Dickkopf1_DKK_1__省略_因甲基化在急性白血病中的表达分析_朱珣珣

2ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ12 年 5 月 M ay 2012
Dickkopf1（ DKK-1） 基因甲基化在急性 白血病中的表达分析
朱珣珣1 ，朱传升2 ，王焱2 ，徐文伟2 ，董琳2 ，郭燕2 ，李洪丽1 ，毕可红2
（ 山东大学 1． 医学院，济南 250012； 2． 附属千佛山医院血液科，济南 250014）
摘要： 目的 探讨 WNT / β-catenin 通路的关键抑制因子 Dickkopf1（ DKK-1） 基因异常甲基化与急性白血病（ AL）
朱珣珣，等． Dickkopf1（ DKK-1） 基因甲基化在急性白血病中的表达分析
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白，作为 WNT / β-catenin 通路的关键抑制因子，在 胚胎细胞的定向分化，尤其在头部的分化过程中发 挥重要作用［2］。Dickkopf1 （ DKK-1） 是新近发现的 DKKs 家 族 成 员 之 一。 DKK-1 可 与 Wnt 受 体 LRP5 /6 及另一类穿膜蛋白 Kremen1 /2 结合，从而 阻断 Wnt 信号的传导［3-4］。其基因启动子区域甲基 化后可致表达降低。本研究通过检测急性白血病 （ AL） 患者及 AL 细胞系中 DKK-1 基因 CpG 岛甲 基化情况及其 mRNA 表达水平，探讨其在 AL 发病 机制中的作用。
血病中是一种较为普遍的现象，其参与了部分急性白血病的发病过程。
关键词： 基因，Dickkopf1； 甲基化； 白血病
中图分类号： R733
文献标志码： A
Analysis of methylation of the Dickkopf1 （ DKK-1） gene in acute leukemia
ZHU Xun-xun1 ，ZHU Chuan-sheng2 ，WANG Yan2 ，XU Wen-w ei2 ， DONG Lin2 ，GUO Yan2 ，LI Hong-li1 ，BI Ke-hong2
10 min，反应体系共 50 μL。PCR 产物进行 2% 琼脂 糖凝胶电泳，GAPDH 作为内参照，UV 凝胶电泳成 像及图像分析系统进行图像分析。DKK-1 基因（ 基 因编号： NM012242． 1） 引物（ 上海生物工程技术服 务有限公司合成） 序列为： 上游 5'-TGGTCCAAGATCTGTAAACCTGTCC-3'； 下游 5'-CTGGCTTGATGGTGATCTTTCTGTA-3'； 片段长度 149 bp。内 参 GAPDH 引物（ 北京鼎国昌盛生物技术有限责任公 司） 序列为： 上游 5'-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3'； 下游 5'-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3'； 片 段长度 258 bp。 1． 2． 5 DKK-1 基因甲基化状态检测 采用甲基化 特异性聚合酶链式 反 应 （ M SP） 进 行 检 测，取 适 量 DNA 标 本 进 行 甲 基 修 饰，经 亚 硫 酸 氢 盐 处 理 后， DNA 序列中的 C 转变为 U，而基因的 CpG 岛发生 甲基化后，则不能发生这种改变。甲基 修 饰、PCR 扩增按照 GENMED 基因甲基化检测试剂盒（ 上海 杰美公司） 操作要求进行。PCR 反应条件为： 95 ℃ 预变性 5 min 后，95 ℃ 变性 30 s，60． 5 ℃ （ 甲基化引 物） 或 55． 2 ℃ （ 非甲基化引物） 退火 30 s，72 ℃ 延伸 30 s，30 个循环后，72 ℃ 继续延伸 5 min。反应体系 共 25 μL。扩增产物经 2% 琼脂糖凝胶电泳，用 UV 凝胶电泳成像及图像分析系统进行图像分析。M SP 阳性对照采用基因组 DNA 经甲基化酶（ Sss I，New England BioLabs 公司） 处理以后进行 PCR，阴性对 照用灭 菌 双 蒸 水 取 代 DNA 模 板 进 行 PCR。选 取 10% 标本进行重复实验。DKK-1 基因引物序列（ 上 海生物工程技术服务有限公司合成） 为： 甲基化引 物 序 列： 上 游 5'-AGGGGTCGGAATGTTTCGGGTTCGC-3'； 下 游 5'-CCTAAATCCCCACGAAACCGTACCG-3'； 扩增产物长度 157 bp。非甲基化引物： 上 游 5'-TTAAGGGGTTGGAATGTTTTGGGTTTGT-3'； 下 游 5'-AAACCTAAATCCCCACAAAACCATACCA-3'； 扩增产物长度 163 bp。 1． 3 统计学处理 采用 SPSS 13． 0 进行统计分析， 均数用 x珋± s 表示，正常对照组与 AM L、ALL 组之间 以及 AM L 与 ALL 组之间 DKK-1 基因甲基化发生 频率比较采用 χ2 检验，DKK-1mRNA 的表达量比 较采用 t 检验，以 P ＜ 0． 05 为差异有统计学意义。
1 资料与方法
