实验 磷酸甘油氧化
生化基础物质检测—脂类检测
主 要 试 TG试剂盒 剂 蒸馏水
主
采血器材
要
微量加样器
器
吸量管
材
恒温水浴箱
分光光度计
实验步骤
第一步
制备合格样本
第二步
反应液制备
第三步
混匀水浴测定
第四步
计算
第一步
用真空负压管采血，离心，待 用
第二步
取试管3支试管编号，按下表依次加样。
加入物 (μl) 蒸馏水 标准液 血清 工作液
空白管
20 － － 2000
第二步
洗板，阴性对照孔每孔加入PBS 50μl， 样品孔及空白孔每孔加入1:500稀释的兔 抗人AIF抗体工作液50μl。
第二步
每孔加TMB显色液 100μl，轻轻混匀 10s，置37℃暗处反应15-20min。每孔 加100μl 2mol/L H2SO4终止反应。
第二步
分别测450nm 吸光值W1和630nm吸光 值W2，最终测得的OD值为两者之差 （W1-W2），以减少由容器上的划痕或 指印等造成的光干扰。
误差分析
实验原理
空腹血浆脂蛋白主要为低密度脂蛋白（LDL）和高密度脂蛋白（HDL），PTA-Mg2+具有选择性 沉淀载脂蛋白为 apoB 的脂蛋白 LDL，则上清液为 HDL，HDL 以 HDL-C 表示含量。
胆固醇酯酶
胆固醇酯+H2O————→胆固醇+RCOOH
胆固醇氧化酶
胆固醇+O2————→△4-胆甾烯酮+H2O2
试剂和器材
主 要 apoa试剂盒 试 校准液 剂 蒸馏水
主
采血器材
要
微量加样器
器
吸量管
材
恒温水浴箱
磷酸甘油氧化酶法测定血清甘油三酯
磷酸甘油氧化酶法测定血清甘油三酯(Triglyceride,TG)一、实验目的测定血清中的甘油三酯含量，为临床诊断疾病提供依据。
二、实验原理血清中甘油三酯经脂蛋白脂酶（LPL）作用，可水解为甘油和游离脂肪酸(FFA)，甘油在ATP和甘油激酶(GK)的作用下生成3-磷酸甘油，再经磷酸甘油氧化酶作用生成磷酸二羟丙酮和过氧化氢，过氧化氢与4-氨基安替比林（4-APP）和4-氯酚在过氧化物酶（POD）作用下，生成红色醌类化合物，其显色程度与TG的浓度成正比。
三、试剂1.甘油三酯液体稳定酶试剂GOODs缓冲液（PH=7.2） 50 mmol/L脂蛋白脂酶≥4000 U/L甘油激酶≥40 U/L磷酸甘油氧化酶≥500 U/L过氧化物酶≥2000 U/LATP 2.0 mmol/L硫酸镁 15 mmol/L4-AAP 0.4 mmol/L4-氯酚 4.0 mmol/L2.三油酸甘油酯标准液 2.26 mmol/L（200mg/dl）准确称取三油酸甘油酯（平均分子量：885.4）200mg加Triton X-100 5ml，用蒸馏水定容至100ml，分装后，4℃保存。
四、实验步骤1.取三支试管按下表操作加入物空白管（B）标准管(S)测定管(U)血清（μl）——10标准液（μl）— 10 —蒸馏水（μl）10 ——酶试剂（μl） 1000 1000 1000混匀置37度水浴保温5分钟，以空白管调零，在波长500nm处测各管的吸光度。
五、计算血清TG(mmol/L)=A测定管/A标准管×标准液浓度六、参考范围正常成人血清TG为0.55~1.70 mmol/L；临界阈值：2.30 mmol/L；危险阈值：4.50 mmol/L。
七、临床意义1.血清TG增高常见于家族性脂类代谢紊乱、肾病综合征、糖尿病、甲状腺功能减退、急性胰腺炎、糖原积累病、胆道梗阻、原发性甘油三酯增高症、动脉粥样硬化等。
2.血清TG降低见于慢性阻塞性肺疾患、脑梗死、甲状腺功能亢进、营养不良和消化吸收不良综合征等。
运用甘油磷酸氧化酶法测定冰冻红细胞解冻后残留甘油的含量
结果
一、线性测定范围 测定 0.05 ~4.0 g/L 系列甘油标准液，甘油浓度在 （0.05~2.0）g/L 范 围 内 线 性 良 好 ，回 归 方 程 为 Y= 0.942 X + 0.0239，γ2 = 0.9994，见图 1。
