5-分子标记及相关的实验技术.
高中生物分子标记实验教案
高中生物分子标记实验教案
实验目的：通过分子标记实验，掌握分子标记的原理和方法，了解如何利用分子标记技术进行生物研究。
实验材料：离心管、标记试剂、DNA溶液、电泳仪、琼脂糖凝胶板、UV灯等。
实验步骤：
1. 提取样品DNA：将待检测的样品（如甲骨文）通过DNA提取试剂盒提取出DNA溶液。
2. 标记DNA：在离心管中加入标记试剂和提取的DNA溶液，轻轻摇匀，放置一段时间进行反应。
3. 准备琼脂糖凝胶板：将琼脂糖溶液熔化后倒入凝胶板，待凝固。
4. 电泳分析：将已标记的DNA溶液加载到凝胶板上，进行电泳分析，根据标记物在凝胶板上不同位置形成的条带进行分析。
5. 结果分析：观察凝胶板上的条带图案，根据不同条带的位置和强度判断标记DNA的情况，并得出实验结论。
实验注意事项：
1. 操作过程要保持洁净，避免污染样品。
2. 操作中要注意避免标记物的接触，避免误伤。
3. 谨慎操作电泳仪，避免发生安全事故。
实验拓展：
1. 可以尝试不同的标记试剂，比较不同标记试剂的效果。
2. 可以通过改变电泳条件，比如电场强度和运行时间，观察对分子迁移的影响。
实验总结：
通过本实验，学生将掌握分子标记技术的基本原理和方法，培养实验操作能力和数据分析能力，为将来从事生物研究奠定基础。
分子标记技术的类型原理及应用
分子标记1.分子标记技术及其定义1974年,Grozdicker等人在鉴定温度敏感表型的腺病毒DNA突变体时, 利用限制性内切酶酶解后得到的DNA片段的差异, 首创了DNA分子标记。
所谓分子标记是根据基因组DNA存在丰富的多态性而发展起来的可直接反映生物个体在DNA水平上的差异的一类新型的遗传标记,它是继形态学标记、细胞学标记、生化标记之后最为可靠的遗传标记技术。
广义的分子标记是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质分子。
通常所说的分子标记是指以DNA多态性为基础的遗传标记。
分子标记技术本质上都是以检测生物个体在基因或基因型上所产生的变异来反映基因组之间差异。
2.分子标记技术的类型分子标记从它诞生之日起, 就引起了生物科学家极大的兴趣,在经历了短短几十年的迅猛发展后, 分子标记技术日趋成熟, 现已出现的分子标记技术有几十种, 部分分子标记技术所属类型如下。
2.1 建立在Southern杂交基础上的分子标记技术(1) RFLP ( Rest rict ion Fragment Length Polymorphism)限制性内切酶片段长度多态性标记；(2) CISH ( Chromosome In Situ Hybridization) 染色体原位杂交。
2.2 以重复序列为基础的分子标记技术(1) ( Satellite DNA ) 卫星DNA；(2) ( Minisatellite DNA ) 小卫星DNA;(3) SSR( Simple Sequence Repeat ) 简单序列重复, 即微卫星DNA。
2.3 以PCR为基础的分子标记技术(1) RAPD ( Randomly Amplif ied Polymorphic DNA ) 随机扩增多态性DNA；(2) AFLP( Amplif ied Fragment Length Polymorphism) 扩增片段长度多态性；(3) SSCP( Single Strand Conformation Polymorphism) 单链构象多态性；(4) cDNA-AFLP( cDNA- AmplifiedFragment Length Polymorphism) cDNA -扩增片段长度多态性；(5) TRAP( Target Region Amplified Polymorphism) 靶位区域扩增多态性；(6) SCAR ( Sequence Char acterized Amplified Region) 序列特征化扩增区域；(7) SRAP ( Sequencerelated Amplified Polymorphism) 相关序列扩增多态性。
