比色法快速测定乳酸菌谷氨酸脱羧酶活力及其应用
2.γ-氨基丁酸(GABA)的分布及测定方法
γ-氨基丁酸（GABA）的分布及测定方法周青生物化工2110805057一、分布：γ-氨基丁酸在动、植物体内都有分布，在动物体内，GABA主要分布于神经组织中，在哺乳动物的脑组织内分布最为集中，其含量是单胺类含量的1000倍，而在外围器官中含量很少。
在植物体内，GABA是细胞自由氨基酸库的重要组分，胞液中有几种构型，可形成类似脯氨酸的环状结构。
高等植物组织中GABA含量通常在0.3～32.5μmol／g之间，超过许多蛋白质类氨基酸的含量。
在一些与根瘤菌共生固氮植物的根瘤中，GABA以结合态形式存在，苜蓿中结合态形式的GABA高达干重的6.6%[1]。
除此之外，GABA还存在于以下植物中，见表一。
①薄层色谱：原理：用一定波长的光照射在经薄层层析后的层析板上，对具有吸收或能产生荧光的层析斑点进行扫描，用反射法或透射法测定吸收的强度，以检测其浓度。
方法：展开剂是正丁醇：醋酸：水=4：1：1。
分别吸取5μl γ-氨基丁酸标准品溶液和样品洗脱液，点于自制的硅胶薄层板上，以正丁醇：醋酸：水体积比为4：1：1为展开剂展开，取出晾干，用体积分数0.2％茚三酮乙醇溶液显色，105℃烘数分钟，直至获最大斑点，用Camag TLC scanner 3 扫描仪扫描。
扫描条件为：反射式双波长锯齿扫描,扫描波长λS=515nm,参比波长λR=680nm，狭缝50×0.45 mm。
黄怀生用最小二乘法对标准溶液点样量和色谱峰面积值进行回归分析，其相关系数可达到0.99以上[14]。
黄美娥[15]用此方法测得得蕨菜叶、茎中γ-氨基丁酸的质量分数分别为0.319％、0．141％。
采用双波长扫描法[16]，可以避免分离度不佳的其他氨基酸的相互干扰；二、双波长扫描可以排除背景干扰使基线平直；三、能提高灵敏度。
②纸电泳法：原理：纸上电泳法，以纸为支持剂，使带电的γ-氨基丁酸于纸上在外电场作用下定向移动，从而达到分离目的。
方法：取上清液用于点样于滤纸上，以标准GABA溶液做对照，在电压300V、室温条件下电泳60min，电泳缓冲液为吡啶-冰醋酸混合溶液[吡啶：冰醋酸：蒸馏水(体积比)=2：2：121，pH4.7]。
谷氨酰胺转氨酶发酵工艺优化及其酶学性质
谷氨酰胺转氨酶发酵工艺优化及其酶学性质王兴吉;刘文龙;郭庆亮;张杰【摘要】[Objective]To investigate the optimum fermentation conditions of TGase produced by Streptomyces lanceolata LD195 and explore the enzymatic properties of TGase.[Method] L9(34) orthogonal design on media and culture conditions of Streptomyces lanceolata were optimized.[Result]The best medium:Na2HPO4 2.0 g/L,MgSO4 · 7H2O 1.5 g/L,KH2PO4 2.5 g/L,CaCl2 3.0 g/L.The optimal culture conditions:culture temperature 30 ℃,bottling capacity 25 mL,agitation rate 200r/min,inoculums size 10％.The produced TGase exhibited optimum activity at 50 ℃ and pH 6.0.It was stably incubated in 40 ～60 ℃ for 30 min and the remained enzyme activity was above 85％ dealed with pH 5.0 ～7.0 for 30 min.The enzyme was strongly inactivated byFe3+,Cu2+,Zn2+.