菌种冷冻干燥保藏的影响因素
微生物菌种保藏的原理和方法
微生物菌种保藏的原理和方法一、原理：1.休眠状态：微生物菌种在低温下可进入休眠状态，减缓代谢活动，延长存活时间。
2.冷冻保存：通过降低温度到零下或较低的温度，减慢微生物体内化学反应速率，延缓其代谢活动和死亡过程。
3.干燥保存：通过去除菌种周围的水分，降低微生物体内化学反应速率，延缓其代谢活动和死亡过程。
4.冻干保存：先冷冻再干燥保存，通过冷冻降低微生物体内的水分活性，再通过干燥去除冻结水，使菌种能在实验室条件下保存较长时间。
二、方法：1.冷冻保存：（1）使用离心管或培养管制备菌种的蛋白质保护液，可以是细胞培养基、缓冲液等。
（2）将培养物转移到保护液中，使其悬浮均匀。
（3）加入保护剂，如甘油或DMSO（二甲亚砜），提高菌种的冷冻抵抗力。
（4）将混合物分装到小容器或冻存管中。
（5）使用特定的冷冻方案，将菌种快速冷冻，并存储在低温下，通常为零下80℃或更低的温度。
2.干燥保存：（1）用无菌技术转移到无菌条件下的试管中。
（2）将菌种培养在无菌的固体培养基上。
（3）收集培养物，将其平均分布在无菌试管或培养皿中。
（4）将试管或培养皿放在无菌的通风柜中，使培养物在无菌环境下干燥。
（5）将干燥的培养物贮存在干燥无菌容器中。
3.冻干保存：（1）将培养物转移到无菌离心管或培养皿中。
（2）使用细菌培养基将菌种制备为细菌悬浮液。
（3）在细菌悬浮液中加入保护剂，如蔗糖或甘露醇。
（4）将混合物分装到冻干瓶中。
（5）使用低温冷冻机将菌种冷冻为固体，再将其放入冻结干燥机中进行冻干。
（6）将冻干的菌种贮存在密封的冻干瓶中。
4.长期保存：通常，冷冻保存和冻干保存可以实现长期保存，但仍需定期检测和维护保存条件。
在微生物菌种保藏过程中，还需注意以下几点：1.选择合适的保存条件：根据菌种的特性和要求，选择适宜的保存方法和温度。
2.制备合适的保存液：保存液的配方和pH值应与菌种相适应，以保证菌种的存活和精确性。
3.保持无菌操作：在菌种保藏过程中，需保持无菌操作，以防止细菌污染。
菌种的储存条件
菌种的储存条件菌种的储存条件菌种是指具有一定遗传特性和生物学特性的一种微生物群体，是进行科学研究以及工业应用的基础。
为了长期保存和保持菌种的稳定性，在储存菌种时需要注意一些条件。
下面将详细介绍菌种的储存条件。
一、菌种的储存温度温度是影响菌种存活和保持活力的重要因素。
不同种类的菌种对于温度的要求不同，一般可分为冷冻储存和低温储存两种方式。
1. 冷冻储存：一般情况下，冷冻储存温度为-80℃，这是因为在这个温度下，细胞活动几乎停止，生化反应和分解过程也会减缓，从而能够稳定保存菌株。
此外，为了防止温度波动对菌种的影响，冷冻储存应该选择一个温度恒定的冷冻设备。
2. 低温储存：低温储存是相对于冷冻储存而言的，温度范围通常在-20℃至-70℃之间。
在低温下储存菌种，要求采用短时间转入低温环境，快速降温，并注意防止温度波动。
二、菌种的储存液菌种的储存液是将菌株保存在液体培养基中的一种方式，主要有菌种原液储存和冷冻储存液两种形式。
储存液的选择应根据不同菌株的要求、实验室设备和储存方式来决定。
1. 菌种原液储存：菌种原液储存适用于一些较为敏感的菌株，要求其活力尽可能得到保留。
菌种原液储存液一般由培养基和一定浓度的甘油混合而成，需要在使用前进行无菌处理。
2. 冷冻储存液：冷冻储存液中添加了一定比例的甘油或乳糖，可以减少冰晶对菌株的损伤，并增加了冷冻菌株的保活率。
