乳酸菌的筛选与鉴定
泡菜盐水中降胆固醇乳酸菌的筛选鉴定及性能研究
引用格式：高宇, 廖彩羽, 汤科, 等. 泡菜盐水中降胆固醇乳酸菌的筛选鉴定及性能研究[J]. 中国测试，2023, 49(11): 132-140.GAO Yu, LIAO Caiyu, TANG Ke, et al. Isolation and characterization of cholesterol-lowering lactic acid bacteria from pickle juice[J].China Measurement & Test, 2023, 49(11): 132-140. DOI: 10.11857/j.issn.1674-5124.2023010015泡菜盐水中降胆固醇乳酸菌的筛选鉴定及性能研究高 宇1， 廖彩羽1， 汤 科1， 程道梅1， 赵长菘1，刘 鑫1， 张 弛1， 韩云蕾2(1. 成都医学院公共卫生学院，四川 成都 610500; 2. 成都医学院基础医学院，四川 成都 610500)摘 要: 为筛选出具有降胆固醇能力且益生性能优良的乳酸菌，从28份四川传统泡菜盐水中分离得到103株乳酸菌。
通过体外胆固醇降解能力、耐酸耐胆盐能力、人工胃肠液耐受性、盐耐受性、疏水性、自聚性和抑菌能力测定，筛选得到一株体外降解胆固醇能力为42.7%的植物乳杆菌（Lactiplantibacillus plantarum ）LAB4。
该菌具有一定的耐酸、耐胆盐能力，在含2% NaCl 的培养基中可正常生长，在经模拟人工胃、肠液处理后其活菌数均能达到108 CFU/mL 。
LAB4具有较好的肠道定殖潜力，其发酵上清液对4种常见食源性致病菌均表现出中度抑菌活性。
综上，植物乳杆菌LAB4益生性能优良，可作为开发降胆固醇功能性食品的潜力菌株。
关键词: 降胆固醇; 乳酸菌; 泡菜; 益生菌; 筛选中图分类号: R3文献标志码: A文章编号: 1674–5124(2023)11–0132–09Isolation and characterization of cholesterol-lowering lacticacid bacteria from pickle juiceGAO Yu 1, LIAO Caiyu 1, TANG Ke 1, CHENG Daomei 1, ZHAO Changsong 1,LIU Xin 1, ZHANG Chi 1, HAN Yunlei 2(1. School of Public Health, Chengdu Medical College, Chengdu 610500, China; 2. Preclinical MedicineSchool, Chengdu Medical College, Chengdu 610500, China)Abstract : In order to screen lactic acid bacteria with cholesterol-lowering ability and excellent probiotic properties, 103 strains of lactic acid bacteria were isolated from 28 Sichuan traditional pickle juice. From the in vitro cholesterol degradation ability, acid resistance and bile salt resistance, artificial gastrointestinal fluid tolerance, salt tolerance, hydrophobicity, self-aggregation, and