[Conclusion] TGase produced by Streptomyces lanceolata LD195 has good acid resistance and heat resistance,and which has broad prospects in commercial production.%[目的]研究茂源链霉菌LD195产TGase 的最佳发酵工艺条件,并探讨TGase的酶学特性.[方法]采用L9(34)正交试验对产谷氨酰胺转氨酶的茂源链霉菌菌株培养基和培养条件进行优化.[结果]最佳无机盐配方为Na2 HPO42.0 g/L,MgSO4·7H2O 1.5 g/L,KH2PO4 2.5 g/L,CaCl2 3.0 g/L,最佳培养条件为培养温度30℃,装液量25mL,摇床转速200 r/min,接种量10％.该谷氨酰胺转氨酶的最适反应温度为50℃,在40～60℃条件下保温30 min酶活基本没有损失;最适反应pH为6.0,在pH为5.0 ～7.0条件下保存30 min仍具有85％以上酶活;同时Fe3+、Cu2+、Zn2+会强烈抑制酶的活性.[结论]茂源链霉菌LD195产TGase具有良好的耐酸性和耐热性,在商业化生产中具有广阔前景.【期刊名称】《安徽农业科学》【年(卷),期】2017(045)032【总页数】4页(P161-164)【关键词】培养基;茂源链霉菌;谷氨酰胺转氨酶;酶学性质【作者】王兴吉;刘文龙;郭庆亮;张杰【作者单位】山东隆科特酶制剂有限公司,山东省酶制剂生物发酵技术重点实验室,山东临沂276400;山东隆科特酶制剂有限公司,山东省酶制剂生物发酵技术重点实验室,山东临沂276400;山东隆科特酶制剂有限公司,山东省酶制剂生物发酵技术重点实验室,山东临沂276400;山东隆科特酶制剂有限公司,山东省酶制剂生物发酵技术重点实验室,山东临沂276400【正文语种】中文【中图分类】S188谷氨酰胺转氨酶(Transglutaminase.EC2.3.2.13,TGase)，又称转谷氨酰胺酶(TGase)，是一种催化酰基转移反应的转移酶，是由331个氨基组成的分子量约38 000的具有活性中心的单体蛋白质，可催化蛋白质多肽发生分子内和分子间共价交联[1-2]，从而改善蛋白质的结构和功能，影响蛋白质的性质，如发泡性、乳化性、乳化稳定性、热稳定性、保水性和凝胶能力等，进而改善食品的风味、口感、质地和外观等，目前已经被广泛应用于食品工业。
乳酸菌谷氨酸脱羧酶的酶学性质研究
乳酸菌谷氨酸脱羧酶的酶学性质研究
刘清;姚惠源;张晖
【期刊名称】《食品科学》
【年(卷),期】2005(026)004
【摘要】本文对一株乳酸菌所产谷氨酸脱羧酶的酶学性质进行了较系统的研究,其中包括酶的热稳定性、pH稳定性及温度、pH和一些化学物质对酶活的影响.结果表明:此酶的最适温度为52℃,最适pH为4.5,米氏常数Km=24mmol. PLP、VB6及Ca2+在一定程度上都能促进酶活,且在含量小于100μmol时,作用程度为PLP＞VB6＞Ca2+.乙酸浓度小于0.05mol/L也能提高酶活力.