分子标记SRAP实验报告
分子标记SRAP实验报告1. 引言分子标记是现代生物技术研究中的关键方法之一。
它可以通过扩增特定的DNA 序列，从而在种群遗传学、进化生物学、基因定位等方面提供有力的支持。
SRAP （Sequence Related Amplified Polymorphism）是一种新颖的分子标记技术，通过对相邻序列的扩增产物进行光谱分析，实现对DNA的多态性研究。
本实验旨在探究SRAP技术的可行性和应用价值。
2. 材料与方法2.1 实验材料- 植物样本：从绿色植物中收集新鲜叶片样本，保持样本的完整性和活性。
- 试剂：Tris-HCl缓冲液、EDTA、SDS、DTT、RNA酶A、异丙醇、等温酶I、DNA聚合酶、dNTP作为PCR反应的试剂。
- 仪器设备：离心机、PCR仪、凝胶电泳装置。
2.2 实验步骤1. DNA提取：将植物样本加入到400 μl Tris-HCl缓冲液中，加入100 μl 2% CTAB和10 μl 20 mg/ml RNA酶A，反复翻转均匀混合。
在65C水浴中孵育35分钟，加入1 ml 等温酶I和20 μl 10% SDS，并在37C水浴中孵育30分钟。
加入50 μl DTT，轻轻倒放翻转均匀后，在65C水浴中孵育30分钟。
加入500 μl 24:1等温酶I: P/C（φ=1）混合液，轻轻倒置混合。
沉淀离心，上清液移至新离心管，并加入等体积的异丙醇，轻轻翻转混合。
2. PCR扩增：将DNA样品加入PCR反应管中，配制成PCR反应液。
设置合适的PCR反应条件，进行PCR扩增。
3. 凝胶电泳：制备1%琼脂糖凝胶，并将PCR产物和DNA分子量标记物一同加入凝胶槽中。
进行电泳，观察扩增片段的大小和形态。
4. 光谱分析：将电泳结果照相，并进行光谱分析。
记录每个扩增片段的出现频率和多态性信息。
3. 结果与讨论通过以上步骤，我们成功获取了植物样本的DNA，并进行了SRAP-PCR扩增。
在凝胶电泳结果中，观察到了多个扩增片段，且大小和形态各异。
分子标记的实验原理及操作流程
AFLP分子标记实验扩增片段长度多态性 Amplified fragment length polymorphism（AFLP 是在随机扩增多态性（RAPD和限制性片段长度多态性（RFLP技术上发展起来的DNA多态性检测技术,具有RFLP技术高重复性和RAPD技术简便快捷的特点,不需象RFLP 分析一样必须制备探针，且与RAPD标记一样对基因组多态性的检测不需要知道其基因组的序列特征，同时弥补了 RAPD技术重复性差的缺陷。
同其他以PCR为基础的标记技术相比，AFLP技术能同时检测到大量的位点和多态性标记。
此技术已经成功地用于遗传多样性研究，种质资源鉴定方面的研究，构建遗传图谱等。
其基本原理是：以PCR（聚合酶链式反应为基础,结合了 RFLP、RAPD的分子标记技术。
把DNA进行限制性内切酶酶切，然后选择特定的片段进行PCR扩增（在所有的限制性片段两端加上带有特定序列的’接头”用与接头互补的但3-端有几个随机选择的核苷酸的引物进行特异PCR扩增,只有那些与3-端严格配对的片段才能得到扩增，再在有高分辨力的测序胶上分开这些扩增产物，用放射性法、荧光法或银染染色法均可检测之。
一、实验材料采用青稞叶片提取总DNA实验设备1. 美国贝克曼库尔特CEQ8000毛细管电泳系统,2. 美国贝克曼库尔特台式冷冻离心机，3. 美国MJ公司PCR仪,4. 安玛西亚电泳仪等。
