腈水合酶产生菌Rhodococc_省略_sp_HUST_1发酵条件的优化_朱婷婷
腈水解酶重组茵发酵产酶条件的优化及应用
Ｃｈ ｍｉｔｙ ＆ Ｂｉｅｎ ｉｅ ｉｇ ｅ ｓｒ ｏ ｇ ｎ ｅｒ ｎ
ｄ ｉ１ ． ９ ９ ｊｉｓ ． ６ ２ ４ ５ ２ １ ． ３ ０ ６ ｏ ：０ ３ ６ ／．ｓｎ １ ７ —５ ２ ． ０ ２ ０ ． ０
腈 水 解 酶 重 组 茵 发 酵 产 酶 条 件 的优 化 及 应 用
解 酶 基 因 的 工 程 菌 Ｅ．ｏｉ Ｌ １ Ｄ ３ ／ Ｅ ８ （ ） ｃｌ Ｂ ２ （ Ｅ ） ｐ Ｔ２ ｂ ＋ 一
Ｒ一 一）扁 桃酸 的生 产 方 法 主 要 有 化 学 法 和 生 物 （ 一
法 ， 中生物 法 中的腈水 解酶 催化法 由于底物 价廉 、 其 反 应 条件 温 和 、 环境 污染小 、 化率高 、 物光学 纯度 高 ， 转 产
Ｘ ｅ ［ ¨ 通 过大 规 模 的筛 选 和育 种 ， 得 一株 ｕ等 １ ］ 获 高活 性 的 立 体 选 择 性 腈 水 解 酶 菌 株 Ａ． ａ ｃ ｌ ｆ ｅａｉ ｓ
Ｚ ＵＴ １ ， 利用该 腈水 解 酶 进行 了生 物催 化 外 消旋 Ｊ Ｂ ０并 扁桃 腈生 产 Ｒ一 一）扁 桃酸 的研究 。用 Ｐ Ｒ方法 扩增 （ 一 Ｃ 出 Ａ． ａ ｃｌ Ｊ ｆ ｅａｉ Ｚ ＵＴＢ ０腈 水 解 酶 基 因 ， 将 其 插 入 ｓ １ 并
到重视 。
到表 达 载 体 ｐ Ｔ ８ （ 中 ，Ｐ Ｇ 诱 导 后 ， 水 解 酶 Ｅ ２ ｂ ＋） Ｉ Ｔ 腈
在 大 肠 杆 菌 胞 内 进 行 了 活 性 表 达 ， 有 较 高 的 活 具
性 川。 ，
作者 在此 优化 了含 有 Ａ． ａ ｃｌｓ Ｊ ｆ ｅａｉ Ｚ ＵＴＢ Ｏ腈 水 Ｉ
Rhodococcussp_SHZ_1腈水合酶的高酶活发酵工艺_王超
Rhodococcus sp.SHZ 21腈水合酶的高酶活发酵工艺3王 超1,2,张根林1,2,李 春3,吴 丽1,21(石河子大学食品学院,新疆石河子,832003) 2(石河子大学绿色合成与转化实验室,新疆石河子,832003)3(北京理工大学生命科学与技术学院,北京,100081)摘 要 通过研究发酵过程中溶氧、生物量、腈水合酶活力以及残糖的变化规律和搅拌速度、通气量、接种量及诱导剂对产腈水合酶的影响,确立了5L 发酵罐中Rhodococcus sp.SHZ 21腈水合酶的高酶活发酵工艺参数。
结果表明,发酵过程中溶氧控制在30%以上有利于菌体快速生长和腈水合酶的合成。
在p H 712,温度30℃的发酵条件下,适宜的腈水合酶合成工艺条件为:接种量10%,通气量110vvm ,搅拌速度采用由初始的200r/min 调至500r/min 的变速调控方式,同时于48h 补加产酶诱导剂,发酵液腈水合酶的最高酶活力达到了9500U/mL ,是摇瓶培养时最高酶活力8208U/mL 的112倍,且比未进行工艺优化时最大产酶期缩短了20～24h ,其最佳产酶期为52～60h 。
关键词 腈水合酶,诱导剂,发酵,Rhodococcus sp 1SHZ 21第一作者:硕士研究生(李春教授为通讯作者)。
3国家自然科学基金资助项目(No.20466002),新世纪优秀人才支持计划(NCET -04-0989),新疆维吾尔自治区重点攻关项目(No.200332109)收稿日期:2006-10-30,改回日期:2007-01-22 腈水合酶((Nit rile Hydratase ,N Hase )是微生物在进行肟或脲代谢过程中产生的一种蛋白质,可以将腈类物质的腈基(-CN )催化水合为酰胺(-CON H 2)[1]。
利用这种酶催化丙烯腈(Acrylo nit rile ,AN )合成丙烯酰胺(Acrylamide ,AM )是一种安全、高效、节能的生产工艺。
腈水合酶催化反应条件的研究
腈水合酶催化反应条件的研究刘舒;沈旭丰;孙先锋【摘要】Taking the enzyme of free cell as the catalyst, the effects of dilution factor, concentration of acrylonitrile, temperature, pH value, concentration of cells and concentration of acrylmide on the activity of nitrile hydratase were studied. The result shows that the temperature, the concentration of acrylonitrile and the concentration of gcrylamide are the most important among these factors. The activity of nitrile hydratase is 4 901U/mL(broth) at the reaction temperature 28℃ t he concentration of acrylonitrile is 40g/L;the activity of nitrile hydratase in the solution of 40% acrylamide is just 40% of that in solution of 5% acrylamide. It is found that the activation energy of the nitrile hydratase is 40. 