此外，在选择储存液时还可以根据菌株特性添加一些物质，如保鲜剂、抗生素等，以提高菌株的储存质量。
三、菌种的储存容器菌种的储存容器对于菌株的保存稳定性以及长期保存的效果有着重要的影响。
常见的菌种储存容器主要有冷藏管、冷冻管、培养皿、冻干菌种等。
1. 冷藏管和冷冻管：冷藏管适用于低温储存，冷冻管适用于冷冻储存，可以防止水分和气体的渗透，并保持菌株的相对湿度。
在选择菌种储存管时，要注意其质量，确保无渗漏的情况下才能安全储存。
2. 培养皿：一般情况下，培养皿适用于菌种原液保存和短期保存。
菌种保藏
菌种保藏技术微生物的生长周期短，能用工业生产，但是人为的不断传代伴随而来的缺陷是容易引起遗传变异。
因此，从30年代开始就有菌种保藏的研究报告，并探索出了很多方法。
许多国家都已建立了专门的菌种保藏机构，如美国标准菌种收藏所（ATCC）、英国的国立标准菌种收藏所（NCTC）、大阪发酵研究所（LFO），还有全球性的世界微生物保存联盟（WFCC）。
这些机构都出售和交换菌种并出版菌种目录。
全世界的菌种保藏机构在300个以上。
我国在1979年成立了中国微生物菌种保藏委员会（CCCCM），制订了组织和管理条件并设立6个保藏中心。
菌种保藏的目的明确，在基础研究工作中，同一菌种在工作过程及结束后，均可获得重复的实验结果。
对于有经济价值的生产菌，需要保持其高产的性能。
通过生物工程技术所得的重组菌必须保持其遗传特性的稳定性。
总之在保藏期内，既要随时可以使用这些菌种，又要尽可能减少甚至不产生遗传变异。
1斜面保藏法这是一种最基本的方法，适用范围广，细菌、真菌及放线菌都可应用。
当微生物在适宜的斜面培养基和温度条件下生长良好后，一般在4℃左右可保藏3~6个月。
到期后重新移种一次。
当然保藏温度和时间都不是绝对的，个别菌种甚至在37℃保藏为宜，也有的需要1~2周传代一次。
这种方法的弊端是传代次数多了容易发生变异，如产生孢子能力下降、发酵能力减弱、毒力减小甚至基因失落等，传代次数多也容易使污染机会增加。
目前许多实验室采用密封性能较好的螺旋口试管替代传统的棉塞和减少碳水化合物的含量的方法，更有利于菌种的保藏。
2．穿刺保藏法此法是斜面保藏的一种改进方法，常用于保藏各种需气性细菌。
方法是将培养基制成软琼脂（琼脂含量为斜面的1/2，一般为1%），盛入1.2×10cm的小试管或螺旋口小试管内，高度为试管的1/3。
121℃高压灭菌后不制成斜面，用针形接种针将菌种穿刺接入培养基的1/2处。
培养后的微生物在穿刺处及琼脂表面均可生长。
然后覆盖以2~3mm的无菌液体石蜡。
菌种保藏和复苏-精简版
菌种的保藏与复苏一、菌种保藏（一）菌种保藏的定义菌种保藏（culture preservation）是指将微生物菌种用各种适宜的方法妥善保藏，避免死亡、污染，保持其原有性状基本稳定。
菌种保藏有许多的方法，其共同的目标是把菌株的优良性状保存下来，防止退化、死亡或杂菌污染。
（二）菌种保藏的原理微生物具有容易变异的特性，因此，在保藏过程中，必须使微生物的代谢处于最不活跃或相对静止的状态，才能在一定的时间内使其不发生变异而又保持生活能力。
低温、干燥和隔绝空气是使微生物代谢能力降低的重要因素，所以，菌种保藏方法虽多，但大都是根据这三个因素而设计的。
其中低温是保藏菌种的重要因素，也是常用的一种简单易行的方法。
在作低温保藏时，注意尽量不损伤细胞。
在缓慢冷冻时，胞外基质一般较快结冰而形成冰晶使基质浓度增高，造成细胞水分外渗而大量脱水，可能使细胞死亡。