三、实验试剂1. 试剂:请使用高质量产品，推荐日本东洋坊TOYOBO公司的相关产品DNA提取试剂盒；EcoRI酶,Msel酶,T4连接酶试剂盒；Taq 酶,dNTP, PCR reactio n buffer;琼脂糖电泳试剂：琼脂糖，无毒GeneFinder核酸染料替代传统EB染料;超纯水（18.2M ? • cm2. 其他实验需要物品微量移液枪（一套及相应尺寸Tip头,PCR管，冰浴等。
四、实验流程1、总DNA提取使用DNA提取试剂盒提取植物基因组DNA,通过紫外分光光度计检测或用标准品跑胶检测。
第五章分子标记辅助育种
遗传标记主要有四种类型:
形态标记（morphological marker） 细胞标记（cytological markers） 生化标记（Biochemical marker）
–同工酶:酯酶和过氧化物酶 –贮藏蛋白
分子标记（molecular marker）
分子标记的优越性：
直接以DNA形式出现，生物体的各个组织、 各发育时期均可检测到，不受季节、环境 的限制，不存在表达与否的问题；
l 基于Southern杂交的分子标记 基于PCR技术的分子标记
一、 基于Southern杂交的分子标记
限制性片段长度多态性 （Restriction Fragment Length Polymorphism） 小卫星DNA（Minisatellite DNA）
1 RFLP标记
RFLP标记的原理 植物基因组DNA上的
PCR-based markers
1 RAPDs
Anonymous markers - but can be converted to SCARs
Dominant markers - homozygotes cannot be distinguished from heterozygotes
Fast, easy and cheap - commercial primer sets available
植物分子育种
分子标记辅助育种
DNA标记辅助选择育种是利用与重要经济 性状连锁的DNA标记或功能基因来改良动、 植物品种的现代分子育种技术；
基因工程育种
转基因育种则是通过向受体植物转移有重要 功能的基因或一组功能相关的基因来改良植 物性状的育种技术。
分子标记辅助育种
第一节 遗传标记发展
分子标记的实验原理及操作流程
AFLP分子标记实验扩增片段长度多态性 Amplified fragment length polymorphism（AFLP 是在随机扩增多态性（RAPD和限制性片段长度多态性（RFLP技术上发展起来的DNA多态性检测技术,具有RFLP技术高重复性和RAPD技术简便快捷的特点,不需象RFLP 分析一样必须制备探针，且与RAPD标记一样对基因组多态性的检测不需要知道其基因组的序列特征，同时弥补了 RAPD技术重复性差的缺陷。
同其他以PCR为基础的标记技术相比，AFLP技术能同时检测到大量的位点和多态性标记。
此技术已经成功地用于遗传多样性研究，种质资源鉴定方面的研究，构建遗传图谱等。
其基本原理是：以PCR（聚合酶链式反应为基础,结合了 RFLP、RAPD的分子标记技术。
把DNA进行限制性内切酶酶切，然后选择特定的片段进行PCR扩增（在所有的限制性片段两端加上带有特定序列的’接头”用与接头互补的但3-端有几个随机选择的核苷酸的引物进行特异PCR扩增,只有那些与3-端严格配对的片段才能得到扩增，再在有高分辨力的测序胶上分开这些扩增产物，用放射性法、荧光法或银染染色法均可检测之。
一、实验材料采用青稞叶片提取总DNA实验设备1. 美国贝克曼库尔特CEQ8000毛细管电泳系统,2. 美国贝克曼库尔特台式冷冻离心机，3. 美国MJ公司PCR仪,4. 安玛西亚电泳仪等。