【总页数】5页(P100-104)
【作者】刘清;姚惠源;张晖
【作者单位】江南大学食品学院,江苏,无锡,214036;江南大学食品学院,江苏,无锡,214036;江南大学食品学院,江苏,无锡,214036
【正文语种】中文
【中图分类】Q55
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小妹;林谦;孙力军
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食品发酵中谷氨酸酶活性的测定与影响因素研究
食品发酵中谷氨酸酶活性的测定与影响因素研究食品发酵是一种利用微生物代谢产生的酶催化作用，将食材进行转化、降解和提醒的过程。
在食品发酵过程中，谷氨酸酶是一个重要的酶类，它能够促进谷氨酸的转化，影响食品的口感和营养价值。
本文将探讨食品发酵中谷氨酸酶活性的测定方法和影响因素。
首先，测定谷氨酸酶活性的方法有很多种，其中常用的方法有色谱法、比色法和生物传感器法等。
色谱法是一种比较准确的测定方法，但操作较为复杂，需要专业的仪器设备和技术。
比色法是一种简便、快速的测定方法，通过比色剂与酶反应产生的产物发生颜色变化，可以直接测定酶活性。
而生物传感器法则是利用生物材料的特殊性质来测定酶活性，具有灵敏度高、反应时间短等特点。
根据不同实验需求和设备条件，选择适合的测定方法进行研究。
其次，影响食品发酵中谷氨酸酶活性的因素有多方面的因素，如pH值、温度、基质浓度和金属离子等。
pH值是影响酶活性的重要因素之一，不同酶对pH值的适应性不同。
例如，在发酵过程中产生的酸碱度变化会影响谷氨酸酶的活性，从而影响最终食品的品质。
另外，温度也是影响谷氨酸酶活性的因素之一，适宜的温度可以提高酶活性，加快发酵反应。
而过高或过低的温度则会导致酶的变性，丧失催化作用。
此外，基质浓度也是影响谷氨酸酶活性的重要因素。
基质是酶作用的底物，适宜的基质浓度可以提高反应速率，但过高的基质浓度则会抑制酶的活性。
最后，金属离子也可以影响谷氨酸酶活性。
一些金属离子可以作为辅因子或抑制剂参与酶活性的调节。
不同金属离子对谷氨酸酶的影响程度各异，需要具体实验来验证。
综上所述，食品发酵中谷氨酸酶活性的测定与影响因素是一个复杂而重要的课题。
科学准确的测定方法和清晰的影响因素研究可以为食品发酵行业提供理论指导和实践参考。
随着科学技术的发展，相信在未来的研究中，我们能够更全面地了解谷氨酸酶活性的测定与影响因素，为食品发酵工艺的优化和创新提供更好的支持和保障。
酸乳中乳酸菌的分离鉴定及其活力的测定
所以酸奶菌落总数为： 样品的测定与出厂的间隔时间为3d： N=(N1+N2) X A/2=（295+297）X 107/2=296 X 107cfu/mL 样品的测定与出厂的间隔时间为6d： N=(N1+N2) X A/2=（273+271）X 107/2=272 X 107 cfu/mL 样品的测定与出厂的间隔时间为9d： N=(N1+N2)X A/2= （ 212+213 ） X 107/2= 213 X 107cfu/mL 实验分析：酸奶中所含的乳酸菌数，随着 出厂天数的延长会出现明显下降的趋势。
测定乳酸菌的 OD值和产生酸能力来评定酸乳中乳酸菌的活力，
2. 材料与方法
材料与设备