6. 干扰试验：取 100 g/L 游离血红蛋白溶液 50 μl 分别加在不同浓度的甘油生理盐水 450 μl 中，使其 成为含游离血红蛋白 10 g/L 的 8 种样品；同时，加入 50 μl 生理盐水在不同浓度的甘油生理盐水 450 μl 中作为对照样品。每种样品测定 5 次。
7. 计算公式：甘油磷酸氧化酶法（GPO-PAP）甘 油 含 量（g/L）=（测 定 样 品 吸 光 度 值 ÷ 校 准 品 吸 光 度 值）×校准品浓度×测定样本稀释倍数。其中测定样 本稀释倍数是以样品处理的方式而定，钨酸钠裂解 法、三氯醋酸裂解法、上清液直接法的测定样本稀释 倍数分别为 6.9、2.0、1。
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测定甘油残余量的经典方法是过碘酸钠滴定法 [1]，但滴定法繁琐、费时，而且判断结果以颜色的改变 肉眼判断，会有个体差异。2012 版《血站技术操作规 程》[2]推荐甘油残余量的参考检测方法有过碘酸钠 法、折射仪测定法、甘油磷酸氧化酶法（GPO-PAP）二 步法等方法。甘油磷酸氧化酶法（GPO-PAP）为新推 荐的方法，文献少见报道。本研究根据 GPO-PAP 法 测定甘油三酯的部分原理，建立解冻去甘油红细胞 的残留甘油含量测定方法；并比较不同样本处理方 法（钨酸钠裂解法、三氯醋酸裂解法及制备后 2 h 直 接取上清液法）对酶法检测甘油的影响。报道如下。
甘油-3-磷酸氧化酶
甘油-3-磷酸氧化酶
甘油-3-磷酸氧化酶（Glycerol-3-phosphate oxidase）是一种酶，它在生物体的代谢过程中起着重要的作用。
这个酶存在于细胞质中，主要参与脂肪代谢途径中的一部分，被称为甘油磷酸途径。
甘油-3-磷酸氧化酶的主要功能是催化甘油-3-磷酸（一种中间代谢产物）的氧化反应。
在这个反应中，甘油-3-磷酸被转化为二磷酸甘油（一种能量储存分子）。
这个过程涉及到一个电子传递链，其中还涉及到另外两个辅助酶：辅酶Q和辅酶NAD+。
通过这个反应，甘油-3-磷酸氧化酶将电子从甘油-3-磷酸转移到辅酶Q和辅酶NAD+上，同时还释放出一个氧分子。
甘油-3-磷酸氧化酶的这个氧化反应在生物体中扮演着重要的角色。
它参与了三酰甘油合成的过程，这是将脂肪酸和甘油结合形成脂肪分子的关键步骤。
此外，它还参与了脂肪酸的氧化代谢，即将脂肪酸转化为能量的过程。
通过这些代谢途径，甘油-3-磷酸氧化酶帮助维持细胞内的能量平衡，并支持身体正常的能量代谢。
总结一下，甘油-3-磷酸氧化酶是一种参与脂肪代谢的酶，它催化甘油-3-磷酸的氧化反应，将其转化为能量储存分子二磷酸甘油。
这个酶在细胞内的能量代谢过程中起着重要的作用，帮助维持细胞内的能量平
衡。
甘油的氧化分解
段
22-磷酸甘油酸
生成一个NADH 生成一个ATP
2磷酸烯醇丙酮酸 2丙酮酸
生成一个ATP
COOH C==O
CH3
丙酮酸
CoASH
丙酮酸脱氢酶系
CO2
O
CH3-C-SCoA
乙酰CoA
NAD+ NADH+H+
此过程产生一个NADH，即2.5个 ATP
三羧酸循 环
O CH3-C-SCoA
CoASH
NADH
NAD+
草酰乙酸
柠檬酸
•柠檬酸 生成
三羧酸循环 （TCA）
顺乌头酸
苹果酸
H2O
草酰乙酸
再生
异柠檬酸
氧化脱羧
NAD+
NADH +CO2
延胡索酸
FADH2
FAD
琥珀酸 GTP 琥珀酰CoA
－酮戊二酸
NAD+
NADH +CO2
三羧酸循环中产生3个NADH，一个FADH2和一 个ATP。总计：3*2.5+1*1.5+1=10个ATP
制作人
甘油的氧化分解
CH 2OH ATP ADP CH 2OH NAD + NADH+H +CHOHFra bibliotekCHOH
甘油激酶
CH 2OH (肝 、 肾 、 肠 ) CH 2O
磷酸甘油脱氢酶
P
3-磷 酸 甘 油
CH 2OH CO