antibacterial ability Lactiplantibacillus plantarum LAB4 with an in vitro cholesterol degradation ability of 42.7% was isolated. Moreover,Lactiplantibacillus plantarum LAB4 showed promising probiotic characteristics with remarkable tolerance to pH, bile salt and 2% NaCl. Furthermore, the strain could reach 108 CFU/mL after incubation in artificial gastrointestinal fluid and possesses good potential for adhesion and colonization of intestinal epithelial cells;收稿日期: 2023-01-03；收到修改稿日期: 2023-02-24基金项目: 四川省卫生健康委普及应用项目（17PJ439）；成都医学院研究生创新基金项目（YCX2022 -01-38）作者简介: 高 宇（1993-），女，湖北十堰市人，硕士研究生，专业方向为营养与健康管理。
酸菜食品发酵中防腐乳杆菌的检测与筛选
酸菜食品发酵中防腐乳杆菌的检测与筛选酸菜是一种常见的食品，其发酵过程中存在防腐乳杆菌。
为了确保酸菜的质量和安全，必须对发酵过程中的防腐乳杆菌进行检测与筛选。
防腐乳杆菌是一种乳酸菌，能够在酸菜的发酵过程中起到防腐和酸化的作用。
过多的防腐乳杆菌可能会导致酸菜的质量下降甚至腐败。
在酸菜生产过程中，对防腐乳杆菌的检测与筛选显得尤为重要。
酸菜的发酵过程中防腐乳杆菌的检测可以采用传统方法和分子生物学方法。
传统方法主要是通过对酸菜样品进行菌落计数。
具体步骤如下：1. 从发酵的酸菜样品中取出一定量的样品，加入适量的生理盐水进行稀释。
2. 将样品均匀涂布在含有适宜培养基的琼脂平板上。
3. 将琼脂平板放置在恒温培养箱中，设定适宜的温度和时间进行培养。
4. 检查培养后的琼脂平板上的菌落形状，统计菌落数量，并计算菌落形成单位（CFU）。
5. 通过菌落形态、颜色和其他特征进行初步鉴定。
还可以利用分子生物学方法对防腐乳杆菌进行检测与筛选。
这种方法主要是通过PCR技术检测酸菜样品中的防腐乳杆菌的特异基因序列，从而准确快速地确定防腐乳杆菌的存在。
1. 从酸菜样品中提取基因组DNA。
2. 设计特异性引物，使其能扩增防腐乳杆菌特异基因序列。
3. 进行PCR反应，扩增目标基因序列。
4. 将PCR产物进行电泳分析，以确定是否存在防腐乳杆菌的基因序列。
检测与筛选防腐乳杆菌的目的是为了确保酸菜发酵的质量和安全。
在生产中，可以根据检测结果对防腐乳杆菌的数量进行控制，以避免过量使用导致质量下降。
根据筛选结果，可以进一步研究和培育具有优良特性的防腐乳杆菌，以提高酸菜的质量和发酵效果。
传统发酵型泡菜中乳酸菌的分离筛选及直投式发酵剂的制备
传统发酵型泡菜中乳酸菌的分离筛选及直投式发酵剂的制备泡菜发酵过程中接种乳酸菌发酵剂可以很容易诱导和监控自然发酵,缩短发酵时间,降低发酵失败的风险。
因此,分离筛选具有优良发酵性能的乳酸菌对于提高蔬菜的感官品质,营养价值和货架期具有重要的意义。
优良乳酸菌的筛选是传统泡菜发酵模式向接种发酵模式转变的关键。
而与液态培养的乳酸菌发酵剂相比,直投式发酵剂具有活菌数多、发酵活力高、便于保藏和运输的优势,同时在工业化生产中能够缩短发酵周期,降低生产成本,提高产品的稳定性和安全性。