如快速降温，胞内也很快形成冰晶，胞内外渗透压基本平衡，同时胞内冰晶较小，对细胞及原生质膜的损伤也较小，菌株不易死亡，影响也较小。
与低温相关的保藏方法，如冷冻干燥法、超低温保藏法等，都是利用低温条件下细胞与环境的特殊平衡原理而设计的。
（三）菌种保藏的方法本实验室常用菌种保藏方法主要有：1.低温保藏法将菌种接种在适宜的固体或液体培养基上，待菌生长充分以后，转移至4°C冰箱中保存。
平板在4°C存放时，最好用封口膜封口，不能长时间存放，一般7-10天，最多不应超过2个星期（特殊菌株可能时间更短，如铜绿假单胞菌只能存放3天）。
此法仅用于工作用菌种的短期保存，并应随时检查其污染杂菌和变异等情况，发现异常情况，应经灭活处理后销毁。
2.甘油冷冻管保藏法菌种长时间冻存应放于液氮或者-80 °C冰箱，利用10-15%的甘油进行冻存。
甘油的作用：甘油能够提高水体的粘稠度，使其冰点提高，防止细胞内部产生冰晶造成细胞的损害，一般使用甘油的终浓度在10%-20%，该范围外的浓度会对细胞产生毒性，如果是保存带有质粒的菌种建议甘油终浓度为8-10%，甘油浓度太高会导致质粒的不稳定。
常用的菌种保藏方法及其优缺点
常用的菌种保藏方法及其优缺点菌种保藏是微生物学研究中的重要环节，其目的是长期保存各类菌种以便于日后的使用和研究。
常用的菌种保藏方法有冷冻保存、制备淡防冻溶液、干燥保存、液氮冷冻保存、冷冻干燥保存等。
下面是这些方法的优缺点。
1.冷冻保存：冷冻保存是通过将菌种保存在低温下，在液氮冷冻罐中或冷冻干燥保存，常见的保存温度为-80°C或液氮温度。
其优点是保存方便，菌种保存时间相对较长；缺点是保存设备和条件要求较高，保存过程中会有一定的细胞破坏。
2.制备淡防冻溶液：制备淡防冻溶液是指制备一种富含保护物质的冻存液，然后将菌种悬浮于其中，并在-20°C或-80°C保存。
其优点是相对简单，易于操作以及相对较长的保存时间；缺点是需要特定的冻存液配方和保存温度。
3.干燥保存：干燥保存是将菌种培养物在低温和低气压下干燥，然后保存于干燥剂中。
其优点是较为简单，设备要求低，保存时间较长；缺点是保存后重新复苏的成功率较低，保存过程中可能会有一定的细胞破坏。
4.液氮冷冻保存：液氮冷冻保存是将菌种保存在极低温的液氮中，常见的保存方法是将菌种培养物按一定比例混合液氮与甘油，然后使用液氮保存。
其优点是保存时间极长，细胞破坏较小；缺点是保存设备和条件要求较高。
5.冷冻干燥保存：冷冻干燥保存是将菌种首先冷冻，然后通过真空干燥的方法去除水分，最后保存在干燥剂中。
其优点是保存效果稳定，保存时间长；缺点是设备要求较高，操控难度大。
总的来说，不同的菌种保藏方法有各自的优点和缺点。
选择合适的方法应根据菌种的特性、实验室的设备和条件、保藏期限以及实验目的等因素综合考虑。
同时，在进行菌种保藏时，应严格控制一系列的操作步骤，包括消毒、菌种的培养与保存温度的选择、保存条件的监测等，以确保菌种的质量和纯度，以及保存结果的可靠性。
简述菌种保藏的原理
简述菌种保藏的原理菌种保藏是指将某一种菌株保存在一定的条件下，以便长期保存和使用。
菌种保藏的原理是通过控制菌株的生长环境，使其处于休眠状态，从而延长其寿命。
菌种保藏的方法有很多种，包括低温冷冻、干燥、液氮冷冻、冷冻干燥等。
低温冷冻是最常用的菌种保藏方法之一。
其原理是将菌株在生长期的最佳时期，以适当的培养基和添加剂为基础，将其冷冻在-80℃的低温环境中。
