耐盐乳酸菌的筛选和鉴定
乳酸菌的筛选
乳酸菌的筛选（初筛）一、实验目的对采集的仔猪粪便进行梯度稀释和平板涂布，对猪粪中的肠源菌进行初步的筛选。
二、实验材料PBS、2mL离心管、MRS肉汤、琼脂、冰袋、保温盒、封口膜、200μL 枪头等。
三、实验步骤1、实验前准备：用MRS肉汤配置MRS固体培养基（内含有1.5%琼脂，1%CaCO3），121℃灭菌15min后倒平板，备后面涂布使用，2mL 离心管中加入1mLPBS备后面实验使用。
2、采样：使用已灭菌的200μL枪头挑取仔猪猪粪适量，放入事先准备好的2mL加有PBS的离心管中，取样标准为每窝仔猪取5个样品，采完样品后，用封口膜将离心管口封住，并放入准备好的装有冰袋的保温盒中保存。
3、涂布：将采好的样品用螺旋振荡器混匀，取100μL样品混匀液，加入900mL的离心管中进行梯度稀释，取10-4、10-5梯度菌液进行平板涂布。
4、培养：将涂布好的平板依次标好时间、稀释浓度和样品编号后，置于厌氧培养箱中37℃培养24h。
5、培养完成后，对所涂布的平板进行拍照留底。
乳酸菌的筛选一、实验目的利用平板划线的原理，对涂布出的单菌落进行划线纯化。
二、实验原理平板划线法是指把杂菌样品通过在平板表面划线稀释而获得单菌落的方法。
一般是将混杂在一起的不同种微生物或同种微生物群体中的不同细胞，通过在分区的平板表面上作多次划线稀释，形成较多的独立分布的单个细胞，经培养而繁殖成相互独立的多个单菌落。
通常认为这种单菌落就是某微生物的“纯种”。
实际上同种微生物数个细胞在一起通过繁殖也可形成一个单菌落，故在科学研究中，特别是在菌种鉴定等工作中，必须对实验菌种的单菌落进行多次划线分离，才可获得可靠的纯种。
四、实验步骤1、MRS培养基的配置：用MRS肉汤按每升48g计算配置，向其中加入1.5%的比例加入琼脂，按1%的比例加入CaCO3后，121℃灭菌15min。
2、倒平板：培养皿灭菌，烘干后，取灭菌的MRS固体培养基倒平板（每个平板倒10mL左右），放入4℃冰箱备用。
东北传统酱腌菜中耐盐乳酸菌的筛选、鉴定及其发酵特性研究
东北传统酱腌菜中耐盐乳酸菌的筛选、鉴定及其发酵特性研究目录一、内容概述 (2)1. 研究背景与意义 (2)2. 国内外研究现状 (3)3. 研究内容与方法 (4)二、材料与方法 (6)1. 材料选取 (6)东北传统酱腌菜样品采集 (7)耐盐乳酸菌分离纯化 (8)2. 实验室培养条件 (9)培养基选择与制备 (10)培养方法与步骤 (11)3. 耐盐乳酸菌筛选 (12)斜面初筛 (13)耐盐性测试 (14)4. 耐盐乳酸菌鉴定 (15)16S rDNA序列分析 (16)准备好凝胶电泳 (17)5. 发酵特性研究 (18)发酵条件优化 (19)产物分析 (20)三、结果与讨论 (21)1. 耐盐乳酸菌的筛选结果 (22)不同样品中的耐盐乳酸菌数量对比 (23)耐盐乳酸菌的生理生化特征 (24)2. 耐盐乳酸菌鉴定结果 (25)16S rDNA序列比对与分析 (26)准备好凝胶电泳图谱 (27)3. 发酵特性分析 (28)四、结论与展望 (29)1. 研究结论 (30)2. 研究创新点 (31)3. 研究不足与展望 (32)一、内容概述本研究聚焦于东北传统酱腌菜中耐盐乳酸菌的筛选、鉴定及其发酵特性，旨在深入挖掘和利用这一宝贵资源。
在筛选阶段，我们采集了多种东北传统酱腌菜样品，并经过严格筛选，成功分离出多株具有耐盐特性的乳酸菌。
这些乳酸菌在高盐环境中仍能保持旺盛的生长势头，显示出出色的耐盐能力。