本文从传统发酵型的泡菜中筛选具有产酸速率快,产酸量多,降解亚硝酸盐和抑制病原菌能力强的乳酸菌,通过筛选合适的冻干保护剂,运用冷冻干燥法制备直投式发酵剂,并研究其贮藏稳定性和发酵活力,为乳酸菌直投式发酵剂的规模化、标准化生产提供理论和技术基础。
本研究主要有以下结果:1.采用MRS选择培养基从四川、重庆、湖北、陕西四省家庭自制泡菜,实验室自制泡菜和商品泡菜中分离纯化得到93纯菌株,并通过革兰氏染色发现有81株革兰氏阳性菌株(G+),12株革兰氏阴性菌株;通过过氧化氢酶试验,发现这81株G+均为过氧化氢酶阴性。
根据革兰氏染色和过氧化氢酶试验可初步判定这81株G+为乳酸菌。
2.以无菌白萝卜原汁+4%食盐水等比例混合为发酵培养基,用pH计和酸碱滴定法分别测定pH值和总酸,从上述81株菌株中筛选产酸速率快、产总酸量多的乳酸菌,并与从商品泡菜中分离的产酸速率最快的乳酸菌CK1进行Dunnet’s多重比较检验,结果表明,从自制泡菜中筛选的68株编号为BC6、LJ3、BC1、LJ7、PC1的5株乳酸菌在发酵6h时,pH值下降较快,从初始的5.36下降至4.12~4.43,发酵72h时产总酸量较多(17.10~17.96g/100mL)多,与CK1(pH=4.61,总酸量15.96g/100mL)的产酸速率和产总酸量形成显著性差异(P<0.05)。
酸菜中乳酸菌的筛选与初步鉴定
３２革 兰 氏染 色 ．
蛋 白胨水培 养基 ：蛋 白胨 １ｇ ０ ，氯化钠 ５ ，蒸 ｇ
馏水 １０ ｍｌ Ｈ ．～７４ ２ ℃ 湿 热灭 菌２ ｍｉ． ０ ０ ，ｐ ７２ ．．１ １ ０ ｎ
革 兰 氏染 色后 ，镜检 结果表 明 ：所选取 的 六 个
菌株 中Ｃ 号 为 阴性 ，其余 均 为革 兰氏 阳性 （图２）． ６ Ａ１ ２ ３ 、Ａ 、Ｂ 、Ｂ４ 、Ｃ５ 菌株都 呈 紫 色 ，即革 兰氏 染
等酸 菜企业 采 用现代 化 工 厂进 行 大规 模 生 产 ， 占据 工 业化 生产 奠定基 础 ．
了国际酸 菜 市场９ ％ｖ上 的份 额 ． ５ Ｙ ， 近年 来 ，在我 国部
基 金 项 目：玉 林 师 范 学院 高层 次人 才 科 研启 动 基 金
（ ２ ０ ０ ２． Ｇ ０９ ４ ）
利 于工 厂化 、规 模 化及 标 准化 生 产 ， 而且 容 易产 生 进 、 实现 产业 化 具有 重要 的 意 义． 研 究从 酸 菜 中 本
对人 体 有 害的 亚硝 酸 盐【 相 比之 下 ，韩 国 、 日本 筛选鉴 定 乳酸 茵 ，为开发 酸 菜的优 良发 酵剂 与现代 １ ・ ．
喜 爱． 菜汁 中富含 活性 乳 酸 茵 ，赋 予 酸 菜 多种 营 物 ，乳 酸菌的发 酵性能 直接影 响酸 菜的品质，采用纯 酸 ， ． 养保 健 功 效 ． 国的酸 菜制作 大 多沿 袭传 统 的 自然 种乳 酸 菌发酵 可 降低 发 酵蔬 菜中的亚硝 酸盐含 量ｐ 我
发 酵 工 艺 ，规 模 小 ，产量低 ，发 酵质 量 不稳 定 ，不 因此 ，深入 研 究酸 菜 中的乳 酸 茵 ，对 酸 菜质量 的 改
侗族发酵酸肉中乳酸菌的筛选及鉴定
等地区。侗族居 民有 “ 不离 酸” 食 的说 法 ， 其制 作 的发酵 酸
肉（ ａｘｗ ｄ） Ｎ ｎ ｕ１ 是经过乳 酸细菌 、 葡萄 球菌 、 酵母菌 、 微球 菌 等多个微生物菌群 自然发酵而成 ， 风味独 特 ， 营养丰富 ， 保存 期长 ， 可达数年之久。侗族 酸肉的制作法 为挑选新鲜 的猪腹 背肉 ， 切分成长条方形 ， 用适量食盐干腌数天 ， 沥干后按 一定 比例拌人炒 米及调料 ， 揉制均匀后装 坛密封发 酵。侗族 发酵 酸肉的微生物构 成复杂 ， 是筛选 肉品发酵剂 的宝贵 自然 菌种