在这种环境下，菌株处于休眠状态，细胞代谢减缓，细胞内的水分也减少，从而减少了细胞的损伤和死亡。
低温冷冻的优点是操作简单，保存时间长，适用于大多数菌株。
干燥是另一种常用的菌种保藏方法。
其原理是将菌株在生长期的最佳时期，以适当的培养基和添加剂为基础，将其干燥至完全干燥状态。
在这种状态下，菌株处于休眠状态，细胞代谢减缓，细胞内的水分也减少，从而减少了细胞的损伤和死亡。
干燥的优点是操作简单，保存时间长，适用于一些耐干燥的菌株。
液氮冷冻是一种高效的菌种保藏方法。
其原理是将菌株在生长期的最佳时期，以适当的培养基和添加剂为基础，将其冷冻在液氮中。
在这种环境下，菌株处于极低温度下，细胞代谢减缓，细胞内的水分也减少，从而减少了细胞的损伤和死亡。
液氮冷冻的优点是保存时间长，适用于大多数菌株，但操作较为复杂。
冷冻干燥是一种将低温冷冻和干燥结合起来的菌种保藏方法。
其原理是将菌株在生长期的最佳时期，以适当的培养基和添加剂为基础，先将其低温冷冻，然后将其干燥至完全干燥状态。
在这种状态下，菌株处于休眠状态，细胞代谢减缓，细胞内的水分也减少，从而减少了细胞的损伤和死亡。
冷冻干燥的优点是保存时间长，适用于一些耐干燥的菌株，但操作较为复杂。
菌种保藏的原理是通过控制菌株的生长环境，使其处于休眠状态，从而延长其寿命。
不同的菌种保藏方法有其各自的优点和适用范围，选择合适的方法可以有效地保护菌株并延长其使用寿命。
菌种保藏的名词解释
菌种保藏的名词解释引言：菌种保藏是一项重要的生物学技术，它的目的是为了长期保存和保护各种菌种资源，以便于在科学研究、工业应用和环境监测等领域发挥作用。
本文将对菌种保藏的概念、历史、分类方法和意义等方面进行解释。
一、菌种保藏的概念：菌种保藏是通过特定方法将菌种存放在适宜的条件下，以确保其生物特性和遗传信息的原始性、稳定性和可重复性的过程。
这一过程通过冷冻、低温冻干、冷冻真空蒸发等方式实现。
二、菌种保藏的历史：菌种保藏的历史可以追溯到19世纪，当时学者们开始意识到保存珍贵的微生物资源的重要性。
最早的菌种保存方法是在培养基中加入糖、甘油等物质，然后将其冷冻保存。
20世纪初期，科学家们开始探索新的保存方法，如液氮冷冻保存和冷冻干燥技术，这些方法大大提高了菌种的保存效果。
三、菌种保藏的分类方法：菌种保藏按照不同的原理和方法可以分为多种类型，常见的分类方法有以下几种：1. 冷冻保存：将菌种置于低温下，利用温度的作用阻止微生物的生长和代谢，从而实现保藏的目的。
冷冻保存是目前最常见和可行的保存方式，常用的冷冻保存温度为-80°C或液氮温度。
2. 冷冻真空蒸发：将菌种浸入保护剂中，通过真空蒸发的方式去除溶剂，然后将干燥的样品在低温下保存。
冷冻真空蒸发相比于冷冻保存具有更好的质量，但技术和设备要求较高。
3. 冷冻干燥：将菌种在负压条件下冷冻，在低温下使水分转移到固态，然后通过升温让水分升华脱离菌种，最终得到冷冻干燥菌种的产物。
此方法可以减小菌种在保存过程中可能出现的损伤。
四、菌种保藏的意义：菌种保藏对于微生物资源的保护和利用具有重要意义，其主要体现在以下几个方面：1. 保护遗传多样性：菌种保藏可以有效地保存各个菌种的原始特性和遗传信息，防止因自然灾害、环境变化或人类活动等原因而导致的遗传多样性的丧失。
2. 支持科学研究：保存菌种为科学研究提供了便利和资源，研究人员可以随时获取并使用特定的菌种进行研究，推动学术进展。
菌种保藏方法