糖酵解 丙酮酸
CH 2O P 糖 异 生 糖 或 糖 原
磷酸二羟丙酮
消耗一个ATP产生 一个NADH，总计 1.5个ATP
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甘油的氧化分解
制作人
甘油的氧化分解
CH 2OH ATP ADP CH 2OH NAD + NADH+H +
CHOH
CHOH
甘油激酶
CH 2OH (肝 、 肾 、 肠 ) CH 2O
磷酸甘油脱氢酶
P
3-磷 酸 甘 油
CH 2OH CO
糖酵解 丙酮酸
CH 2O P 糖 异 生 糖 或 糖 原
磷酸二羟丙酮
精品课件
21，3-二磷酸甘油酸 第
三 23-磷酸甘油酸
阶
段
22-磷酸甘油酸
生成一个NADH 生成一个ATP
2磷酸烯醇丙酮酸
2丙酮酸
精品课件
生成一个ATP
COOH C==O
CH3
丙酮酸
CoASH
丙酮酸脱氢酶系
CO2
O
CH3-C-SCoA
乙酰CoA
NAD+ NADH+H+
此过程产生一个NADH，即2.5个 ATP
精品课件
生醇发酵
❖ 经以下二步
+ NAD+
消耗一个NADH。从甘油无氧氧化生成乙醇，产 生-1+2.5+2.5+2-2.5=3.5个ATP
精品课件
乳酸的生成—消耗2个NADH
乳酸脱氢酶
消耗一个NADH。从甘油无氧氧化生成乳酸，产生-1+2.5+2.5+2-2.5=3.5个ATP
精品课件
精品课件
三羧酸循 环
精品课件
O CH3-C-SCoA
CoASH
NADH
NAD+
草酰乙酸
柠檬酸
•柠檬酸 生成
血清甘油三酯测定标准操作规程
血清甘油三酯测定标准操作规程1.检验原理（酶法）甘油三酯经脂蛋白酯酶（LPL）作用，可以水解为甘油和游离脂肪酸，甘油在ATP和甘油激酶（GK）的作用下，生成3-磷酸甘油，再经磷酸甘油氧化酶（GPO）作用氧化生成磷酸二羟丙酮和过氧化氢，过氧化氢与4-氨基安替比咻（4-AA）及和3,5-二氯-2-羟笨磺酸钠（DHBS）在过氧化物酶（PoD）作用下，生成红色酶类化合物，其显色程度与甘油三酯的浓度成正比。
甘油三酯+。
2上J甘油+游离脂肪酸甘油+ATP—二→3-磷酸甘油+ADP3-磷酸甘油+O2磷酸二羟丙酮+乩。
22”2°2+4-AA+DHBS您.>红色醒类物质+4H2O-20°C可保存1年。
样本应避免反复冻融！4.检验方法；仪器法（详见DF-603∕DI-600标准操作规程）5参考范围：6.检验结果的解释：6.1样本含量超出线性范围时，建议用O.9%(W∕V)的氯化钠溶液稀释样本，最大稀释不超过5倍。
7. 2.单位换算:mg∕dl=mmol∕L×88.58.检验方法的局限性8.1结果的准确性依赖于仪器的校正和测定温度、时间的控制。
7.2若试剂浑浊，或以水空白在510nm处吸光度大于0.200时不能使用。
8.试剂性能指标8.1试剂外观：Rl和R2均为无色透明或淡黄色液体，无悬浮物及沉淀。
8.2装量：不低于标识值。
8.3空白吸光度：在51Onm处，光径ICm时，空白吸光度AWO.2008.4线性区间：试剂的线性区间为[1.13-9.04]mmol∕L,在此线性区间内：a)线性相关系数r应不小于0.9900；b)[1.13-2.03]mmol∕L区间内，线性绝对偏差不超过0.20mmol∕L;[2.03-9.04]umol∕L区间内，线性相对偏差不超过±10%。
8.5准确度：相对偏差应不大于±15%。
8.6分析灵敏度:在51Onm处,光径IenI时,测量已知浓度样品换算成ImmoI/L 的甘油三酯时，吸光度变化4A三ol∕L20.0058.7精密度8.7.1批内精密度：CV≤5%8.7.2批间精密度:R≤10%8.8稳定性：(2-8)C下，原包装存放的试剂有效期为12个月.取到期后1个月的试剂进行测试，应满足1-8.7.1的要求。
磷酸甘油酸脱水生成磷酸烯醇丙酮酸糖的无氧氧化
目录