A B 设备：高压灭菌锅 CO2培养箱 电子天平 冰箱 鼓风干燥箱 超净工作台 光学显微镜
材料：蒙牛冠益乳
实验方法
酸奶中乳酸菌的 培养分离 生化试验鉴定 酸奶中乳酸菌
乳酸菌
菌落数的测定
生长曲线的绘制
产酸能力的测定
目录
1 2 3 4 5
概述 材料与方法 结果与分析 结论 致谢
1. 概述
背景
酸奶是日常生活中的一种传统的受欢迎的 发酵型的乳制品，它的营养价值含量相当 的丰富，并且对人体有很好的保健功效。
意义
蒙牛冠益乳中的乳酸菌主要为保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌。 对乳酸菌活力的测定，判定酸奶的最佳饮用时间，为酸奶的消 费提供科学的依据，同时也对微生物做出研究。
_氨基丁酸测定方法的研究
２ 结果与讨论
２．１ ＨＰ ＬＣ 法测定 ＧＡＢＡ
ＧＡＢＡ 的 ＰＩＴＣ 衍生物进行紫外扫描［１２］， 在２５４ｎｍ 处 有 最 大 吸 收 波 长 。ＧＡＢＡ 标 样 和 乳 酸 菌 发 酵 液 经 ＰＩＴＣ 柱前衍生后在 ２５４ｎｍ 的图谱分别见下图 １、图 ２。
３０
２５
２０
１５
１０
５
１０
１５
图 １ ＧＡＢＡ 标样的 ＨＰＬＣ 图
茚三酮浓度（ ％）
Ａ５２０
０．１
０．２４４
０．２
０．２８０
０．３
０．３００
０．４
０．３５８
０．５
０．３６０
０．６
０．３６１
０
５
１０
１５
图 ２ 样品中 ＧＡＢＡ 的 ＨＰＬＣ 图
２３６ ２００７ 年第 ０５ 期
２．２．２ 显色温度和时间的选择 为了定量的准确性和 重现性， 减少操作引起的误差， 应将显色温度和洗脱
近 年 来 ， ＧＡＢＡ 在 食 品 中 的 应 用 研 究 正 在 掀 起 ， 而食品中 ＧＡＢＡ 的测定方法的报道尚不多见。由于 ＧＡＢＡ 对电 化 学 和 紫 外 、可 见 光 的 不 灵 敏 性 ， 导 致 用 直接方法对它进行测定比较困难。关于 ＧＡＢＡ 的测 定 近 年 来 国 内 外 有 氨 基 酸 分 析 仪 测 定 、酶 法［１］、色 质
各种酶活力测定方法及注意事项
碱性蛋白酶及各种蛋白酶活力测定方法及测定有感因长期测定碱性蛋白酶酶活力与角蛋白酶活力与胶原酶活力和弹性蛋白酶活力，碱性蛋白酶活力测定还好，因有国家标准，测定按照国标来便可大大减少误差。
其余酶活力测定过程中因无统一标准且底物差异大，导致长期酶活力测定的混乱，各种酶活力测定方法与各种试剂添加，最后实际测定的酶活力只能仅作参考。
以下是各种蛋白酶活力测定方法及标曲绘制：碱性蛋白酶测定方法根据国标GB/T 23527-2009 附录B 蛋白酶活力测定福林法以下是方法碱性蛋白酶的测定方法参考GB/T 23527-2009 附录B中福林酚法进行，即1个酶活力单位（U/mL）定义为1 mL 酶液在40℃、pH= 10.5条件下反应1 min水解酪蛋白产生1 μg 酪氨酸所需要的酶量，主要步骤如下。
2.2.6.1 标准曲线的绘制（1）L-酪氨酸标准溶液：按表2-6配制。