我们运用先进的生理生化鉴定方法和分子生物学技术对这些乳酸菌进行了鉴定。
通过对比分析，确定这些菌株的分类地位及遗传特性，为东北传统酱腌菜的发酵剂提供科学依据。
在探究其发酵特性的过程中，我们对这些乳酸菌的生长曲线、产酸能力、耐盐能力等关键指标进行了系统研究。
这些研究结果不仅揭示了乳酸菌在酱腌菜发酵过程中的重要作用，还为其在工业生产中的应用提供了理论支持。
本研究不仅全面了解了东北传统酱腌菜中耐盐乳酸菌的种类和特性，还为优化酱腌菜生产工艺、提升产品质量提供了新的思路和方向。
豆豉和腐乳中耐盐乳酸菌的筛选鉴定
乳酸菌的耐药检测方案
乳酸菌的耐药检测方案试验方案：一、样品的取样在青岛胶州市的正规超市购买5种酸奶，进行实验时均处于产品保质期内。
对这几种样品分别进行取样。
二、样品的稀释在无菌工作台上用灭菌过的移液管直接从酸奶样品中吸取1mL装入9ml无菌生理盐水试管中，快速震荡试管，，使其呈1:10的均匀稀释液，同法继续稀释成10-2、10-3、10-4、10-5、10-6稀释度，选取合适的三个稀释度（如：10-1、10-2、10-3）按此操作依次制备成A1-A2-A3、B1-B2-B3、C1-C2-C3、D1-D2-D3、E1-E2-E3的样品稀释液。
三、样品的分离鉴定1、分别用移液枪吸取A-E的样品稀释液250μL置于MRS固体培养基（MRS培养基成分：蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母粉5g，K2HPO4 2g，柠檬酸二铵2g，乙酸钠5g，葡萄糖20g，吐温80 1mL，MgSO4·7H2O 0.58g，MnSO4·4H2O 0.25g，（琼脂15～20g），蒸馏水1000mL）平板上，涂布均匀后置于37℃培养箱培养24h，观察培养结果及细菌的生长情况。
用接种环在各平板上挑取出现不同菌落形态大小的单一黄色菌落，分别在平板上划线，37℃倒置培养24h。
2、根据菌落的大小、颜色、光泽和透明程度等，从培养24h的每个平板中选取单菌落，在MRS固体平板上反复划线纯化，反复进行此操作步骤以使最终培养出的每个菌落都为单一菌种菌落，37℃培养24h。
然后依次进行菌体形态观察、过氧化氢酶试验、淀粉水解试验、明胶液化试验、乙酰甲基甲醇试验、产气试验、碳水化合物发酵试验、乳酸定性检测。
（1）菌体形态的观察将划线平板上培养了24h的各菌株在载玻片上涂片及固定后，进行革兰氏染色。
先用草酸铵结晶紫初染色，1分钟后水洗载玻片，然后碘液媒染1分钟，水洗、吸干。
95%乙醇脱色直到滴加的酒精不出现紫色，接着水洗、吸干。
最后用0.5%的番红染色液再染色10-30秒，水洗，干燥，置于光学显微镜下观察其形态特点及染色结果。
耐酸耐胆盐益生乳酸菌的筛选与鉴定
耐酸耐胆盐益生乳酸菌的筛选与鉴定吕源玲【摘要】为了筛选出人源性的耐酸、耐胆盐的益生菌,利用含胆盐(0.2%)的5种选择性培养基(TPY、BHI、MRS、SL、乳酸杆菌选择性琼脂培养基),以溴甲酚紫为酸性指示剂,从婴儿粪便中初步筛选出42株耐胆盐的乳酸菌.根据菌株在pH5.0,4.0,3.5的MRS液体培养基中培养时OD值的变化情况,筛选出3株具有较好酸耐受性的菌株.然后通过平板菌落计数方法测定筛选出的3株菌在pH 3.0条件下0~3 h存活率的变化情况,筛选出对酸和胆盐耐受能力最强且最稳定的菌株经16S rDNA分子生物学鉴定为Lactobacillus plantarum.该菌能够作为潜在的益生菌菌株用于后期深入地挖掘其益生功能.