291kJ · mot1 through the research at the different reaction temperature.%以自由细胞的酶作为催化剂,研究了菌体稀释倍数、丙烯腈浓度、温度、pH值、菌悬液用量和丙烯酰胺浓度对腈水合酶活性的影响,结果表明,温度、丙烯腈浓度和丙烯酰胺浓度是影响酶活性的主要因素.反应温度在28℃时酶活性达到最大为4091U/mL菌液,丙烯腈浓度采用40g/L.当反应体系中丙烯酰胺浓度为40％时,其酶活只有丙烯酰胺浓度为5％时酶活的39.2％.对不同反应温度下酶活的研究,得出腈水合酶催化反应的活化能为40.291kJ · mol-1.【期刊名称】《纺织高校基础科学学报》【年(卷),期】2012(025)001【总页数】6页(P83-87,106)【关键词】丙烯酰胺;腈水合酶;丙烯腈;催化反应【作者】刘舒;沈旭丰;孙先锋【作者单位】西安工程大学环境与化学工程学院,陕西西安710048;西安工程大学环境与化学工程学院,陕西西安710048;西安工程大学环境与化学工程学院,陕西西安710048【正文语种】中文【中图分类】Q559在微生物转化生产丙烯酰胺的过程中，酶催化反应是关键环节，因此研究酶催化反应的条件成为必然．腈水合酶（Nitrile hydratase，EC4．2．1．84）是以硫原子和半胱氨酸－亚磺酸残基（Cysl12）为绝对中心的一类可催化腈水解的酶．随着科研人员对腈水合酶结构、催化机理、生物合成调节以及酶学性质的深入研究，腈水合酶已被成功应用于工业生产丙烯酰胺上．最早提出用微生物法生产酰胺的是法国研究者Galzy及其研究组，他们发现了一种能催化腈水解的微生物Brevbacteriu m R312，可催化合成丙烯酰胺（A M），但是酶活很低［1］．1982年，京都大学山田秀明研究组发现了Pseudomonas Chlor aphis B32，经过驯化其酶活达到1 260个单位［2］．1988年，山田秀明等发现了一种性能更好的腈水合酶产生菌Rhodococcus r hodococcus J1，其酶活达到了1 630个单位，一度成为日本酰胺生产的工程菌．高活力菌种的成功应用，使日本日东公司年产量从最初的0．4万t／a迅速提升至3万t／a［3］．采用酶生物催化剂代替化学催化剂已成为绿色化学发展的方向之一［4］．与化学法相比，微生物法制备丙烯酰胺具有反应在常温常压下进行、选择性高、活性高、能耗低、环境污染小、成本低、产物光学纯度高等优点［5］．目前，国内用生物法生产丙烯酰胺多采用海藻酸盐包埋法固定化细胞的工艺，而该工艺本身存在通透性差、固定化细胞强度小以及引入离子等问题，另外在固定化阶段会损失相当一部分酶活．正由于酶活的损失，一批固定化的细胞往往水合反应3批左右就需要更新［6］．利用自有细胞直接进行水合反应并实现连续化生产能较好地解决以上问题．本文对诺卡氏菌Nocar dia sp．ZT－2自由细胞的腈水合酶反应条件进行了研究，以期优化酶反应条件，提高酶活性．1 实验1．1 原料丙烯腈（上海三浦化工有限公司，分子量53．06，化学纯）、丙烯酰胺（北京化学试剂公司，分子量71．08，分析纯）．1．2 实验菌株诺卡氏菌Nocar dia sp．ZT－2（从咸阳第二印染厂污水处理厂的活性污泥中筛选，由西安工程大学生物工程实验室保藏并鉴定．）1．3 培养基1．3．1 斜面培养基（g／L）牛肉膏5，蛋白胨1，Na Cl 5，琼脂4，p H 7．2．1．3．2 发酵培养基（g／L）葡萄糖20，酵母膏5，尿素6，味精（谷氨酸钠）1，KH 2 PO4 0．5，K 2 HPO4 0．5，M gSO4·7 H 2 O 0．5，Co Cl2·6 H 2 O 0．08 mmol／L，吐温80 1，p H 7．2．1．4 自由细胞的培养方法将菌株从斜面接种于250 mL发酵摇瓶中，装液量为25 mL发酵培养基，在28℃下培养96h，摇床转速为180r／min．1．5 生物量的测定将发酵液稀释一定倍数后，在460n m波长下测量吸光度值．根据测定的菌体干重和吸光度标准曲线，一个OD值相当于每L发酵液有0．45g干菌重量．1．6 操作过程1．6．1 菌悬液的制备取一定量的发酵液，在6 500r／min条件下离心8 min，弃上层清液，用p H＝7．0的磷酸缓冲液洗涤菌体．在同样条件下重复离心分离和洗涤两次，制成与原发酵液菌体浓度相等的菌悬液，冰箱保存备用．1．6．2 催化水合反应取19 mL 50 mmo L p H为7的磷酸缓冲溶液和1 mL纯丙烯腈，放入250 mL具有磨口玻璃塞的三角瓶中，恒温至28℃．