表2-6 L-酪氨酸标准溶液配置表Table 2-6 L-Tyrosine standard solution form管号酪氨酸标准溶液的浓度/（μg/mL）取100 μg/mL酪氨酸标准溶液的体积/（mL）取水的体积/（mL）0 0 0 101 10 1 92 20 2 83 30 3 74 40 4 65 50 5 5（2）分别取上述溶液各1.00 mL，各加0.4 mol/L碳酸钠溶液5.0 mL，福林试剂使用液1.00 mL，置于40 ℃± 0.2 ℃水浴锅中显色20 min，用分光光度计于波长680 nm，10mm比色皿，以不含酪氨酸的反应管作为空白，分别测定其吸光度值，以吸光度值A为纵坐标，酪氨酸浓度C为横坐标，绘制L-酪氨酸标准曲线。
图2-1 L-酪氨酸标准曲线Fig. 2-1 L-tyrosine standard curve根据作图或用回归方程计算出当吸光度为1时的酪氨酸的量（μg），既为吸光度常数K 值。
其K值应在95-100范围内。
微生物发酵饲料中乳酸含量的测定方法比较分析
微生物发酵饲料中乳酸含量的测定方法比较分析————————————————————————————————作者：————————————————————————————————日期：微生物发酵饲料中乳酸含量的测定方法比较分析摘要：通过比较分析羟基联苯比色法、EDTA定钙法、乳酸脱氢酶法3种检测方法的准确性、简便性、经济性，找到适合于测定微生物发酵饲料中乳酸含量的方法。
试验结果表明，乳酸脱氢酶法检测的准确性最好、迅速，但成本高；EDTA 定钙法检测虽然简便、迅速，但准确性最差；羟基联苯比色法检测效果居中，较为准确和方便。
因此，乳酸脱氢酶法适合于高精度、高效率的检测；EDTA定钙法适合于迅速简便、精度要求不高的检测；羟基联苯比色法可作为企业或科研单位精度要求不高的常规检测.关键词:发酵饲料;乳酸；羟基联苯比色法；EDTA定钙法；乳酸脱氢酶法Comparative Analysis of Analytical Methods of Lactic AcidContent in Microbial Fermentation FeedsAbstract:To find a method that was used to measure the lactic acid content in microbial fermentation feeds,the accuracy， convenient and economy of hydroxybiphenol colorimetry method, EDTA titration method and lactic ac⁃id dehydrogenase method were contrasted in this study. The results showed that the accuracy of the test result wasbest and rapid using the lactic acid dehydrogenase method， but the cost was higher. The test of EDTA titration meth⁃od was simple and rapid, but the accuracy was worst. The test results of hydroxybiphenol colorimetry method waspreferably，the methods had good specificity and convenient。