菌种保藏方法菌种保藏是微生物学中非常重要的一项工作，它涉及到菌种的保存、保存条件、保存方法等方面。
而实验室中的菌种保藏主要是为了能够长期保存菌种，并保持其完整性和活力，以便之后的研究和应用。
一、保藏条件菌种的保藏条件直接关系到其保存的效果。
一般来说，菌种的保藏条件包括温度、湿度、光照、气体环境等方面。
1. 温度：温度是影响菌种保藏效果最为重要的因素之一。
一般来说，低温可以有效地延缓菌种的新陈代谢和老化速度，使其保存时间更长。
常用的温度包括4℃、-20℃、-70℃等，根据具体的菌种特性和实验需求选择合适的温度进行保存。
2. 湿度：湿度也是影响菌种保藏效果的重要因素之一。
过高或过低的湿度都会影响菌种的活力和完整性。
一般来说，菌种的保藏湿度应控制在相对湿度60%~80%之间，以保持菌种的适宜生长环境。
3. 光照：大部分菌种对光照较为敏感，因此在保存菌种时应避免暴露在强光下。
通常使用阴暗保存的方法，或用遮光布、铝箔等材料进行遮挡，以防止光照导致菌种的损害。
4. 气体环境：有些菌种对氧气、二氧化碳等气体的需求较高，因此在保存时需要考虑这些气体的供应。
常见的方法是使用密闭容器进行保存，或者通过调节氧气和二氧化碳的浓度来维持菌种的生长环境。
二、保藏方法菌种的保藏方法有多种，常见的包括冻干法、冷冻法、液氮法等。
1. 冻干法：冻干法是一种将菌种经过预处理后进行冻干保存的方法。
首先，将菌种培养在适宜的培养基上，然后添加一定浓度的保护剂，如甘露醇、赖氨酸等，以增强菌种的抗冻性。
接着，将培养基中的菌液进行冷冻处理，使之形成冻干物，最后将冻干物存放在干燥、密封的容器中，通常保存在低温环境下。
2. 冷冻法：冷冻法是将菌种直接保存在低温环境下的一种方法。
通常将菌液经过培养和增殖后，使用特殊的冷冻液冷冻保存，如甘油、乳糖等。
冷冻保存时，要确保液氮罐的密封性和温度稳定性，以防止菌种失活。
3. 液氮法：液氮法是一种将菌种保存在液态氮中的方法。
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微生物学通报ＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙＪＵＮ２０，２００８，３Ｓ（６）：９５９－９６２＠２００８ｂｙＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．ＣＡＳ菌种冷冻干燥保藏的影响因素常金梅１’２蔡芷荷２吴清平２张鲁斌Ｐ（１．南亚热带作物研究所湛江５２４０９１）（２．广东环凯微生物科技有限公司广州５１００７０）摘要：菌种资源保藏是微生物学及相关学科研究的基础。
冷冻干燥保藏法是菌种保藏最有效的方法之一，为进一步提高菌种保藏质量人们进行了大量的研究。
本文介绍了菌种冷冻干燥保藏方法的原理和优点，同时详细介绍了菌种冷冻干燥保藏方法的影响因素。
关键词：菌种保藏，冷冻干燥，影响因素ＩｎｆｌｕｅｎｃｉｎｇＦａｃｔｏｒｓｔｏＦｒｅｅｚｅ－ｄｒｙｉｎｇＰｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎｏｆＣｕｌｔｕｒｅＣＨＡＮＧＪｉｎ—Ｍｅｉｌ，２ＣＡＩＺｈｉ—Ｈｅ２ＷＵＱｉｎｇ—Ｐｉｎ９２ＺＨＡＮＧＬｕ．Ｂｉｎｌ＋（１．ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＳｏｕｔｈｅｒｎＳｕｂｔｒｏｐｉｃａｌＣｒｏｐｓ，Ｚｈａｎｊｉａｎｇ５２４０９１）（２．