可缩短生产的发酵时间 ， 有效抑制杂菌的生长 。但 并非所有
收 稿 日期 ：０ ８ — ２ ０ ￣６１ ０
基金项 目： 国家“ ６ ”汁划 （ ０ ６ Ａ１Ｚ ４ ） 江苏省科 技攻 关项 目 ８３ ２０Ａ ０３３ ； （ Ｅ ０ ６ ２ ） 江苏省农业科学院基金项 目（ １０ ４ ） 南 Ｂ ２０３６ ； ６ １６ ６ ； 京市科技攻关项 目 作者简介 ： 章德法（ ９２ ） 男 ， １ ８ 一 ， 江苏兴化人 ， 硕士研究生 ， 从事畜产品
的乳酸菌都适宜作为发 酵剂菌种 ， 的生 产工 艺适应性 弱 ， 有 有 的影响产 品感官品质 。研究表 明 ， 乳酸菌性能 的差异 对产 品品质影响很大 ， 因此筛选优 良性能 的乳酸菌是发酵香 肠 生产 的关 键 Ｊ 目前 国Ｃ － 酸菌 的筛 选研 究 主要 集 中 。 ｂ ％ 在提供 良好 的风味成分 ， 产生抗氧化剂和微生物抑制剂等功 能性质方面 。本研究通过分离 、 鉴定侗 族发酵酸 肉中的 乳 酸菌 ， 试图探明其 主要发酵 特性和生 长特性 ， 并从 中选择 出适合 发酵香肠生产 的优 良菌种 ， 以期 为肉品高活性发酵剂 的开发和应 用提供优质菌种资源 。
自然发酵黄豆酱中嗜盐乳酸菌的分离_鉴定与筛选
（１．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｎｏｒｔｈｅａｓｔ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｈａｒｂｉｎ １５００３０， Ｃｈｉｎａ； ２．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｐｏｌｙｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｈａｒｂｉｎ，Ｈａｒｂｉｎ １５００８６， Ｃｈｉｎａ）
总第 １６１ 期 ·２５·
生长性能和耐盐性好的乳酸菌；并通过对筛选菌种的进 一步改造，开发出一株适合豆酱和酱油工业生产用的耐 盐乳酸菌。 １ 材料与方法 １．１ 试验材料 １．１．１ 黄豆酱样品
从黑龙江省哈尔滨、伊春、牡丹江、佳木斯、鸡西、 齐齐哈尔、鹤岗和大庆等８个地区采集了１１份当年生产 自然发酵的黄豆酱样品。１１份样品均采用天然晒露发 酵制成，产品色泽明亮，酱香浓郁，口味纯正。 １．１．２ 培养基
高度耐盐的嗜盐四联球菌是黄豆酱发酵过程中主 要的乳酸菌，尤其在酱的后熟阶段占绝对优势。嗜盐四 联球菌在酱中的作用主要有４点：一是生成乳酸等小分 子有机酸，进而与酵母菌产生的醇类生成酯类呈香物 质，赋予黄豆酱独特的酱香风味，同时掩蔽豆酱中令人 不愉快臭味，如豆腥味和霉味等［１］。二是产酸使酱体的 ｐＨ 值 降 低 为 ４ ． ８￣５ ． ２ ，抑 制 有 害 微 生 物 如 大 肠 杆 菌 （Ｅ．ｃｏｌｉ ）、枯草芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等的生长［３］。
国内菌种库内尚无耐盐度高于１８％的乳酸菌，目前 使用较多的耐盐乳酸菌是沪酿１０８ 植物乳杆菌，其耐盐 度最高也仅能达到 １０％［８］。在日本等国家已经将这种嗜 盐性乳酸菌用于豆酱和酱油的工业生产［７］。黄豆酱是黑 龙江省非常典型的传统发酵豆制品，民间对此种产品生 产经验丰富，各地区的产品风味各异，有些产品已经实 现了规模化生产，而且在黄豆酱生产中可挖掘的微生物 资源常丰富。本文对黑龙江省部分地区传统自然发酵 黄豆酱中嗜盐乳酸菌进行分离、鉴定与筛选，以期找到
酸奶中乳酸菌的分离检测及纯化ppt课件
【实验材料、仪器与试剂】