取一定量的菌悬液根据具体实验要求稀释适当数倍，取1 mL于三角瓶中，准确反应5 min，然后加入1 mL 4 mol／L的盐酸终止反应［7］．1．7 酶活测定方法除在丙烯酰胺浓度对产物影响中丙烯酰胺生成量用液相色谱测定外，其余丙烯酰胺生成量及所有酶活的测定采用KBr O3－KBr法．液相色谱操作条件如下：流动相为甲醇∶水＝15∶85，流速1 mL／min，温度25℃，检测波长205n m．产物计算方法为：采用外标法以峰面积为标准配置各种浓度梯度的丙烯酰胺标准样品，拟合出丙烯酰胺标准校正曲线．KBr O3－KBr 法测定丙烯酰胺生成量及酶活：丙烯酰胺的生成量（mg）＝0．5×71．0×C（V 0－V）×V 2／V 1，酶活＝C（V 0－V）×（1／2）×V 2／V 1×1 000／t．C为Na2 S2 O3 溶液的摩尔浓度，mol／L；V 0 为空白消耗Na2S2 O3溶液的体积，mL；V为滴定样品消耗Na2S2 O3溶液的体积，mL；1／2为反应所生成Br 2与Na2 S2 O3溶液的化学计量比；V 1为反应所取上清液的体积，mL；V 2为上清液总体积，mL；1 000为mmol转换成μmol；t为反应时间，min；0．5为生成丙烯酰胺的摩尔数；71．0为丙烯酰胺的分子量．2 结果与讨论表1 菌液稀释倍数与酶活稀释倍数4 8 12 16 20 30 40酶活／U·mL－1 2 853 2974 2 910 2 737 2 658 2 808 2 5302．1 稀释倍数对酶活的影响因为培养所获得的菌液酶活都比较高，而在后面的研究中，为了更好地反映各种因素对催化反应的影响，是不期望反应过快的，所以需要对菌液进行稀释．因此，分别将菌液稀释4，8，12，16，20，30，40倍，水合反应后分别测量此时的酶活，然后将测得的酶活乘以稀释倍数，换算得到原始的酶活．换算后结果如表1所示．以稀释16倍的酶活为1，求出不同稀释倍数下的相对酶活U，然后作图，结果如图1所示．从图1可以看到，菌液经稀释后，对折算的原始酶活，在稀释4～12倍之间，酶活相对偏高但在1．1以内；而在16～30倍之间折算的酶活相对偏差较小，误差保持在±10%以内．可以认为，在研究的范围内，稀释倍数对于酶活可以用折算的办法来补偿．2．2 丙烯腈浓度对酶活的影响在催化水合反应中，丙烯腈是一种底物，其浓度对酶活可产生两种影响．一方面，由于底物与中间络合物（ES）生成的三元复合物（SES）不可分解成产物，且具有生理毒性，浓度过高对菌体有害，会造成酶活的快速下降；另一方面，从反应动力学的角度来讲，底物浓度的提高又有利于提高反应速率［8－10］．恰是这两种影响正好相反，所以研究丙烯腈浓度对酶活的影响十分必要．在总体积为25 mL，反应温度为28℃，p H 为7．0情况下，分别考察丙烯腈浓度为10g／L，20g／L，30g／L，40g／L，50g／L，60g／L，80g／L，100g／L，120g／L，140g／L，160 g／L时对水合反应体系中反应速率的影响，结果如图2所示．图1 稀释倍数对酶活的影响图2 丙烯腈浓度对酶活的影响如图2所示，当丙烯腈浓度小于40g／L时，酶活随浓度的增加而快速上升；而在丙烯腈浓度40g／L至120g／L之间，随着浓度的增加，其酶活增加比较平缓，并且在丙烯腈浓度120g／L时，酶活达到最大，为4 125 U／mL，然后酶活随丙烯腈浓度的增加而缓慢降低．可以看出，在丙烯腈浓度大于60g／L以后，酶活还能随着浓度的增加而上升，但是上升幅度比较小，说明高浓度底物已开始对酶活产生抑制作用了．本实验中，丙烯腈浓度最大为160g／L，但此时还观察不到对酶活明显的抑制作用．这说明在本研究的范围内，菌株ZT－2所产的酶对底物的耐受性是比较强的．在后续的实验中，采用丙烯腈浓度为40g／L，虽然丙烯腈浓度在120g／L时所产酶活最高，但相比40g／L时的酶活仅提高了31%，而底物用量却是前者的3倍之多，也就是说丙烯腈转化率降低了．可见采用高的底物浓度并不是最佳选择．根据丙烯腈浓度与酶活的关系，可求得腈水合酶催化反应的米氏常数．求得的米氏常数K m＝14．048g／L，表示的是反应速率达到最大速率一半时的底物浓度．2．3 温度对酶活的影响由图3可见，从18℃到28℃之间，酶活随着反应温度的升高而加快，在28℃时达到最大，测定的酶活为4 091 U／mL菌液；而当反应温度大于30℃后，酶活下降非常快，到40℃时酶活只有28℃时的44．83%，不及其一半，表观酶活仅为1 834 U／mL菌液．分析其原因，可能是酶在高温下失活所造成的．由阿累尼乌斯公式可知，反应速率常数k的对数应该与1／T成正比，反应速率常数k与表观酶活r 成正比．因而，在低于301 K时，以ln（r／U·mol－1）对1／T 作图，可得到一条直线，如图4．直线拟合结果由此可以算出反应的活化能为E a＝40．291kJ·mol－1．2．4 p H对酶活的影响目前从文献报道来看，水合反应大都在中性环境下进行，在此环境下反应速率达到最大值，多数研究者得到的结果也多在7～7．5之间达到最大反应速率［13－14］．