三、实验试剂1. 试剂:请使用高质量产品，推荐日本东洋坊TOYOBO公司的相关产品DNA提取试剂盒；EcoRI酶,Msel酶,T4连接酶试剂盒；Taq 酶,dNTP, PCR reactio n buffer;琼脂糖电泳试剂：琼脂糖，无毒GeneFinder核酸染料替代传统EB染料;超纯水（18.2M ? • cm2. 其他实验需要物品微量移液枪（一套及相应尺寸Tip头,PCR管，冰浴等。
四、实验流程1、总DNA提取使用DNA提取试剂盒提取植物基因组DNA,通过紫外分光光度计检测或用标准品跑胶检测。
分子标记种类及概述
分子标记种类及概述分子标记是一种在生物学和化学研究中广泛应用的技术，用于标记和追踪特定分子或化合物。
这些标记物能够提供关于分子的定位、数量、运动和相互作用的信息，从而帮助研究人员理解生物过程和化学反应的机制。
在本文中，将介绍几种常见的分子标记技术及其应用。
1.荧光标记：荧光标记是一种将荧光染料与目标分子结合的技术。
这些染料能够吸收特定波长的光并发射出不同波长的荧光。
通过在显微镜下观察荧光信号的强度和位置，研究人员可以了解分子在细胞或组织中的分布和动态变化。
荧光标记在细胞成像、蛋白质定位和分子交互作用研究等领域得到广泛应用。
2.放射性标记：放射性标记利用放射性同位素将目标分子标记。
这些同位素会发射出放射性粒子，可以通过放射性探测器进行检测和定量。
放射性标记在生物体内的追踪和代谢研究中具有重要作用。
例如，放射性同位素碘-125可以用于标记核酸和蛋白质，用于核酸杂交实验和蛋白质免疫沉淀等研究。
3.酶标记：酶标记是一种将酶与目标分子结合的技术。
酶可以催化底物的转化并产生可测量的信号。
常用的酶标记方法包括辣根过氧化物酶（HRP）标记和碱性磷酸酶（AP）标记。
这些标记在免疫学实验、分子诊断和酶联免疫吸附实验（ELISA）等领域得到广泛应用。
4.金属标记：金属标记利用金属离子将目标分子标记。
这些金属离子可以与特定配体结合形成稳定的络合物。
常用的金属标记包括铁、铑、镉等。
金属标记在蛋白质结构研究、药物输送和分子成像等领域具有重要应用价值。
5.生物素标记：生物素标记是一种将生物素与目标分子结合的技术。
生物素是一种小分子，能够与亲和力很高的亲生素结合。
通过将亲生素标记上荧光染料或酶等探针，可以实现对目标分子的标记和检测。
生物素标记在免疫组织化学、核酸杂交和蛋白质亲和纯化等领域得到广泛应用。
总之，分子标记技术是现代生物学和化学研究中不可或缺的工具。
通过将特定的标记物与目标分子结合，研究人员可以追踪和定量目标分子在生物体内的分布、运动和相互作用，从而深入了解生物过程和化学反应的机制。
分子标记技术
CAPACITY
RFLPs
HiSpeed sequ
DArT SNPs Multi-SSRs SRAP, TRAP SSRsAFLPs RAPDs
1985
1990
1995
2000
2 分子标记来源于DNA水平的突变
突变(Mutation)是指DNA水平的可遗传的变异，不
管这种DNA变异能不能导致可检测的表型或生化改 变，突变产生的变异是自然选择的基础，可遗传 的突变在群体中扩散从而产生多态性。
7. 近10年来，在人类基因组研究计划的 推动下，分子标记的研究与应用得到迅 速的发展。
分子标记的历史
第一代分子标记技术
RFLP （Restriction Fragment Length Polymorphism，限制性片段长度多态性）
第二代分子标记技术
RAPD（Random Amplified Polymorphic DNA，
RFLP
原理：
DNA
限制性内切酶酶切
电泳
转移到硝酸纤维素滤膜
同位素或非放射标记（如地高辛等）的探针杂交
胶片放射自显影，显示酶切片段大小
RFLP的应用