1． 1 资料 1． 1． 1 临床资料 临床骨髓标本来自山东大学附 属千佛山医院血液科 2010 年 10 月至 2011 年 7 月 收治并 诊 断 明 确 的 AL 患 者 65 例，包 括 AM L 28 例、ALL 37 例，其中男 36 例，女 29 例，12 ～ 76 岁， 中位年龄 34 岁。所有患者均符合 FAB 国际分型诊 断标准。正常对照 20 例，均为我院收诊的非恶性血 液病患者。所有受试者均知情同意。 1． 1． 2 细胞系 急性 T 细胞白血病细胞系（ Jurkat） 、 急性早幼粒细胞白血病细胞系（ NB4） 、T 淋巴母细 胞瘤细胞系 （ CEM ） 、急性淋巴细胞白血病细胞系 （ M olt-4） 由千佛山医院中心实验室提供。 1． 2 方法 1． 2． 1 单个核细胞的提取 采用淋巴细胞提取液 对 65 例 AL 骨髓标本与 20 例对照组骨髓标本进行 单个核细胞提取，1 × PBS 洗 2 遍，－ 80 ℃ 冻存。 1． 2． 2 细胞培养 4 种细胞系细胞按常规复苏后， 培养 于 含 10% 胎 牛 血 清 （ 四 季 青） 及 1% 双 抗 的 RPM I-1640 培养基中，置于 37 ℃ 、5% CO2 培 养 箱 中。细胞均为悬浮生长。 1． 2． 3 RNA 与 DNA 的 提 取 采 用 Trizol 试 剂 （ TAKARA） 提取 RNA，采用 DNA 提取试剂盒（ 北 京全式金公司） 提取 DNA，具体步骤按照说明书进 行，紫外分光光度计下检测 RNA 与 DNA 的提取浓 度及 OD 值。 1． 2． 4 DKK-1 基因 mRNA 的测定 采用逆转录聚 合酶链 式 反 应 （ RT-PCR） 方 法 进 行 检 测，逆 转 录、 PCR 扩增反应均按试剂盒（ 北京全式金公司） 说明 书进行操作。逆转录反应条件： 42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min，反 应 体 系 共 20 μL。 PCR 扩 增 反 应 条 件： 94 ℃ 预 变 性 5 min 后，94 ℃ 变 性 30 s，65 ℃ 退 火 30 s，72 ℃ 延 伸 30 s，35 个 循 环，72 ℃ 继 续 延 伸
发病机制的相关性。方法 采用逆转录聚合酶链式反应（ RT-PCR） 方法检测 4 个 AL 细胞系（ NB4、Jurkat、M olt-4、
CEM ） 、65 例 AL 患者及 20 例正常对照骨髓单个核细胞中 DKK-1 基因 mRNA 的表达情况； 采用甲基化特异性
PCR（ M SP） 方法检测各标本及细胞系中 DKK-1 基因启动子区域的甲基化状态。结果 与正常对照组比较，AL 患
Abstract： Objective To investigate the relationship betw een the abnormal methylation of the Dickkopf1 （ DKK-1 ） gene，w hich is a key inhibiting factor of the WNT / β-catenin pathw ay，and acute leukemia （ AL） ． Methods Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction （ RT-PCR） w as used to examine DKK-1 mRNA expression in 4 AL cell lines （ NB4，Jurkat，M olt-4，and CEM ） of 65 AL patients and 20 normal controls． M ethylation-Specific Polymerase Chain Reaction （ M SP） w as used to examine the CpG-island methylation status of the DKK-1 gene in AL cell lines of AL patients and the controls． Results Compared w ith that in the normal controls，the expression of the DKK-1 gene w as significantly reduced in the AL patients （ P ＜ 0． 05 ） ． None of the normal mononuclear cells show ed methylation of the DKK-1 gene． DKK-1 methylation w as found in 24 of the 65 （ 37． 7% ） AL patients． The frequencies of aberrant DKK1 methylation w ere 41． 2% （ 14 /34） in the acute lymphoblastic leukemia（ ALL） patients，and 28． 6% （ 10 /31） in the acute myelocytic leukemia（ AM L） patients． Conclusions M ethylation and aberrant expression of the DKK-1 gene are common in AL and also play a role in the pathogenesis of some AL． Key words： Gene，Dickkopfl； M ethylation； Leukemia