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内含Ｏ．１咖蒯Ｌ ＰＬＰ（５’一磷酸吡哆醛），１０Ⅱｍ出Ｌ底物ＬＭｓＧ（Ｉ，谷氨酸钠）。２００肚底物溶液
和１～１００皿酶液在３０℃反应，然后冰浴中加入２００皿０．２Ⅱ础Ｌ硼酸缓冲液（ｐ瑚．０）终止反 应，再加入１ ｍＬ６％苯酚和４００血次氯酸钠，沸水浴加热１０ ｌＩｌｉｎ后，迅速冷却２０ ｌＩｌｉｎ，在６３０ 啪测定吸光值，酶反应产物＊氨基丁酸的定量以标准曲线确定，同时探讨了该方法的应用。
１．２
１．２
１．０ Ｏ．８
量 ｏ．６
Ｒ Ｏ．４ Ｏ．２ Ｏ．０
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缓冲液体系／（０．２皿０１／Ｌ）
图２不同类型缓冲体系对乳酸菌粗酶液活力的影响 （２００止底物溶液和１００止粗酶液在３０℃反应１０ｈ）
缓冲液（ｐｍ．２）中，内含０．１删Ｌ １．４．２粗酶提取液的制备：收集到的湿菌体（约２７９）分散到５００ ｍＬ ２０ ｎ蚰训Ｌ磷酸盐 Ｐ＂，ｏ．２ １１１９，ｍＬ溶菌酶，然后在３７℃反应ｌ ｈ， 反应结束后置于冰浴中，利用高速分散仪在２４，０００“ｒＩＩｉｎ分散２．ｏ ｌＩｌｉｎ充分破壁以释放 胞内酶。离心（１１，０００×ｇ）除去细胞碎片，得到清澈上清液，在冰浴中加入固体硫酸
ｄ即ｓ睁ｉｓ ｒｅｌ｜ｄ ａｔ ６３０啪．‘ｙ－蛐ｄｎｏｂｌｉＩｙｒｉｃ ａｃｉｄ（ＧＡＢＡ）ｐｍｄｕｃｅｄ ｗ鹊ｃ８ｌｃＩ｜ｌａｔｅｄ ｕｓｉＩｌｇⅡｌｅ咖ｎｄａｄ ｃｕｒｖｅ．ＡｐｐＨｃａｔｉ啦玛《
ＧＡＤ舳荡ｗｅｒｅ ｍｅｍ瞳１１０ｄｉＩｌ
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ａｃｉｄ（（遗ＢＡ），ｓｐ。ｃ细曲础咖 Ｉ晒，舯ｆｄｓ：ｈｃｔｉｃ ８ｃｉｄ ｂａｄ威ａ，ａｕＬｍａｆｅ ｄｅⅢｂｏｘｙｋ∞（ＧＡＤ），卜Ａ商ｍｂｌｌｔｙＩｉｃ
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。联系人Ｔｅｌ：０５１０－５８６３５６６
收稿日期：２００３脾１０。修回日期：２００３埘－２ｌ
万方数据
２００４年３１（２）
微生物学通报
诊疗型酶制剂Ｈｏ，它的生产和纯化逐渐成为一种产业，有很好的市场前景。ｗｕ和Ｆ＇ｏｎ—
ｄａ等ｂ ｏ报道了用放射定量法测定鼠脑和大肠杆菌来源ＧＡＤ的活力，原理是标记Ｌ广［卜”６］ 谷氨酸定量释放１４ｃ０２，该法准确度高，但设备气密性要求高，成本高。凌达仁等№１利
１．４．４反应溶液：新鲜配制不同类型、浓度的缓冲液，内含１０㈣ｌ／Ｌ ＬＭｓＧ和
ｏ．１—删ｏｌ／Ｌ Ｐ凹作为底物溶液。次氯酸钠（含活性氯５．２５％），新鲜配制的６％苯酚溶液 和２０姗诎，Ｌ ＧＡＢＡ溶液，冰箱保存备用。 １．４．５标准测定方法：２００皿底物溶液和１００止酶液在３０℃反应一定时间（根据活力 大小确定０．５～２０ ｈ），然后置于冰浴中，加入２００皿０．２ ｍｏｌ／Ｌ硼酸缓冲液（ｐＨ９．０）终 止反应，再加入１．ｏ ｎ１Ｌ ６％苯酚和４００皿次氯酸钠溶液，充分振荡后，在沸水浴中反 应１０ ｍｉｎ，迅速在冰浴中冷却２０ ＩＩｌｉｎ，在６３０枷测定吸光值，酶反应产物ＧＡＢＡ的定量 以标准曲线确定，相对酶活力以单位时间内Ａ枷值的变化表示，每组测定同时做３个重