%In order to screen human probiotics with the acid and bile resistant abilities, infant stool diluents were spread on five different selective ager plates including TPY, BHI, MRS and SL in this study.42 strains of lactic acid bacteria with certain bile-tolerance were isolated by selective ager media for lactobacilli, supplemented with bile salt (0.2%) and bromcresol purple as an acid indicator.3 strains of lactic acid bacteria with high acid tolerance were further selected from 42 strainsaccording to biomass of their cultured in the MRS liquid medium with pH 5.0, pH 4.0 and pH 3.5 respectively.Then the viability of these 3 strains in MRS medium with pH 3.0 was measured by plate colony count technique, resulting in one of them with the highest acid-and bile salt-tolerance.Then this strain was subsequently identified using 16S rRNA-based molecular biological approaches.The strain was molecularlyidentified to ctobacillus plantarum.The strain could be used as a potential probiotic strain for late digging its probiotic function.【期刊名称】《食品与机械》【年(卷),期】2017(033)006【总页数】4页(P42-45)【关键词】乳酸菌;耐胆盐;耐酸;筛选;鉴定【作者】吕源玲【作者单位】江南大学食品学院, 江苏无锡 214122【正文语种】中文作为人和动物肠道的正常菌群的益生乳酸菌，具有许多益生功效[1]。
耐盐乳酸菌的筛选和鉴定
耐盐乳酸菌的筛选和鉴定摘要：本实验从酱油厂提供的酱油原醅中分离筛选出耐盐乳酸菌，该菌在18%以上NaCl 浓度的条件下能够正常生长代谢，初步鉴定其为四联球菌属，可用于高盐稀醪酱油酿造目前国内尚无耐盐度达18%的乳酸菌种, 该菌种的成功选育为国内首创。
关键词乳酸菌耐盐筛选鉴定酱油采用高盐稀醪发酵工艺生产时能有更好的质量和香味。
其工艺上需要在酱醅发酵过程中添加酵母菌和乳酸菌。
然而酱油的含盐度高达18%，这就需要选育出耐盐菌种。
关于耐盐酵母的应用报道已有很多。
而乳酸菌方面，目前在国内菌种库内尚无耐盐度达18%的菌种。
我们作为酱油大国，筛选出耐盐度达18%的嗜盐乳酸菌的意义则显得十分重大。