为此，本实验在总体积为25 mL，反应温度为28℃，丙烯腈浓度为40g／L的情况下考察了p H 为5，6，6．5，7．0，7．5，8．0，9．0时对酶活的影响情况．结果如图5所示．由图5可知，p H在低于6．5时，酶活随p H的升高而逐渐增大，而在6．5～7．0时，酶活快速上升；当体系p H超过7．5时酶活迅速下降，在7．0～7．5这个区间内酶活维持在较高水平，说明反应体系的p H处在中性范围有利于酶的高效表达，从而获得较高的酶活．因此在以后的研究中水合反应体系的p H为7．3．图3 温度对酶活的影响图4 温度与酶活的线性拟合注：粗线为拟合曲线，细线为数据点连线．2．5 菌悬液用量对反应速率酶活的影响酶作为生物催化剂，其催化反应的速度直接取决于酶浓度［15］．本实验考察在总体积为25 mL，反应温度为28℃，丙烯腈浓度为40g／L，p H为7．3的情况下菌体加入量对酶活影响．实验中发现当菌悬液加入量大于20 mL时，酶活开始下降，估计是受到底物限制的原因．所以只研究了菌悬液加入量为2 mL，5 mL，8 mL，11 mL，14 mL，17 mL，20 mL时对产酶的影响．图5 p H对腈水合酶活性的影响图6 菌悬液用量对反应速率的影响由图6可知，酶活随着菌悬液用量的增加而逐渐增大，在菌悬液加入量为20 mL 时，酶活达到了最高值．这符合酶促反应动力学的基本原理，也就是当底物过量时，酶活随着菌液量的增加而增大，当底物浓度限制时，酶活有最大值．当菌悬液加入量V cell大于20 mL时，酶活开始减少．当V cell＝20 mL时，其最大酶活达5 308 U／mL．以菌悬液V cell加入量对酶活作图，并进行拟合，得到直线方程通过拟合方程可以知道一定体积下菌体加入量的酶活，因而在实际生产中，在保证后期分离及生产成本的前提下，采用合理的菌悬液用量可以保持相对较高的酶活性．2．6 丙烯酰胺浓度对产物的影响产物丙烯酰胺（A M）是一种高毒性的物质，对细胞有较大的生理毒性，能够破坏酶的三维结构并在产物释放前与酶形成中间产物EP的复合物，从而使酶不能与底物接触，降低了酶与底物接触的机会，抑制了酶的活性，也就降低了整个反应的速率［16－17］．在不同丙烯酰胺浓度的水合反应体系中得到丙烯酰胺浓度结果如表2所示．表2 丙烯酰胺浓度对酶活的影响反应前A M浓度／*************反应后AM浓度／% 2．04 6．94 11．73 16．65 21．42 31．18 40．76由表2可知，丙烯酰胺作为反应的产物，其浓度的增加能够极大地抑制酶的活性．当其在体系中的浓度低于20%时，对酶活的影响并不是特别明显，若以添加丙烯酰胺为5%的体系作为标准，其相对酶活都在70%以上．而当其浓度大于30%时，酶活急剧下降，到浓度为40%时，相对酶活已不足40%，说明丙烯酰胺浓度的增加能够极大地抑制体系的酶活，降低反应速率．因此，在实际生产中，及时分离出反应体系中生成的丙烯酰胺是非常必需的，也是目前亟待解决的问题．3 结论底物和产物浓度、催化反应温度、反应p H、菌悬液加入量是影响丙烯腈水合酶活性的主要因素，其中反应温度、底物和产物浓度是影响酶活的关键性因素．对于温度的选择，需要从两个影响方面权衡优化得出，一是温度升高有利于获得较高酶活，二是较高的温度会使酶失活．对于底物浓度，也应从两方面加以考虑，一方面底物浓度的增加有利于反应速率的提高，另一方面底物浓度的增加会抑制酶活性．产物浓度在水合反应中应保持在较低浓度范围，其在体系中的浓度低于20%，相对酶活能保持在70%以上，但是当体系中丙烯酰胺浓度大于20%时，酶活下降非常迅速．本文所得到的对酶活影响的参数，对工业用微生物法生产丙烯酰胺的操作条件优化提供了依据．【相关文献】［1］ OHTSUKA Y，HASGA WA J，NAKATSUJI H et a1．Density functional st udy on geo metry and electronic str ucture of nitrile hydratase active site model［J］．J Inter Quan Chem，2002，90（3）：1 174－1 187．［2］刘金元，王慧琴，徐淑霞，等．腈水合酶研究进展［J］．安徽农学通报，2008，14（4）：111－113．［3］罗积杏，薛建萍，沈寅初．我国生物法生产丙烯酰胺的现状及其研发概况［J］．上海化工，2007，32（2）：17－21．［4］王浩．腈水合酶产生菌的分离筛选及其特性研究［J］．微生物学杂志，1996，16（4）：12－17．［5］胡常伟，李贤均．绿色化学原理和应用［M］．北京：中国石化出版社，2002：98－99．［6］陈跖，孙旭东，史悦，等．微生物法生产丙烯酰胺的研究（Ⅱ）［J］．生物工程学报，2002，18（2）：225－230．［7］邓林，刘延岭，王忠彦，等．产腈水合酶菌株的驯化选育及其产酶条件的优化［J］．食品与发酵工业，2005，31（1）：53－56．［8］ Y Reddy，S Kalju Kahn，ZHENG Y J，et al．