• 磷酸甘油酸脱水生成磷酸烯醇丙酮酸 糖无氧氧化的定义和重要性
• 磷酸甘油酸脱水生成磷酸烯醇丙酮酸 糖无氧氧化的反应过程
• 磷酸甘油酸脱水生成磷酸烯醇丙酮酸 糖无氧氧化的生物学意义
目录
• 磷酸甘油酸脱水生成磷酸烯醇丙酮酸 糖无氧氧化的影响因素
• 磷酸甘油酸脱水生成磷酸烯醇丙酮酸 糖无氧氧化的研究前景
该过程在缺氧或厌氧环境下尤为重要，如肌肉收缩而使氧供应不足时，仍可进行糖 酵解以获取能量。
磷酸甘油酸脱水生成磷酸烯醇丙酮酸糖无氧氧化有助于维持生物体内糖的平衡，对 于生物体的生存和发育具有重要意义。
02
磷酸甘油酸脱水生成磷 酸烯醇丙酮酸糖无氧氧 化的反应过程
磷酸甘油酸的生成
磷酸甘油酸的生成
在糖酵解过程中，1,3-二磷酸甘油酸在磷酸甘油酸激酶的作用下 生成磷酸甘油酸。
pH值是影响酶活性的关键因素之一，适宜的pH 值能够使酶的活性得到最大发挥。
05
磷酸甘油酸脱水生成磷 酸烯醇丙酮酸糖无氧氧 化的研究前景
酶的发现与鉴定
酶的发现
随着生物技术的不断发展，越来越多的酶被发现并鉴定，其 中磷酸甘油酸脱水生成磷酸烯醇丙酮酸糖无氧氧化过程中涉 及的酶也逐渐被揭示。
酶的鉴定
通过生化实验、同位素标记等技术手段，可以鉴定出参与磷 酸甘油酸脱水生成磷酸烯醇丙酮酸糖无氧氧化的酶的种类和 性质，为进一步研究其反应机制和调控机制提供基础。
磷酸烯醇丙酮酸糖的性质与功能
磷酸烯醇丙酮酸糖是一种重要的糖类物质，它在维持细胞能量平衡、 参与细胞信号转导等方面发挥重要作用。
磷酸烯醇丙酮酸糖的代谢
磷酸烯醇丙酮酸糖可以进一步转化为其他糖类物质或参与其他代谢 途径。
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4.(trinder反应) H2O2+4-氨基安替比林+4-氯酚
生成醌亚胺（红色，500nm吸收峰）显色程度与TG浓度成正比。
[试剂器材]
1.R1试剂：Tris缓冲液(pH:7.6)
4-氯酚 亚铁氰化钾 150mmol/L 3.5 mmol/L 6umol/L
2. R2试剂：ATP≥0.15mmol/L
[临床意义]
1.血清TG升高见于：家族性脂类代谢紊乱、 肾病综合征、糖尿病、甲功减退、急性胰腺 炎、原发性甘油三酯增多症、动脉粥样硬化 等。 2.血清TG降低见于：脑梗死、甲亢、营养不 良、消化不良。
[注意事项]
• • •
• •
临床检测TG前要空腹。 若样品TG含量过高，要稀释样品。 样本中存在游离甘油，为得到真实甘油三 酯值，结果最好减去0.11 mmol/L. 操作时要防止试剂污染. 叠氮钠有腐蚀性,避免接触皮肤.
• 加入(ml) • 工作液 • H2O • 校准液 • 血清
空白管 1.0 0.01 —— ——
校准管 1.0 —— 0.01 ——
测定管 1.0 —— —— 0.01
分别混匀后在37℃保温10分钟。 （提前打开半自动生化分析仪），按程序操作进行 调零后读取吸光度值。
[参考范围]
＜1．71 mmol/L（一附院：0.4-1.71mmol/L） 临界值:1.71-2.26 mmol/L 高甘油三酯症＞2.26 mmol/L
GPO≥2500u/L 4-AAP(0.35mmol/L) POD≥150u/L LPL≥3000umol/L GK≥200u/L
3.甘油三酯标准液：2.26mmol/L 4.器材:半自动生化分析仪、微量加样器、试 管、水浴箱
[操作步骤]
1.打开水浴箱，预温37℃ 2.按试剂盒说明书，将R1和R2试剂混合制备 工作液。 3.按下表加入试剂：
实验 磷酸甘油氧化酶法测定血 清甘油三酯
[实验目的]
• 1、掌握磷酸甘油氧化酶法测定血清甘油三 酯操作方法和原理。 • 2、熟悉血清甘油三酯测定的临床意义。
[实验原理]
• LPL
1.甘油三酯+3H2O
GK
甘油+脂肪酸
2.甘油+ATP 3.甘油-磷酸二羟丙酮+H2O2 醌亚胺+2H2O+Hcl POD