本实验主要对高盐稀态发酵工艺酱醅中嗜盐乳酸菌进行分离筛选及鉴定。
1 材料与方法材料酱醅、草酸铵结晶紫液（革兰氏A液）、路哥尔氏碘液（革兰氏B液）、蕃红花红（沙黄）、生理盐水。
实验方法1.2.1 分离筛选流程(如图1)1.2.2 筛选方法十倍稀释法、平板涂布法、斜面之字划线法、平板四分法划线。
1.2.3 鉴定方法1.2.3.1 革兰氏染色法1.2.3.2 过氧化氢酶接触酶测定取一环琼脂斜面的培养物，涂于干净载玻片上，然后加1 滴3%-15% H2O2，若有气泡产生则为阳性反应，无气泡为阴性反应。
或将3%-15% H2O2加到斜面的菌苔上观察是否有气泡的产生。
1.2.3.3 生化鉴定管使用方法挑取待检菌革兰氏染色镜检，将新鲜菌苔接种于普通肉汤中，37摄氏度培养18-24h。
各吸取（约1-2滴）的肉汤培养物或菌悬液加入每种微量生化管内，将已接种生化管套上无菌塑料帽直立于三折吸塑短架内，于35-37摄氏度培养箱中培养。
1.2.3.4 高效液相色谱HPLC 测量乳酸含量(图2)2 结果与讨论耐盐乳酸菌的筛选2.1.1 富集培养分离初筛(如图3)耐盐度能达10%以上的乳酸菌基本都在片球菌属和四联球菌属这二个属内。
而四联球菌的耐盐度更高达18%以上，所以我们分离筛选的目标在四联球菌上。
耐盐乳酸菌的筛选和鉴定
耐盐乳酸菌的筛选和鉴定摘要：本实验从酱油厂提供的酱油原醅中分离筛选出耐盐乳酸菌，该菌在18%以上NaCl 浓度的条件下能够正常生长代谢，初步鉴定其为四联球菌属，可用于高盐稀醪酱油酿造目前国内尚无耐盐度达18%的乳酸菌种, 该菌种的成功选育为国内首创。
关键词乳酸菌耐盐筛选鉴定酱油采用高盐稀醪发酵工艺生产时能有更好的质量和香味。
其工艺上需要在酱醅发酵过程中添加酵母菌和乳酸菌。
然而酱油的含盐度高达18%，这就需要选育出耐盐菌种。
关于耐盐酵母的应用报道已有很多。
而乳酸菌方面，目前在国内菌种库内尚无耐盐度达18%的菌种。
我们作为酱油大国，筛选出耐盐度达18%的嗜盐乳酸菌的意义则显得十分重大。
本实验主要对高盐稀态发酵工艺酱醅中嗜盐乳酸菌进行分离筛选及鉴定。
1 材料与方法1.1 材料酱醅、草酸铵结晶紫液（革兰氏A液）、路哥尔氏碘液（革兰氏B液）、蕃红花红（沙黄）、生理盐水。
1.2 实验方法1.2.1 分离筛选流程(如图1)1.2.2 筛选方法十倍稀释法、平板涂布法、斜面之字划线法、平板四分法划线。
1.2.3 鉴定方法1.2.3.1 革兰氏染色法1.2.3.2 过氧化氢酶接触酶测定取一环琼脂斜面的培养物，涂于干净载玻片上，然后加1 滴3% -15% H2O2，若有气泡产生则为阳性反应，无气泡为阴性反应。
或将3%-15% H2O2加到斜面的菌苔上观察是否有气泡的产生。
1.2.3.3 生化鉴定管使用方法挑取待检菌革兰氏染色镜检，将新鲜菌苔接种于普通肉汤中，37摄氏度培养18-24h。
各吸取0.05-0.08ml（约1-2滴）的肉汤培养物或菌悬液加入每种微量生化管内，将已接种生化管套上无菌塑料帽直立于三折吸塑短架内，于35-37摄氏度培养箱中培养。
1.2.3.4 高效液相色谱HPLC 测量乳酸含量(图2)2 结果与讨论2.1 耐盐乳酸菌的筛选2.1.1 富集培养分离初筛(如图3)耐盐度能达10%以上的乳酸菌基本都在片球菌属和四联球菌属这二个属内。
乳酸菌的分离鉴定方法和功能研究
乳酸菌的分离鉴定方法和功能研究摘要:乳酸菌是一类具有多种生理功能的细菌，本文通过阐述乳酸菌不同来源的分离鉴定方式，探讨了乳酸菌的部分主要生理功能。