Protein engineering of nitrile hydratase activity of papain：molecular dynamics study of a mutant and wild－type enzy me ［J］．Journal of the American Chemical Society，2002，124（44）：12 979－12 990．［9］ CHEN Zh，SUN X D，SHI Y，et al．Study on production of acrylamide by microbial method（11）－enzy me catalytic kinetics and de－active dynamics of nitrile hydratase ［J］．生物工程学院，2002，18（2）：225－230．［10］ ALIKIN V N，ALIAGA A，TERESA M，et al．Detoxification and recycling of wastes from biotechnological manufactuer of acrylamide［J］．Ekologiyai Pro myshlennost Rossii，2005，12：14－16．［11］ RUI A Pereira，GRAHA M Dan，RAINEY Fred A，et al．A 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腈水合酶产生菌Rhodococcuss p.HUST-1发酵条件的优化
关键 词 ： 腈水合酶； 发酵条件； 丙烯腈
中图分 类号 ：
文 献标 识码 ： Ａ
பைடு நூலகம்
腈水合酶可催化丙烯腈水合生成丙烯酰胺 ． ７ 年 ， １ ３ 法国研究者 Ｇ ｌ 及其研究组发现了一种能催化丙 ９ ａｙ ｚ 烯腈 水合 停 留在丙 烯酰胺 的微生 物 Ｂｅｂｃ ｒ ｍ Ｒ １￣ 从 而开 始 了微 生 物 法 生产 丙 烯 酰 胺 的研 究 ． ｒ ａｔ ｉ ３２ ｖ ｅｕ ， 由于
１３ 菌体浓度和腈水合酶活性的测定 ４０ ｉ测定菌液浊度 ， ． ６ ｎ Ｂ 根据 Ｏ ４和菌体干重标准曲线计算菌体浓度 ． Ｄ０ ６
酶 活采 用 国际单 位 ， 义 ２ 定 ８℃下 每分钟 生 成 １ｍｏ丙 烯酰 胺 为 １ 根据 Ｇ １０５３８ ， 溴化 法测定 ． ａｌ ｔ Ｕ． Ｂ ２０ ．—９用 比酶活定 义为 １ｍ 菌体 具有 的腈 水 合酶 活性 ． ｇ
攻关项 目（０ Ａ ４ Ｓ４）哈尔滨市青 年科学研究基金（０４ Ｆ Ｘ０ １￣新余高等专科学校重点校级课题 （Ｊ７９ 资助项 目． ２０ Ａ Ｃ￣ ９ ， ４ ） ２０Ａ Ｑ Ｊ ） ４ ｘ０３ ）
产腈水合酶菌株的驯化及其产酶条件优化研究
产腈水合酶菌株的驯化及其产酶条件优化研究邱峰;李志东;李娜;张洪林;王战勇;邱江【期刊名称】《矿冶》【年(卷),期】2006(15)3【摘要】以Nocardia sp LNSY06为出发菌株,通过逐渐增加培养基中丙烯腈的浓度重复继代培养,得到1株酶活为62.5U/mg的腈水合酶高活力菌株,酶活比出发菌株提高了15倍.研究结果表明:驯化的最优条件为:葡萄糖为20g/L,诱导剂脲为0.06g/L,Co2+为0.3g/L,丙烯酰胺为10%,反应pH为7,温度为28℃,底物丙烯腈体积分数＜4%,产物丙烯酰胺的质量分数＜20%.【总页数】5页(P52-55,37)【作者】邱峰;李志东;李娜;张洪林;王战勇;邱江【作者单位】辽宁石油化工大学环境工程系,辽宁,抚顺,113001;辽宁石油化工大学环境工程系,辽宁,抚顺,113001;辽宁石油化工大学环境工程系,辽宁,抚顺,113001;辽宁石油化工大学环境工程系,辽宁,抚顺,113001;辽宁石油化工大学环境工程系,辽宁,抚顺,113001;抚顺石油三厂,辽宁,抚顺,113001【正文语种】中文【中图分类】TQ920.1【相关文献】1.产腈水合酶菌株的驯化选育及其产酶条件的优化 [J], 邓林;刘延岭;王忠彦;胡承;孙勇;段洪武2.腈水合酶生产菌株产酶条件的优化 [J], 庄贤军;马骏;吴丛伟3.产几丁质酶菌株 S68-CM5产酶条件优化研究 [J], 胡基华;曹旭;孟力强;陈静宇;姜威;刘宇帅;张淑梅;李晶4.产几丁质酶菌株SWCH-6的选、鉴定及其产酶条件的优化研究 [J], 王海东;陈飚;伦镜盛;王成;胡忠5.一株产腈水合酶菌株酶活高效表达条件的研究 [J], 李志东;李娜;张洪林;王战勇;邱峰因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
产腈水合酶菌株的驯化及其产酶条件优化研究
ｃ ｎ ｉｉ ｓｏ ｈ ｅ ｔｅ ｔａ ｔ ｎ ｒ ｔ ｒ ｓｆ ｌ ｗｓ ｌ ｃ ｓ ０ ／ ｕ ｅ ０ ｇ Ｌ， ｃ ｙ ｏ ＜ ４ ， ｃ ｙ ａ ｄ ｏ ｄ ｔ ｎ ｆｔ ｅ ｂ ｓ ｘ ｒ ｃｉ ａ ｉ ａ ｅａ ｏｌ ｏ ｏ ｏ ｏ ：ｇ ｕ ｏ ｅ２ ｇ Ｌ， ｒ ａ０． ６ ／ ａ ｒ ｌ ｎ ％ ａ ｒ ｌ ｍｉ ｅ＜ ２ ％ ， ｏ ０ ３ ／ ｐ ７ｇ Ｌ， Ｈ ０ ａ ｄ ｔ ｍｐ ｒ ｔ ｒ ８