ＭａｃⅡｖａｉｎｅ、醋酸．醋酸钠、柠檬酸一柠檬酸钠、吡啶．醋酸４种缓冲体系中相对反应活性
如图２所示，０．２ ｔｎｏｌ，Ｌ的ＭａｃⅡｖａｉｌｌｅ缓冲体系中酶活性最高，在吡啶．醋酸缓冲体系中
万方数据
２００４年３１（２）
微生物学通报
的活性最低。 这一结果说明，排除缓冲液对Ｂｅｎｌｌｅｌｏｔ显色反应的影响（实际测定表明缓冲液种类
０．８
￡伽妣Ｄｃｃ凇胁括０１—７的ＧＡＤ的最适ＤＨ
Ｏ．７
也在４．７，ｕｅｎｏ等【１硼报道的三０ｃ幻６∞以如
毫ｏ．６
弋
６枷ＩＦＯｌ２００５的ＧＡＤ最适ｐＨ为４．２，
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大肠杆菌Ｑｍ为ｐＨ４．６，而植物来源的
０．４
ＧＡＤ的在栅．８活性最高＂Ｊ，这说明了
０．３ ３．Ｏ
３．５ ４．Ｏ ４．５
５．Ｏ
５．５
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阻Ｏ．２ ｎ州Ｌ ｓｏｄｉ啪ｂ哦Ｉｔｅ ｂＩｌ珏矗，ｐ围．Ｏ，ｔ№ｌ ｌ ｎ正６％ｐＩＩ∞ｏｌ谳ｕ吐蛳帅ｄ ４００止８０ｄｉ哪ｈｙ州ｄⅢｉｄｅ ｗｅｒｅ ａｄｄｅｄ．
蹦０ｒ ｄｅｖｄｏｐＩ脚ｔ ｗａｓ ｃａｒＩｉｅｄ伽ｔｉｎ蛐ｎｇｗ砒呵ｆｏｒｌＯ幽ｔＩｌｅｌｌｉＩＩⅡｎＢｄｉｍｄｙ叫ｉＩｌｉ咿ｗ址盯ｂａｔＩＩｋ２０曲．ｒＩｌｌｅ叫ｃａｌ
脚ｌ ＧＡＢＡ所需的酶量，比色法进行同样的测定作比较。
２结果与讨论
２．１粗酶液总聋白测定
用ＰＢｓ（ｐＨ７．４）缓冲液溶解牛血清蛋白配制成１．５ ｍｇ／ｍＬ溶液，分别吸取１５．
１５０弘ｇ／１００止，加入１．Ｏ １１１Ｌ考马斯亮兰溶液，作标准曲线得ｙ＝０．００８９ｘ＋０．０４７１（Ｒ２＝
ｏ．９９８），样品测定后计算的粗酶提取液的蛋白质浓度为３．５叫－ＩｌＬ，总蛋白为２４５ ＩＩｌｇ。
姆ｌｅｎｔ １１００液相色谱仪（安捷公司），ｃ墙柱（似．０×１００Ｉｍ），ＯＰＡ（邻苯二甲醛）
柱前衍生测定氨基酸。高速分散仪（Ｊｍｋｌｅ＆Ｋｕｎｋｅｌ ｕｌｔ胁Ｔｕｌｌ微他５），Ｇ０２０Ｂ型冷冻离
心机（上海安亭科学仪器厂），混合纤维树酯微孔滤膜一０．２２肿（上海新亚净化仪器
厂），７２２型分光光度计（上海第三分析仪器厂）等。 １．３菌种
江南大学食品科学研究室保藏乳酸菌种肠呦似抛，玩俯ｓＹ礴１．００９。 １．４实验方法 １．４．１菌体培养收集【８Ｊ：在ＭＲＳ液体培养基中经２次充分活化的ｓＹ佟１．００９以１．Ｏ％的 接种量接人８．ｏＬ ｎ昭培养基（含ｌ％ＬＭＳＧ）中，培养２４ ｈ后离心（１，８００×ｇ）收集
菌体，用２０咖洲Ｌ磷酸盐缓冲液（ｐＨ７．２）充分洗涤。
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微比色法快速测定乳酸菌谷氨酸脱羧酶活力及其应用
许建军江波。 许时婴
（江南大学食品学院无锡２１４０３６）
摘要：基于Ｂｅｒｔｈｅｌｏｔ显色测定ｃｔ卜氨基酸的反应，探讨了比色法快速测定谷氨酸脱羧酶活力的 测定条件。结果表明，该方法灵敏度较高，重现性好，成本低，快捷，可替代氨基酸分析仪
Ｍ枷ｖａｉｌｌｅ
ｒ呦彬ＬｐｙＩｉｄ慨ａｌ ｐｈ啷矗ｌ吐ｅ（ＰＬＰ）锄ｄｌＯ瑚剃Ｌ【广腿岫∞０ｄｉｔｍ咖埘ｎａｌｅ（【广