关键词:乳酸菌分离鉴定功能Abstract: Lactic acid bacteria are a kind of many physiological functions of bacteria, this paper explains the separated and identified from different sources of lactic acid bacteria, and probes into the way of its part main physiological function.Keywords: lactic acid bacteria separated and identified function乳酸菌是一类广泛分布于自然界、与人类生活密切相关、可发酵碳水化合物、产生乳酸的细菌，然而，乳酸菌的许多特性是由其基因编码决定的【1】，利用这一特性，人们可以用乳酸菌作为载体，在食品及医药领域中构建表达系统。
乳酸菌具有控制肠道感染，改善乳糖代谢，增加某些食物的营养价值，诱导体内特异性及非特异性免疫等作用。
乳酸菌为革兰氏阳性菌，细胞形态为杆状或球状，生殖方式为裂殖，消耗葡萄糖50％以上，产生乳酸分解蛋白质，但不产生腐败产物，不形成内生孢子，无运动性或极少运动，目前己发现的乳酸菌在细菌分类学上有18个属【2】。
通过对乳酸菌分离鉴定，可测定其生理功能。
一、乳酸菌的分离鉴定乳酸菌的来源广泛，腌菜、发酵肉制品、腐乳、酱醅、牛乳等食物中乳酸菌的含量极其丰富。
（一）腌菜盐水中乳酸菌的分离与鉴定乳酸菌广泛存在于泡菜和腌菜等食品中，此类乳酸菌较耐盐，因此，以腌菜为样品，分离优良乳酸菌株，将其应用到含盐量较大的食品中，可以改善食品的风味，提高食品的质量。
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耐盐乳酸菌的筛选和鉴定
摘要：本实验从酱油厂提供的酱油原醅中分离筛选出耐盐乳酸菌，该菌在18%以上NaCl 浓度的条件下能够正常生长代谢，初步鉴定其为四联球菌属，可用于高盐稀醪酱油酿造目前国内尚无耐盐度达18%的乳酸菌种, 该菌种的成功选育为国内首创。
关键词乳酸菌耐盐筛选鉴定
酱油采用高盐稀醪发酵工艺生产时能有更好的质量和香味。
其工艺上需要在酱醅发酵过程中添加酵母菌和乳酸菌。
然而酱油的含盐度高达18%，这就需要选育出耐盐菌种。
关于耐盐酵母的应用报道已有很多。
而乳酸菌方面，目前在国内菌种库内尚无耐盐度达18%的菌种。
我们作为酱油大国，筛选出耐盐度达18%的嗜盐乳酸菌的意义则显得十分重大。
本实验主要对高盐稀态发酵工艺酱醅中嗜盐乳酸菌进行分离筛选及鉴定。
1 材料与方法
1.1 材料
酱醅、草酸铵结晶紫液（革兰氏A液）、路哥尔氏碘液（革兰氏B液）、蕃红花红（沙黄）、生理盐水。
1.2 实验方法
1.2.1 分离筛选流程(如图1)
1.2.2 筛选方法
十倍稀释法、平板涂布法、斜面之字划线法、平板四分法划线。
1.2.3 鉴定方法
1.2.3.1 革兰氏染色法
1.2.3.2 过氧化氢酶接触酶测定
取一环琼脂斜面的培养物，涂于干净载玻片上，然后加1 滴3% -15% H2O2，若有气泡产生则为阳性反应，无气泡为阴性反应。
或将3%-15% H2O2加到斜面的菌苔上观察是否有气泡的产生。
1.2.3.3 生化鉴定管使用方法
挑取待检菌革兰氏染色镜检，将新鲜菌苔接种于普通肉汤中，37摄氏度培养18-24h。