产腈水合 酶菌株 的驯化及其 产酶条 件优化研究
邱 峰 李 志 东 ， ， 李 娜 张 洪林 王 战 勇 ， ， ， 邱 江
（ ． 宁石 油化 工大 学环境 工程 系 ， 宁抚 顺 １ ３ ０ ； ． 顺石 油三厂 ， 宁抚 顺 １３ ０ ） １辽 辽 １０ １２ 抚 辽 １ ０ １
Ｆ ｓｕ １ ０ １ Ｌ ａ ｎｎ Ｃ ｉａ； ． ｕｈ ｎＯｉ Ｐ ａ ｔ ． ， ｕｈ ｎ １ ３ ０ ， ｉｏ ｉｇ， ｈｎ ） ｕｈ ｎ １３ ０ ， ｉｏ ｉｇ， ｈｎ ２ Ｆ ｓ ｕ ｌ ｌｎ Ｎｏ ３ Ｆ ｓ ｕ １ ０ １ Ｌ ａ ｎｎ Ｃ ｉａ
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Alcaligenes sp.腈水解酶组成型毕赤酵母表达条件的优化
Alcaligenes sp.腈水解酶组成型毕赤酵母表达条件的优化张新红;朱富成;常飞;徐涛【期刊名称】《新余学院学报》【年(卷),期】2022(27)6【摘要】以实验室前期构建的组成型胞外表达Alcaligenes sp.腈水解酶重组菌株Pichia pastoris X33/pGAPza-rDNA-NIT为研究对象,对该菌株的发酵培养基进行筛选,以最适发酵培养基为基础,通过对发酵培养基组分和表达条件进行优化,提高腈水解酶的表达量并检测其催化性能。
结果表明,甘油培养基d效果最佳,腈水解酶体积酶活可达1.03 U/L,OD600为18.36。
经发酵表达条件优化后,在蛋白胨25 g/L、酵母粉10 g/L、甘油20 g/L、MgSO41 g/L、磷酸盐20 mmol/L、培养基初始pH 8.0、装液量20%、诱导温度26℃、发酵时间72 h条件下,腈水解酶体积酶活达1.75 U/L,OD600为45.7,分别是优化前的1.7倍和2.5倍。
在此基础上,利用腈水解酶进行扁桃腈催化形成R-扁桃酸的进程研究,反应2h产率可达95.1%,e.e.值达100%,此结果可为工业化应用提供参考,可为腈水解酶的研究进一步奠定基础。
【总页数】7页(P24-30)【作者】张新红;朱富成;常飞;徐涛【作者单位】合肥学院生物食品与环境学院;皖西学院生物与制药工程学院【正文语种】中文【中图分类】Q814.9;Q815;Q819【相关文献】1.来源于Thermomyces sp.的植酸酶基因在毕赤酵母中的组成型表达2.鸡α－干扰素在毕赤酵母中的表达及其表达条件优化3.优化合成有机磷水解酶opd p基因r在毕赤酵母中的表达4.透明颤菌血红蛋白基因vgb和腈水解酶基因bxn在毕赤酵母中的表达研究5.响应面法优化CALA在毕赤酵母中的组成型表达因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
腈水解酶重组菌发酵产酶条件的优化及应用
初始发酵培养基：蛋白 胨 １０ｇ·Ｌ－１，酵 母 浸 出 汁 ５ｇ·Ｌ－１，ＮａＣｌ １０ｇ·Ｌ－１，ｐＨ 值７．５，１２１ ℃ 灭 菌 ２０ ｍｉｎ。 １．３ 方 法
初始培养方法：从 甘 油 管 或 斜 面 挑 取 重 组 工 程 菌 至装 液 量 为 ５０ ｍＬ （２５０ ｍＬ 三 角 瓶 ）的 种 子 培 养 基 中，３７ ℃培养１２ｈ后，取１ｍＬ 种子液于装液量为１００ ｍＬ（５００ ｍＬ 三 角 瓶）的 发 酵 培 养 基 中，３７ ℃ 培 养 ４ｈ 后加诱导剂乳糖 ２．０ｇ·Ｌ－１，转 入 ２８ ℃ 诱 导 培 养 １６ ｈ后离心收集菌体。
高速 离 心 机，美 国 Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ；ＦＡ２００４ 型 电 子 分 析 天 平 ，上 海 精 密 仪 器 仪 表 有 限 公 司 ；ＳＰＤ－２０Ａ
基 金 项 目 ：国 家 ８６３ 计 划 资 助 项 目 （２００９ＡＡ０２Ｚ２０３） 收 稿 日 期 ：２０１１－１２－２２ 作者简介：吴乔（１９８６－），男，湖南岳阳人，硕士研究生，研究方 向：生 物 催 化 与 转 化；通 讯 作 者：郑 裕 国，教 授，博 士 生 导 师，Ｅ－ｍａｉｌ：
玉 米 浆 粉 浓 度 对 菌 株 生 长 和 产 酶 的 影 响 见 图 １。
图 １ 玉 米 浆 粉 浓 度 对 菌 株 生 长 和 产 酶 的 影 响 Ｆｉｇ．１ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｃｏｒｎ ｐａｓｔｅ ｐｏｗｄｅｒ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
ｏｎ ｓｔｒａｉｎ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｅｎｚｙｍｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