ＧｕａｎｇｄｏｎｇＨｕａｎｋａｉＭｉｃｒｏｂｉａｌＳｃｉ＆ＴｅｃｈＣｏ．，Ｌｔｄ．，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ５１００７０）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎｏｆｃｕｌｔｕｒｅｉｓｔｈｅｂａｓｅｏｆｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙｒｅｓｅａｒｃｈａｎｄｃｏｒｒｅｌａｔｉｖｅｓｐｅｃｉａｌｔｙ．Ｆｒｅｅｚｅ—ｄｒｙｉｎｇｉｓｏｎｅｏｆｔｈｅｍｏｓｔｅｆｆｅｃｔｉｖｅｍｅｔｈｏｄｓ．Ｍａｎｙｒｅｓｅａｒｃｈｅｓｈａｖｅｂｅｅｎｐｅｒｆｏｒｍｅｄｔｏｉｍｐｒｏｖｅｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｆｒｅｅｚｅ—ｄｒｙｉｎｇｍｅｔｈｏｄ．Ｔｈｅｐａｐｅｒｍａｉｎｌｙｄｅｓｃｒｉｂｅｓｔｈｅｐｒｉｎｃｉｐｌｅａｎｄａｄｖａｎｔａｇｅｏｆｆｒｅｅｚｅ—ｄｒｙｉｎｇ．Ｉｎａｄｄｉｔｉｏｎ，ｔｈｅｐａｐｅｒｉｎｔｒｏｄｕｃｅｓｔｈｅｉｎｆｌｕｅｎｃｉｎｇｆａｃｔｏｒｓｔｏｆｒｅｅｚｅ—ｄｒｙｉｎｇｍｅｔｈｏｄ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎｏｆｃｕｌｔｕｒｅ，Ｆｒｅｅｚｅ—ｄｒｙｉｎｇ，Ｉｎｆｌｕｅｎｃｉｎｇｆａｃｔｏｒｓ菌种保藏就是对活体微生物群体进行有效的保藏，其目的是利用一切条件使菌种不死、不衰、不变，以便于研究和应用。
至今保藏方法有２０多种，从总体上可分为４大类：传代法、干燥法、冷冻法及冷冻干燥法【ｌＪ，其原理主要是运用干燥、低温和隔绝空气的手段，降低微生物菌株新陈代谢的速度，使细菌的生命活动处于半永久性休眠状态，从而达到保藏的目的。
现在简易的保藏方法主要有定期移植法、液体石蜡法、无菌蒸馏水法、硅胶干燥法、玻璃或瓷珠干燥法、滤纸法、麸皮法、沙土管法等。
而目前公认冷冻法和冷冻干燥法是长期保存微生物菌种的最安全、可靠的方法。
其中制备和保存生物＋通讯作者：因：邝ｂｉｎｚｈａｎｇ＠ｃｈｉｎａ．ｃｏｒｎ．ｃａ收稿日期：２００７—１０—２３；接受日期：２００８．０３—１０材料的极佳方法是冷冻干燥法，此法适用于大多数微生物菌种的保藏。
１冷冻干燥保藏法冷冻干燥保藏方法作为一种最安全、可靠的方法之一，其适用范围广，除少数不产生孢子只产生菌丝体的丝状真菌不宜采用此方法保藏外，其它各大类微生物如细菌、放线菌、酵母菌、丝状真菌及病毒均可采用此方法保藏。
因为它适合于微生物细胞结构特点、生存环境及其生理状态，能满足微生物细胞结构和功能的统一性。
其原理是微生物在冷冻保护剂又称抗冻剂的环境中处于冷冻状态，然后９６０微生物学通报２００８，Ｖ０１．３５，Ｎｏ．６在真空减压情况下利用升华现象除去水分，使微生物在非剧烈的尽量避免细胞直接受到损伤的条件下处于干燥、缺氧状态，生理活动受到抑制。
使用此法，不同菌种可选择不同的抗冻剂，目前人们所用的抗冻剂有数十种，有的是单一的，有的是按一定配方混合使用的，根据微生物不同类别不同种群加以选择使用【２】。
２影响菌种冷冻干燥保藏的因素２．１菌种悬液的浓度在冻干技术中，为了保证在长期保藏后有足够数量的活细胞，通常采用浓度较大的菌悬液，细菌和放线菌浓度一般要大于１０８ＣＦＵ／ｍＬ，酵母菌细胞和霉菌孢子的浓度大于１０ＣＦＵ／ｍＬ，这样在菌种复活时只要能保证有０．１％的细胞仍然有活力就可以完成菌种传代过程。