1.遗传学图的构建 结合RFLP连锁图， 任何能用RFLP探针检测出的基因及其 DNA片段都可以通过回交，快速有效地 进行转移。
2.基因定位 利用RFLP技术能够准确地 标记定位种质中的目标基因，结合杂交， 回交及组织培养等技术就可以快速有效的 将所需目标基因的DNA片段引入栽培品 种中，实现品种改良。
都有害； ✓ 探针的制备、保存和发放也很不方便； ✓ 分析程序复杂、技术难度大、费时、成本高。
2.随意扩增多态性DNA标记—RAPD
Random Amplified Polymorphismic DNA
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优点：多态性十分丰富，共显性。
缺点：引物设计比较困难。
4）AFLP标记
AFLP是基于限制性酶切和PCR的DNA标 记。 将样品DNA用限制内切酶进行酶切，再 对酶切片段进行有选择地扩增，检测其 多态性。
首先用两种能产生粘性末端的限制性内切酶将基
因组DNA切割成分子量大小不等的限制性片段，然 后将这些片段和与其末端互补的已知序列的接头连 接，所形成的带有接头的特异片段用作随后的PCR 反应膜板。 PCR引物5´端与酶切位点序列互补，3 ´端在酶切 位点后增加1-3个选择性碱基，使得一定比例的酶切 片段被选择地扩增，PCR产物在变性聚丙烯酰胺凝 胶电泳来分辨。
优点：多态性丰富。 缺点：引物需要标记。
5) CAPS标记
特异引物PCR与酶切相结合的一种标记。
根据RAPD标记或RFLP标记，设计特异引物进行PCR
扩增（SCAR，STS）。有时扩增片段大小无差异，此
时对扩增片段进行酶切，然后再通过琼脂糖或聚丙
烯酰胺凝胶电泳检测其多态性。
揭示的是特异PCR产物DNA序列内限制性酶切位点变 异的信息。
例1、CTAB法小量制备植物DNA
以小麦为例： CTAB缓冲液： 1.4M 山梨醇 10ml 1M Tris_Cl PH8.0 22ml 0.5M EDTA PH8.0 4.4ml CTAB 0.8ml N-LSC 1g 加水至100ml (1)取少许小麦叶片,放入1.5ml离心管中,加入液氮冷 冻,用带尖的玻璃棒研碎。 (2)加入500ul,65℃预热的缓冲液混匀,65 ℃水浴保温 20分钟。 （3）加入500ul氯仿-异戊醇（24：1），混匀。
1）DNA提取
CTAB法 根据试剂不同分为 SDS法 大量制备 根据实验目的不同分为 小量制备
1.1 CTAB法 CTAB是一种去污剂，它能与核酸形成复合物，这些复合 物在高盐溶液中(＞0.7 mol/L NaCl)可溶，并且稳定 存在。
在低盐条件下(＜0.5 mol/L NaCl)， CTAB与核酸的复合
第三节：分子标记
1、几种主要分子标记简介
2、植物核酸的提取
3、PCR技术 4、Southern杂交技术
1、几种主要分子标记简介
1）RFLP标记
RFLP标记基于Southern杂交技术。
限制性片段长度多态性。
这种多态性是由于限制性内切酶酶切位
点或位点间DNA区段发生突变引起的。
基因组酶切后，产生连续的大小不一的酶切片 段，电泳不能直接辨别某一片段大小的变化。 利用某一基因组DNA片段或某一cDNA片段克 隆为探针，通过Southern杂交进行检测。 优点：共显性，重复性和稳定性好。
物就会沉淀，而大部分蛋白和多糖仍溶于溶液中。
当材料中多糖少时，可不用 1% CTAB 沉淀缓冲液来
沉淀 DNA，在经氯仿-异戊醇(24∶1)抽 提之后，用 异丙醇或乙醇沉淀 DNA，使提取过程简化 用异丙醇或乙醇沉淀核酸，CTAB则溶于乙醇中。 CTAB法获得的核酸质量好，完整20-40kb，RNA少。
2.2 RNA电泳检测
电泳检测RNA的完整性 可采用变性胶或非变性胶检测.