对 映 体 过 量 值 （ｅ．ｅ．值 ）来 评 价 。
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酶活 ( U) 33. 7 688. 3 26. 4 35. 7 35. 0
菌干重 ( g/ L) 6. 88 7. 2 6. 75 6. 89 6. 85
金属 离子 Fe3+ Cu
2+
酶活 ( U) 35. 4 8. 0 19. 2 22. 1 15. 2
菌干重 ( g / L) 7. 15 6. 97 6. 88 6. 88 3. 03
表 2 常见氨基酸对产酶的诱导 氨基酸 空白 Ala Arg Asn Asp Cys Gln 菌 干重 ( g/ L) 8. 06 8. 17 8. 23 7. 43 8. 12 7. 95 8. 02 比酶活 ( U/ mg) 104. 5 102. 5 103. 4 110. 6 103. 9 103. 8 104. 2 酶活 ( U) 842. 5 837. 5 851. 2 821. 4 843. 5 825. 4 835. 5 氨基酸 Leu Lys M et Phe Pro Ser Thr 菌干重 ( g/ L) 7. 55 8. 24 8. 12 7. 82 8. 12 8. 25 8. 27 比酶活 ( U/ mg) 102. 1 99. 2 104. 7 109. 0 103. 1 91. 9 102. 4 酶活 (U ) 770. 9 817. 5 850. 2 852. 6 837. 0 757. 9 846. 5
第 6期
朱婷婷 , 等 : 腈水合酶产生菌 Rhodococcus sp. HUST 1 发酵条件的优化
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培养基中分别加入 0. 12 mmol/ L 的 Co 2+ 、 Ni2+ 、 Ba2+ 等金属离子, 研究其对酶活的影响 , 结果如表 1 所示 .
表 1 金属离子对 腈水合酶的诱导作用 金属离子 空白 Co
合酶酶活的影响 , 结果见图 1~ 图 4.
图1
碳源浓度对酶活的影响
图 2 氮源浓度对酶 活的影响
图 3 培养温度对酶活 的影响
图 4 pH 对酶活的影响
图 1 表明 , 葡萄糖浓度低于 20 g/ L, 随着其浓度的增大, 可利用碳源增加, 菌体生长加快, 且有利于腈水 合酶的表达, 菌浓、 比酶活、 总酶活均表现为增长趋势. 葡萄糖浓度高于 20 g/ L, 三者迅速下降, 可能由于葡萄 糖浓度过高, 菌体细胞对糖的代谢导致产酸过多 , 使菌体所处环境 pH 值过低, 不适合菌体生长及腈水合酶 的表达, 因此最适葡萄糖浓度为 20 g/ L. 由图 2 中变化趋势可知 , 10 g/ L 酵母粉为最适氮源浓度, 大部分腈水 合酶产生菌易于在常温生长. 图 3 表明 , 该菌株在不同温度梯度下培养 , 28 时酶活最高 . 每种微生物都有 最适生长代谢的 pH 值 , 超过 这个范围 , 微生物 的生长 代谢就会 受到影响 , 甚至 停止. 图 4 表明 , pH 值对 HUST 1 生长代谢影响较明显, pH 小于 5. 0 该菌基本不生长, pH 7. 0 生长良好且酶活达到最大值 , 因此其最 适生长及产酶 pH 为 7. 0. 正交实验表明培养条件中的各因子均为独立因子, 在此不再详述. 2. 2 腈水合酶的诱导 ( 1) 金属离子对产酶的诱导与表达 腈水合酶是一种金属酶, 金属离子在其催化活 性中心起重要作用, 因此 , 在腈水合酶产生菌的培养基中加入一定的金属离子会诱导腈水合酶的形成 [ 8] . 在
2+ 2+
脲是诱导腈水合酶产生的一种诱导物 , 参与细胞的生长代 谢并诱导腈水合酶合成[ 9] . HUST 1 在含 0. 08 mmol/ L Co2+ 的发酵培养基中加入 0. 7% 的脲 , 发酵结束时酶活为 255. 2 U, 比酶活为 104. 2 U/ mg, 菌干重 2. 45 g/ L . 腈水合酶分为高相对分子质量和低相对分子量两类 ,
1. 3 菌体浓度和腈水合酶活性的测定 460 nm 测定菌液浊度, 根据 OD460和菌体干重标准曲线计算菌体浓度. 酶活采用国际单位, 定义 28 下每分钟生成 1 mol 丙烯酰胺为 1 U. 根据 GB12005. 3 89, 用溴化法测定. 比酶活定义为 1 mg 菌体具有的腈水合酶活性 . 1. 4 发酵条件的优化
收稿日期 : 2008 09 19 基金项目 : 黑龙江省自然科学基金 ( E2004 08) , 黑龙江 省普通高等学 校青年学 术骨干支 持计划 ( 1153G008) , 哈尔滨市科技 攻关项目 ( 2004AA4CS049) , 哈尔滨市青年科学研究基金 ( 2004AFQXJ041) 和新余高等专科学校重点校级课题( XJ0739) 资助项目. 作者简介 : 朱婷婷 ( 1982 ) , 女 , 江西 吉安人 , 助教 , 硕士 , 主要从事生物化工方面的研究 .