但是Ｃｏｓｔａ等也有报道冻于培养物的最佳浓度与保护性培养基相关，例如当保护培养基中加入蔗糖时，冻干培养物浓度以１０１０ＣＦＵ／ｍＬ最佳，而保护性培养基中加入脱脂乳时，培养物最佳浓度为１０８ＣＦＵ／ｍＬｌ３１０Ｐａｌｍｆｅｌｄｔ等也报道了当在保护培养基中增加蔗糖浓度时，可以降低菌悬液的浓度，以达到最高的细胞存活率Ｈ】。
２．２冻干菌种材料的菌龄冻干菌种材料的菌龄对其在长期真空冷冻干燥保藏后的细胞存活率有重要影响，例如鼠李糖乳杆菌在生长稳定期进行冷冻干燥，其菌株细胞存活率最高为３１％～５０％，而在对数生长期为１４％，在延滞期仅有２％１５１０相反对Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ和Ｂｒａｄｙｒ．ｈｉｚｏｂｉｕｍ在延滞期进行冻干，其存活率较高。
研究表明：处于稳定期的细胞或成熟的孢子对不良环境具有较强的抗性，因而，保藏非芽孢细菌、酵母菌，应采用对数末期或稳定初期的细胞；而保藏芽孢细菌、放线菌和霉菌，要用成熟的孢子。
２．３培养基的影响实践证明，由于各类食品微生物菌种之间生物学特性存在较大差异，要对其进行冻干保藏，往往需根据菌种的特性对冻干培养基进行优化，提高微生物细胞的存活率，延长菌种保藏期；如Ｈｕａｎｇ等在对Ｌ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ进行冻干保藏时，在保护培养基中加入山梨醇、脱脂乳等抗冻剂，细胞存活率提高到了８６．５３％【６】。
Ｃａｒｖａｌｈｏ等的研究表明，选择不同ｈｔｔｐ：／／ｊｏｕｒｎａｌｓ．ｉｍ．ａｃ．ｃｎ／ｗｓｗｘｔｂｃｎ的生长培养基对保藏菌种的存活率也有重要的影响，如Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ菌株的生长培养基中加入甘露糖时，其经冻干后细胞存活率比加入果糖、乳糖以及葡萄糖要高，同时也显示了在培养基中添加４种碳水化合物，均可以提高对冻干菌株的保护作用【＿７】。
但同～菌种在相同成分的培养基中培养，其为液体或同体培养对微生物的存活率影响不大。
２．４抗逆能力通常认为，菌株在培养过程中，若处于某种逆境下，则会发生诱导抗逆反应，提高菌株的抗逆性。
Ｐａｌｍｆｅｌｄｔ和Ｈａｈｎ．Ｈａｇｅｒｄａｌ报道，在Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｒｅｕｔｅｒｉ菌株的培养过程中，如果将ｐＨ从６降至５，则有助于菌株细胞在冻干过程中更好地被保护，细胞存活率将由６５％上升至９０％，其机理可能是环境ｐＨ的变化诱导细胞产生了抗性物质，从而提高了它在冻干过程中的免疫力【４】。
Ｍａｕｓ和Ｉｎｇｈａｍ也报道了相似的结果，即Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ培养在６℃条件下或使其培养基的ｐＨ由６．２降至５．２，菌株将会增强抗寒和抗冻能力１８Ｊ。
一般认为，细胞处在逆境中６０ｍｉｎ，就会诱导抗性基因表达产生抗逆蛋白，如当降低培养基的ｐＨ时，微生物的细胞膜脂肪酸成分发生变化，并同时产生酸性休克蛋白。
另外，也有研究报道菌株的保藏期和存活率还依赖材料的干燥程度和真空的密闭性【９Ｊ。
２．５保护剂保护剂对于微生物菌株冷冻干燥保藏的存活率有较大的影响，选择得当的保护剂是提高微生物冷冻干燥保藏存活率、延长菌种保藏期的关键因素。