各吸取0.05-0.08ml（约1-2滴）的肉汤培养物或菌悬液加入每种微量生化管内，将已接种生化管套上无菌塑料帽直立于三折吸塑短架内，于35-37摄氏度培养箱中培养。
1.2.3.4 高效液相色谱HPLC 测量乳酸含量(图2)
2 结果与讨论
2.1 耐盐乳酸菌的筛选
2.1.1 富集培养分离初筛(如图3)
耐盐度能达10%以上的乳酸菌基本都在片球菌属和四联球菌属这
二个属内。
而四联球菌的耐盐度更高达18%以上，所以我们分离筛选的目标在四联球菌上。
四联球菌的菌落为乳白色，成小圆点状。
显微镜下观察，菌体四联或成对，极少成单。
这便是我们初筛时的重要依据。
用富集培养基取代分离培养基对酱油曲进行培养在这样的条件下培养。
两天后平板上出现的菌落有不少类似于乳酸菌。
将镜检为球菌的菌落挑出，进行液体培养。
然后从中筛选出具有四联形态的菌种。
2.1.2 菌种的纯化（复筛）
将初筛菌种在含15%NaCl浓度的液体培养基中培养在培养过程中
定期镜检，观察菌种的生长状况。
生长4天后,进行平板涂布、之字形划线以及平板四分法划线分离。
然后从经培养后的平板和斜面上挑出镜检为四联球菌特征的菌落继
续培养。
如此反复，直到确定其为单一菌株为止。
最后在OLYMPUS BX51 型正置照相显微镜下的观察。
对菌种进行保藏。
2.2 耐盐乳酸菌的鉴定
2.2.1 菌落形态
待鉴定菌的菌落形态，成乳白色，油脂状。
在30摄氏度pH约7.0
的液体培养基和琼脂平板或斜面上均能正常生长。
2.2.2 革兰氏染色和过氧化氢酶测定
对所筛菌种做革兰氏染色，成阳性反应。
利用电子显微镜对菌种
拍照如图9。
2.2.3 pH 值对待鉴定菌种生长的影响
在片球菌与气球菌的鉴别上，pH值是一个重要的区分因素。
片球菌在pH5下能生长，而气球菌则不能；在pH9.0的情况则正好相反。
本实验分别做了液体培养基初始 pH=4.5和9.0下的生长情况记录。
乳酸菌在其生长过程中会产生乳酸、醋酸等有机酸，从而降低培养基的pH值。
而当pH值降低到一定程度后，又会反过来抑制乳酸菌的生长。
从表2 可看到在培养基初始pH=4.5的情况下，该菌种还能生长，但从第二天开始，生长则变得比较缓慢。
所以，可得出结论：待鉴定菌是可以在pH =5.0下生长的。
由于没能找到能有效维持液体培养基 pH值在9.0的缓冲溶液，所以，即使初始pH为9.0，但伴随着极少数乳酸菌的生长代谢，溶液pH 值也将不断下降，从而使其逐渐变得适合该菌生长。
所以初始pH =9.0的这组生长记录数据不能取用。
但我们可以从表中看到从第四天到第六天，OD600 值有很大的提高。
验证了前面培养基会逐渐变得适合菌种生长的推断。
基于以上数据我们判断待鉴定菌为片球菌属。
3 结论
3.1 酪蛋白水解物具有明显促进酸奶发酵的作用。
随水解物添加量增加，促进发酵程度提高1.5%-2.0%添加量的水解物对酸奶的促发酵效果接近。
3.2 添加酪蛋白水解物改变了酸奶发酵过程中的pH下降：速度添加样在发酵前4h的pH下降速度高于空白样，而发酵4h后空白样的pH 降速度略快；发酵中期，二者的pH下降速度存在最大差距。
3.3 不同水解程度的酪蛋白水解物，在对酸奶的促发酵程度上，表现出随水解程度增加，促发酵程度提高除2h水解物的促发酵程度较小外，8h ，12h，和24h三种水解物的促发酵能力基本相当（三者的凝
乳时间，产酸速度发酵时间都接近）。
3.4 二者的质构比较表明添加2%酪蛋白水解物对酸奶的质构有所改善，赋予酸奶更丰厚的口感，改善酸质地并提高稳定性。