非变性胶浓度要高1.2-1.4%，电压适当增加,快速结束, 可检测RNA的降解程度。
变性胶中RNA分子量才与泳动速度成正比，因此，变性 胶既能检测RNA的降解程度，又可检测大小。 例2 RNA变性胶电泳
(14) 风干,用50μｌＴＥ缓冲液溶解,存于-20℃备用。
2)RNA提取
与DNA提取相比，RNA提取的最大特 点是由于细胞中RNase非常稳定，能降 解RNA，必须采取措施，抑制 RNase活 性。
2.1提取RNA主要步骤： （1）所有的玻璃器皿，都在160℃烘8小时；塑 料器皿和所有用到的水都用0.5%的DEPC处理， 37 ℃，保温2天，然后高压灭菌。 （2）操作时戴一次性手套，并勤换，戴口罩。 （3）取植物样品时，迅速用液氮冷冻，放-70 ℃保存。 （4）将植物组织彻底磨碎。 （5）使蛋白变性，以便使蛋白和核酸分离开来， 所用试剂既能抑制Rnase活性，又能使蛋白变性。 （6）将RNA与DNA和蛋白质分离出来。
优点：1)引物已经商品化，覆盖整个基因 组，多态性高， 2)DNA量要求少，质量要求不高， 操作简单。 缺点： 1)通常为显性，无法区分显性纯合 体和杂合体。 2)引物较短，PCR结果不稳定。
3)SSR标记
SSR是特异引物的PCR标记。称为微卫星或简单重复序列。 重复单元为几个核苷酸，重复次数一般为10-50个。 由于基本单元的重复次数不同而形成SSR座位的多态性。 根据SSR座位两侧序列设计一对特异引物来扩增SSR序列。 经聚丙烯酰胺凝胶电泳，比较扩增带的迁移距离，就可 知某个SSR座位上的多态性。
(1)
取2ｇ新鲜幼嫩的叶片放入研钵中,加入液氮后快速、 充分研磨,待成极细的粉末状时迅速转入到50ｍｌ 离心管中。 在50ｍｌ离心管中加入10ｍｌ冰预冷的研磨缓冲 液,在涡悬振荡器上充分混匀。 于4℃,2700×ｇ离心20分钟,倒去上清液。 在沉淀中加入5ｍｌ裂解缓冲液,在涡旋振荡器上充 分混匀。 于65℃水浴锅中温育30ｍｉｎ。 加入5ｍｌ氯仿/异戊醇(24/1),并上下翻转以充分混 合。 于4℃,2700×ｇ离心5分钟。 转移上层水相至一新的50ｍｌ离心管中。 重复步骤7-9一次。
（3）琼脂糖凝胶法 1)琼脂糖电泳后胶孔处有 EB(溴化乙锭) 吸收，表明有多糖和蛋白。 2) 电泳呈弥散状，DNA降解。 3)未降解的 DNA，电泳时用标准量的 λDNA 进行定量。
1.4植物DNA提取注意事项
(1)液氮量要足够,研第一个样时，加入液氮后，先不磨， 等液氮挥发一些，研钵冻透，第二次加入液氮，研磨。
缺点：操作复杂，成本高, 需要标记探针。
2）RAPD 标记
随机引物PCR标记。 模板DNA扩增区段上引物结合位点碱基发生突 变或扩增片段之间发生插入突变或缺失突变， 因此表现为扩增产物的有无或片段的大小的 差异。 RAPD通常是显性的——片段的有无。 有时为共显性——片段的大小的差异。 RAPD所用引物通常为9—10个碱基，因此， PCR要用较低的退火温度（36℃ ）。
用提高盐浓度(KAc)和降 低温度(冰上 保温)的办法沉淀除去蛋白和多糖， 剩下的 DNA 再进一步纯化。
例2、 SDS法大量制备植物DNA（水稻）
