除［3］；同时由于其异常的生物学特性，对放、化疗的抗拒，导致术后放、化疗失败；而且经常以同级别或高级别复发［4］。因此需要开辟新的治疗方法如生物治疗以及开发新的治疗药物，这些新的治疗方法及新药研制都需要以为依据。目前关于胶质瘤的常用研究方法有临床实验和基础实验。其中常用的基础实验有细胞实验以及动物实验。细胞学实验是基础，是利用培养的细胞进行实验，从细胞水平、分子水平揭示胶质瘤的细胞特性。它具有许多优点：可以长时间直接观察细胞的形态结构和生命活动［5］；研究的条件可以人为控制；研究的样本比较均一；研究的内容便于观察、检测和记录；可以用于许多领域的研究；相对而言比较经济。

1 胶质瘤的历史

1925年，Fish培养人恶性胶质瘤细胞获得成功，开创了体外研究胶质瘤的先河。Manuelidis 于1959年建立的世界上第1个人胶质瘤细胞株TC178，使体外长期连续动态观察胶质瘤细胞成为可能。 20世纪70年代以来，随着基础培养技术的迅猛发展，胶质瘤细胞的体外培养和克隆技术日趋成熟。近年来更是探索出许多新的培养方法，并应用于各项研究。目前胶质瘤的细胞培养技术比较成熟，已经建立了许多胶质瘤品系，如国内的人脑恶性胶质瘤体外SHG-44，是1980年取材于额叶的组织块经胰酶消化，单层静止培养而成的；细胞形态有星形、梭形；流式细胞光度仪测定，此细胞以四倍体为主，G1期占54.57%、S期占

15.17%、G2/M期占30.25%；免疫组化提示本细胞中存在S-100和GFAP；存于苏州大学附属第一医院神经外科细胞实验室。已经明确的胶质瘤细胞系（株）有许多，有人型、鼠型等，如U251、U87、U118、T98、

TJ899、TJ905、D54、NT325、CHG5、BT325、9L、C6等，而且今后还会不断建立新的品系。

2 目前常用培养方法及应用

现有的胶质瘤形式主要有：单层细胞培养、三维/立体培养及联合培养等。

2.1 单层及应用

传统意义上的单层细胞培养可以分为原代培养以及传代培养两类。前者是从供体获得组织后的初次培养，后者一般为利用现有的细胞系

（株）。两种培养方法各有优缺点，而且都已经得到广泛的应用。目前国内研究胶质瘤的

多采用细胞系，这主要是因为国内已经有许多胶质瘤细胞系，品系明确、易于培养；但连续性细胞系由于连续传代，细胞的形态、结构、功能发生了一定的变化，传代代数越多，发生的变化也越大，因而对实验结果有一定的影响。原代培养细胞技术相对要复杂得多，而且培养成功率较低，费时费力，因此不为许多研究者选用；但原代细胞刚离体，在形状、结构、功能等方面与体内细胞更接近，相对能更好地代表其来源组织的细胞类型及组织特异性，更好地保留胶质瘤的生物学特性，更接近也更能反映体内生长特性，所以原代培养出的细胞更适合做药物敏感实验、敏感实验等基础实验研究。原代单层细胞培养常用的方法有：组织块原代培养以及单细胞悬液法培养。前者是将胶质瘤组织块贴附在培养瓶（板）上，一般1~2天就会有细胞从组织块边缘游出，利用游出的细胞进行培养；后者是将组织块通过机械分离或酶消化法或者二者结合的方法分离成单细胞悬液，再接种于培养瓶（板）进行培养的方法［6,7 ］。传代单层的方法相对简单一些，只需将需要传代的细胞用胰蛋白酶消化吹打后，按需要接种于培养瓶内，补足培养液即可。以上为传统的细胞培养方法，在此基础上又发展出一些培养方法，如：单细胞分离培养法、加支持物培养法、球体细胞培养法、悬浮培养法等。单细胞分离培养也就是克隆培养，国内孙立军、黄强等［8］已经通过对SHG-44单克隆化，建立了具有低、中、高3种不同分化程度的人胶质瘤细胞株。加支持物培养法是为了研究或便于观察而预先向培养瓶/板

内加入支持物；如为了做细胞免疫组化，预先在培养板内放入小玻片，

再培养细胞，待细胞长在玻片上，取出固定、染色，也称为爬片。球体

细胞培养是将长成片的细胞移入不易贴附的底物上，则细胞片能卷聚生

长成球形。悬浮培养法，顾名思义就是让原本贴壁生长的细胞悬浮生

长。李茗初等［9］运用无血清培养基悬浮培养C6胶质瘤细胞系，从中

分离出该细胞系的。单层细胞培养是目前最常用的一种培养方式，

已广泛应用于各项基础研究。

2.1.1 在研究中的应用

目前胶质瘤细胞系众多，不同细胞系有各自不同的特点，如MO54对辐射敏感，而T98则对辐射抵抗［10］；U373、U251、U118MGT-98G表达突变型p53，而U87、D54、A172、CCF-STTG1细胞表达野生型p53。针对不同细胞系的特点，在

研究时可以根据需要而加以选择。Ostruszka等［11］在研究细胞周期进程中由2,2-二氟脱氧胞嘧啶核苷(2′, 2′-difluoro-2′-deoxycytidine; dFdCyd)引起的敏感性的作用中运用了2种人胶质瘤细

胞系U251和D54，并且发现U251对dFdCyd的细胞毒性更敏感，dFdCyd

也是U251的放射增敏剂，这种差异在于U251表达突变型p53，而D54细胞表达野生型p53，在D54细胞联合dFdCyd和电离辐射后，突出表现在

G1期阻滞。Chen等［12］在研究DB-67作为一种新型DNA拓扑异构酶具有靶向辐射增敏剂的研究中也运用了表达野生型p53和突变型p53的

D54-MG和T-98G胶质瘤。Shono等［13］采用将腺病毒载体-p53(Ad-p53)