实验材料：市售乳酸饮料或酸奶。 实验仪器：保温箱、高压蒸汽灭菌锅、水浴锅、 培养皿、试管、涂布器、酒精灯等。 实验试剂：脱脂乳试管、脱脂奶粉、5%蔗糖水、 1.6%溴甲酚紫、95%乙醇溶液、酵母膏、 琼脂、无菌水
【实验步骤】
1、1.6%溴钾酚紫牛乳培养基的制备
2、脱脂乳试管的制备
3、酸奶中乳酸菌的分离 4、乳酸菌的检测、纯化培养
（1）、1.6%溴甲酚紫牛乳培养基的制备
配料： （A）液：脱脂奶粉100g，水500ml，加入1.6%溴甲酚紫、乙醇溶液1ml， 80℃灭菌20min。 （B）液：酵母膏10g，水500ml，琼脂20g ，pH6.8， 121℃湿热灭菌20min。 操作： （1）、按照配方正确称取所需药品放于烧杯中，在搪瓷杯中加入所需水 量，玻棒搅匀，加热溶解，用1N NaOH或1N HCl调pH，加琼脂溶化，加 热过程要不断搅拌，可适当补水。琼脂完全溶解后 倒入250mL的锥形 瓶中，贴上标签，在高压锅中灭菌20min。 （2）、灭好菌的A液和B液趁热充分混合，并在酒精灯的附近趁热倒平板 。
10ml 1.0ml 1.0ml 1.0ml 1.0ml 1.0ml 1.0ml
10-1
花园酸奶 90ml无菌水 9ml无菌水 9ml无菌水 9ml无菌水 9ml无菌水 9ml无菌水 9ml无菌水
10-2
10-3
10-4
10-5
10-6
10-7
另留一管不稀释留作对照（CK）
（2）、分离方法
A．平板划线 接种环挑取10-1菌液，按无菌操作对标有”10-1”的3个平板进 行划操作；划线完毕后，盖上皿盖，倒置放在40℃恒温培养箱中培 养48小时。
B．平板涂布
乳酸菌的鉴定
乳酸菌的鉴定吲哚试验1）.试管标记：取装有蛋白胨水培养基的试管2支，分别标记乳酸菌和空白对照。
2）.接种培养：以无菌操作分别接种少量菌苔到标记乳酸菌的试管中，标记有空白对照的不接种，置37摄氏度恒温箱中培养24~48小时。
3）.观察记录：在培养基中加入乙醚1~2 ml ,经充分振荡，使吲哚萃取至乙醚中，静置片刻后乙醚层浮于培养液的上面，此时沿管壁缓慢加入5~10滴吲哚试剂，如有吲哚存在，乙醚层呈玫瑰色，此为吲哚试验阳性反应，否则为阴性反应。
糖发酵试验1）.试管标记：取分别装有葡萄糖，蔗糖发酵培养液试管各2支，每种糖发酵试管中分别标记乳酸菌和空白对照。
2）.接种培养：以无菌操作分别接种少量菌苔至以上各相应试管中，每种糖发酵培养液的空白对照均不接菌。
将装有培养液的杜氏小管倒置试管中，置37摄氏度恒温培养箱中培养24小时，观察结果。
3）.观察记录：与对照管比较，若接种培养液保持原由颜色，其反映结果为阴性；如果培养液呈黄色，反映结果为阳性。
培养液中的杜氏小管内有气泡为阳性反应，杜氏小管内没有气泡为阴性反应。
1.2.3 乳酸的检测选用已经分离的菌种做小型发酵实验，取发酵液的上清液约10 ml于试管中，加入10%硫酸1 ml ,再加2%高锰酸钾 1 ml ,此时乳酸转化为乙醛，把事先在含氨的硝酸银溶液中侵泡的滤纸条搭在试管口中，微火加热试管至沸，观察滤纸变化。
1.结果和分析2.1 乳酸菌的分离提纯在平板上出现了圆形稍扁平的黄色菌落，周围培养基变为黄色，初步定为乳酸菌⑴，取出少量在显微镜下观察到了链球状和杆状两种形状（如图一2.2乳酸菌的鉴定该菌种的菌落为圆形稍扁平的黄色菌落，有杆状和链球状两种形状。
在吲哚试验中，加入菌种的试管无任何变化，证明为阴性反应（如图二）。
说明该菌不具有分解色氨酸产生吲哚的能力。
也说明此菌种不是大肠杆菌，因为大肠杆菌的吲哚试验证明为阳性。
在糖发酵试验中，在加入葡萄糖的发酵培养液中加入菌种后，培养液变为黄色，反应结果为阳性，且杜氏小管内无气泡（如图三）；加入蔗糖的发酵培养液中加入菌种后的反应结果也为阳性且杜氏小管内无气泡（如图四）。