2008 年
3
结论
( 1) 诱导实验研究表明 Co 、 酪氨酸是腈水合酶产生菌 Rhodococcus sp. HUST 1 的有效诱导剂. ( 2) 菌体的发酵条件优化为 : 葡萄糖 20 g/ L , 酵母粉 10 g/ L , Co 2+ 0. 08 mmol/ L , 酪氨酸为 0. 2 g/ L, 培养温
图 5 钴离子浓度对酶活的影响 简记 H NHase 和 L NHase, 脲能诱导产 H NHase . 结果 表 明, HUST 1 所产腈水合酶为 L NHase, 因而脲对腈水合酶的表达无诱导作用 . 且脲抑制菌体生长 , 从而导致总
[ 9]
酶活下降 . ( 3) 氨基酸以及维生素对产酶的诱导与表达 在 0. 08 mmol/ L Co 2+ 的发酵培养基中分别加入 0. 2 g/ L 各 种常见氨基酸和复合维生素, 研究其对酶活的影响, 结果如表 2 所示 . 由表 2 可知, 维生素对腈水合酶的形 成无影响. 氨基酸中酪氨酸能够一定程度地促进菌体的生长, 并同时诱导菌体产酶 . 其他氨基酸对酶活影响 均较小, 可能由于酪氨酸特殊的分子结构能与酶的活性中心耦合 , 有利于腈水合酶的高效表达 .
Ni2+ Ba Fe
2+
Al 3+ Ca Zn
2+ 2+
2+
表 1 表明, Co2+ 对腈水合酶的表达有诱导激活作用 , Ni2+ 、 Ba 2+ 、 Mn2+ 、 Fe2+ 、 Fe3+ 、 Cu2+ 、 Al3+ 、 Ca2+ 对菌 体生长影响不大 , 且对腈水合酶的表达无诱导作用 . Zn 会抑制菌体生长 , 生长过程中菌体成絮状且浓度较 低. 结果说明 Rhodococcus sp. HUST 1 所产酶为钴型酶, 加入一定量钴离子可诱导出高活力的腈水合酶. 在此基础上研究 Co 2+ 浓度对腈水合酶的诱导作用, 结 果如图 5 所示. 由图 5 可知 , Co 浓度小于 0. 08 mmol/ L, 酶 活随 Co2+ 浓度的增加而增长 ; 浓度为 0. 08 mmol/ L 时 , 酶活 达到最大值 842. 5 U; 继续增大其浓度, 酶活下降, 说明过高 浓度的 Co 2+ 对菌体产酶有抑制作用. 确定 Co 2+ 最适浓度为 0. 08 mmol/ L. ( 2) 脲对产酶的诱导与表达 对大多腈水合酶产生菌 ,
培养条件实验 : 对培养基中碳氮源浓度、 培养温度、 pH 值等条件进行优化 .
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江西师范大学学报 ( 自然科学版 )
2008 年
腈水合酶诱导实验: 研究各种金属离子、 脲、 维生素及常见氨基酸对腈水合酶的诱导作用 .
2
2. 1
结果与讨论
培养条件对腈水合酶活性的影响 研究培养基中碳氮源浓度、 培养温度和 pH 值对 HUST 1 所产腈水
HUST 1 的产酶条件进行优化 . 研究 表明 , 发酵 过程中 培养基 中的碳氮 源、 诱导剂 浓度以 及培养 条件影响 腈水合酶的高 效表达 . 在葡萄糖 20 g/ L 、 酵母粉 10 g/ L、 Co2+ 0. 08 mmol/ L、 酪氨酸 0. 2 g/ L、 pH 7. 0 、 培养温 度 28 时 , HUST 1 所产腈水合酶总酶活达 1 012. 7 U , 比优化前提高了 47. 1% .
第 32 卷第 6 期 2008 年 12 月
江西师范大学学报 ( 自然科学版 ) JOURNAL OF JIANGXI NORMAL UNIVERSITY( NATURAL SCIENCE)
Vol. 32 No. 6 Dec. 2008
文章编号 : 1000 5862( 2008) 06 0667 04
关键词 : 腈水合酶; 发酵条件; 丙烯腈 中图分类号 : 文献标识码 : A 腈水合酶可催化丙烯腈水合生成丙烯酰胺. 1973 年 , 法国研究者 Galzy 及其研究组发现了一种能催化丙 烯腈水合停留在丙烯酰胺的微生物 Brevbacterium R312 , 从而开始了微生物法生产丙烯酰胺的研究. 由于 微生物法生产丙烯酰胺与化学法相比具有高效性、 高选择性、 反应条件温和、 成本低和环境污染小等优点, 多年来一直是研究的热点之一 . 我国上海生物化学工程研究中心筛选到了一株产丙烯腈水合酶的高效菌株 Nocardia sp. 86 163 , 李文忠等筛选到了一株高腈水合酶活力的棒状杆菌 ZBB 21 , 王浩等筛选到了一株 微球菌 Micrococcus sp. SD 16[ 4] , 而邓林等筛选到了一株腈水合酶高效菌 Rhodoccocus YL 1[ 5] . 作者从活性污 泥中筛选到一株腈水合酶产生菌 Rhodococcus sp. HUST 1[ 6] , 此菌株发酵后呈良好的絮凝状态 , 有利于实现水 合丙烯腈的工业化生产. 目前所报道的腈水合酶产生菌所产酶均为胞内酶, 因而发酵培养基中的碳氮源、 诱导剂以及培养条件 [ 7] 是影响腈水合酶高效表达的重要因素 . 本文研究了菌株 HUST 1 发酵条件的优化过程.