ＭＳＧ）．’ｎ”ⅫＩｃｔｉ∞面珈ＩｅⅧ试删０ｆ２００庙ｍｂｓⅡ砒ｅ ｓｏｌｕⅡ∞ａＩｌｄ ｌ—１００皿∞巧ｒｍ ｐｒ８岬ｄ∞陆ｎ Ｌ瞅ｉｃ ａｃｉｄ
胁耐ａ ａｎｄｗ∞妇砒通ｅｄ ａｔ ３０℃．１ｈｅ∞ｚ珊１日ｔｉｃⅫｌｃｔｉｏｎ ｗ∞ｔⅧｉｒＩａ自ｅｄ ｂｙｉＩＩｌｌＩⅫ商∞ｉＩＩｉｏｅ．ｗｍ口ａＩｌｄ ａｄｄｉｎ∞０ｆ２００
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万方数据
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微生物学通报
２００４年３１（２）
底除去硫酸铵，透析液作为粗酶提取液，内含有谷氨酸脱羧酶，冰箱短时间保存备用。 １．４．３粗酶提取液中蛋白质浓度测定：考马斯亮兰染色法，以牛血清蛋白为标样。
复，求平均值。
１．４．６氨基酸分析仪分析：采用ＭａｃⅡｖａｊｎｅ缓冲体系，ｏ．２ｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ４．７，含０．１姗ｏｌ，Ｌ
ＰＬＰ，１０ ｎｌｎ甜／Ｌ底物ＬＭＳＧ，２ｃＨＤ肚底物溶液和１００止酶液在３０℃反应后，稀释１０ 倍，经０．２２弘ｍ混合纤维树酯微孔滤膜过滤，用Ａ舀ｌｅｎｔ １１００液相色谱仪定量测定其他 氨基酸和生成的ＧＡＢＡ，一个酶活力单位（ｕ）定义为在测定条件下，每分钟产生１
谷氨酸脱羧酶（ＧＡＤ，ＥＣ４．１．１．１５）是一种吡哆醛类裂解酶，能专一的催化Ｌ谷氨 酸裂解成为弘氨基丁酸（ＧＡＢＡ）和ｃ０２。ＧＡＢＡ是哺乳动物体内一种重要的抑制性神 经递质…。近来，富含ＧＡＢＡ的食品的开发受到重视，成为研究的热点心ｏ。已经报导有 高产ＧＡＢＡ的乳酸菌，表明其有较高的ＧＡＤ活性。ＧＡＤ作为生物技术富集生产ＧＡＢＡ 的关键酶，其活性测定对深人研究生物代谢活动有重要意义，同时，ＧＡＤ在植物中也 广泛分布，它的活性高低可指示种子发芽能力和出苗率等［３］。人体内，研究表明ＧＡＤ 是Ｉ型糖尿病人体内主要的自抗原，作为诊断酶来区分预测糖尿病以及作为极具潜力的
６．５ ７．Ｏ ７．５
不同来源ＧＡＤ性质的差别，本文确定测
ｐＨ
定乳酸菌ｓＹ玛１．００９来源谷氨酸脱羧酶
图１ ｐＨ值对乳酸菌谷氨酸粗酶液活力影响 ２００止底物溶液和１００皿粗酶液在３０℃反应２０ｈ，
然后显色测定。３组求平均值
量反应液， ◆参比液
活力的ｐＨ为４．７。 ２．２．２不同类型的生化缓冲体系与不同 浓度的Ｍａｃｎｖａｉｎｅ对粗酶相对活性的影 响：比较粗酶在０．２ ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ ４．７的
对显色几乎没有影响），缓冲液离子可能对酶活力有抑制作用。早期Ｓｈｕｋｕｖａ发现醋酸 盐离子对大肠杆菌ＧＡＤ活性有依赖浓度的抑制作用，就研究测定方法而论，这里对酶 的抑制作用不作深入探讨。图３中，比较ＭａｃⅡｖａｉｎｅ缓冲体系在不同浓度时粗酶的相对 活性，发现ｏ．２ ｍｏｌ／Ｌ缓冲体系响应最高，低浓度时响应低，这可能与缓冲能力和离子 强度都有关，高浓度的缓冲液有助于维持酶反应时所需的ｐＨ值。因而在标准测定过程 中采用０．２ Ｉｎｏｌ／Ｌ、ｐＨ４．７的ＭａｃⅡｖａｉｎｅ缓冲体系。