SDS-DNA提取缓冲液： 100mM Tris-Cl pH8.5 500mM NaCl 50mM EDTA Ph8.0 1.5% SDS (1)取5g左右水稻叶片，剪成2cm左右，放入研钵中，加 入液氮冷冻，研磨至细粉状。 （2）将粉末导入50ml离心管中，加入10ml 65 ℃预热 的缓冲液，在65 ℃水浴中保温20分钟左右。中间混 样2-3次。 （3）离心管中加入5ml 5M KAC混匀，冰浴20分钟。 （4）加入10ml氯仿-异戊醇（24：1），轻轻混匀5分 钟，4000转/分离心10分钟。
1）去除酚类：
含有酚类杂质的 DNA 其沉淀物多呈黄色至褐色，难以溶 解或溶液色深。
抽提缓冲液中要加入一定量的
A：防止酚类氧化的试剂： 如β-巯基 乙醇、抗坏血酸、半 胱氨酸、亚硫酸钠、二硫苏糖醇。
B：与酚类结合的物质如PVP (聚乙烯吡咯烷酮)。
2）去除多糖： 如果材料中含有较多多糖，一般提取方法将很难去除。多 糖常与 DNA 共 沉淀 而使沉淀物呈胶冻状。 A：将简易提取法所得DNA溶于TE缓冲液中后(DNA的充 分溶解对于有效去除多糖和次生代谢杂质极为重要)，加入 适量4 mol/L NaCl，使溶液中NaCl 的终浓度达到1.0～2.5 mol/L， 然后再次用-20℃无水乙醇将DNA沉淀出来，经洗 涤风干后，溶于TE中。 B： 使 DNA 提取液中的多糖先沉淀。在提取液中加入 0.35 倍体积的无水乙醇，迅 速混匀，多糖会先沉淀。 C：沉淀 DNA 时，使多糖保留在溶液中。 a)高盐法：如用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入 1/2 体积的 5 mol/L NaCl，或加 NH4Ac 使终浓度为 10 mmol/L。 b)PEG(聚乙二醇，WT 8 000)代替乙醇沉淀 DNA： D：选择幼嫩组织。
(2)
(3) (4)
(5) (6)
(7) (8) (9)
(10) 加入2/3体积的冰预冷的异丙醇,并上下翻转以充分 混合,至-20℃2ｈ。 (11)于4℃,1200×ｇ离心10ｍｉｎ。
(12) 在一新管中加入20ｍｌ含80%乙醇15ｍｍｏｌ/Ｌ
ＮａＡｃ溶液,用玻棒将ＤＮＡ转入该管(如不能直接 用玻棒缠出,可离心后倒出上清,再在其中加入20ｍｌ 含80%乙醇15ｍｍｏｌ/ＬＮａＡｃ溶液),放置20ｍ ｉｎ后稍许离心,移走上清并吸出残存乙醇,室温干 (13) 加入1 0ｍｌＴＥ(10ｍｍｏｌ/ＬＴｒｉｓ-ＨＣｌ ＰＨ=8 0,1ｍｍｏｌ/ＬＥＤＴＡ)并加入终浓度为 20(ｇ/Ｌ的ＲＮａｓｅＡ,过夜。
例1：酸性异硫氰Βιβλιοθήκη 胍－苯酚－氯仿抽提法(Wadsworth et al.,1988) （1）取一定量植物材料于液氮中研碎， （ 2 ） 置 于 3ml 异硫氰 酸胍提取 液 (4M 异 硫氰酸胍 ， 0.1M巯基乙醇, 0.5%十二烷基肌氨酸钠 , 25mM柠檬 酸钠PH7.0)中，混匀。 （ 3 ）依次加入 0.3ml 2M NaAc （ PH 4.0) 、 3ml 酸性苯 酚和1ml氯仿/异戊醇,混匀。 （4）4 ℃，12000转/分，离心20分。 （5）用苯酚/氯仿/异戊醇再抽提一次。 （6）上清用等体积的异丙醇沉淀。 （7）将沉淀用70%乙醇洗涤一次。稍晾干。 （8）总RNA溶于无核酸酶的水中，于-70C保存。
6）SNP标记
基于单核苷酸多态性的DNA标记 鉴定SNP最直接的方法是通过设计特异PCR引物扩增
某个特定区域的DNA片段，通过测序和遗传特征的
比较来鉴定该DNA片段是否可以作为SNP标记。
SNP在基因组中广泛存在，数量丰富。