保护剂可分为小分子保护剂（如低聚糖类、醇类、缓冲盐类、氨基酸和维生素类）和大分子保护剂（如蛋白质、多肽类和多糖类）。
作为小分子保护剂，一般具有很强的亲水性，分子结构含有３个以上氢键，在冷冻或干燥过程中，可与菌体细胞膜磷脂中的磷酸基团或菌体蛋白质极性基团形成氢键，保护细胞膜和蛋白质结构与功能的完整性。
而大分子保护剂通过“包裹”形式保护菌体，同时，促进低分子保护剂发挥作用【４】。
保护剂类型的选择主要取决于菌株的生物学特性，如海藻糖对乳酸菌的冻干保藏效果显著【ｌ０ｌ。
但也有一些保护剂可以用于多种微生物，如脱脂牛乳、血清、甘油、甜菜碱、阿东糖、蔗糖、常金梅等：菌种冷冻干燥保藏的影响因素９６１葡萄糖和乳糖等【１１１。
很多研究表明利用海藻糖作为冷冻保护剂可以使微生物的存活率比蔗糖更高，其中一个重要原因是海藻糖的玻璃化温度（即南玻璃态变为高弹态所需温度）较高，而玻璃化温度越高，冻干物在温度升高时更容易保持稳定‘１２，１３］。
由于蛋白的玻璃化温度相对更高，所以其稳定性较糖类更好，因此蛋白在菌种保藏中的作用比糖类更重要【１１】。
Ａｂａｄｉａｓ等‘１４１实验表明Ｃａｎｄｉｄａｓａｋｅ在利用脱脂牛乳和碳水化合物做保护剂，菌株细胞存活率可达８５．９％。
因此，蛋白和糖的混合物作为保护剂更有效。
另外，对于经常需要反复冻融的样品，加入甘油有助于保持细胞活力【ｌ副。
２．６冻结速度在真空冷冻干燥保藏菌种的过程中，冻结速度是影响微生物存活率的重要因素，不同微生物最佳冷冻速度不同，其主要原因是冻结速度必须与微生物细胞对水分的渗透率相平衡，而细胞对水分的渗透率取决于细胞表面积与体积的比率以及细胞膜的渗透率。
当冷冻速度过慢时，细胞严重脱水，细胞体积严重收缩，超过一定程度时细胞将失去活性。
同时冷冻速度过慢，还会引起细胞外溶液部分结冰，从而使细胞外未结冰的溶液中溶质浓度过高，产生溶质损害；当冷冻速度过快时，细胞内的水分来不及外渗，会形成较大冰晶，使细胞膜及细胞器遭到破坏，造成细胞内冰晶机械损伤。
另也有研究报道，冷冻速度在５℃／ｍｉｎ一１８０℃／ｍｉｎ之间时，冷冻过程中胞内水分会完全渗出细胞，胞内不会出现结晶，细胞存活率较高；当冷冻速度大于５０００。
Ｃ／ｍｉｎ时，胞内水分迅速形成结晶，不发生外渗，细胞存活率也比较高；但是如果冷冻速度在１８０ｏＣ／ｍｉｎ一５０００％／ｍｉｎ之间时，细胞内水分容易在外渗过程中形成结晶对细胞造成机械损伤。
但是也有人认为真核微生物菌种适宜慢速冻结；而原核微生物菌种经慢速冻结和快速冻结后，细胞存活率差异并不显著‘１６１。
２．７复活处理保藏的菌种在使用时往往需要复活处理。
对于液氮冷冻状态的菌种，通常采用３８％～４０％水浴快速升温解冻，因为慢速升温解冻有可能造成胞内冰晶增大而损伤细胞。
对于真空干燥和冻干菌种复活培养时，复水介质产生的渗透压和复水条件（温度、ｐＨ）都有可能对细胞膜以及酶蛋白分子的结构和性质产生影响，造成细胞损伤死亡。
因此，一般采用最适该菌株生长的培养液或生理盐水并在适合其培养的温度下进行复水。
Ｌｏｕｉｓ（１９９０）等人的研究表明，冻干固定化胚芽乳杆菌在ｐＨ４．５的无菌水中活化后，菌株的存活率接近１００％，游离胚芽乳杆菌菌株的存活率为７５％左右。
其原因可能是在复水处理的过程中复水溶液的流速及用量对微生物细胞存在渗透冲击作用，固定化微生物细胞因受固定化材料的保护而几乎不受复水溶液的渗透冲击作用，其存活率明显高于游离微生物细胞。