孕酮对蜕膜基质细胞体外增殖、凋亡影响-李亚迪

36第18卷 第9期 2016 年 9 月辽宁中医药大学学报JOURNAL OF LIAONING UNIVERSITY OF TCMVol. 18 No. 9 Sep .，2016孕酮是哺乳动物排卵后由卵巢黄体分泌的一种类固醇激素，在妊娠期间主要来自胎盘组织，是孕激素的主要活性成分。

本研究采用多种检测方法，观察不同浓度的孕酮对人早孕蜕膜基质细胞（DSCs）增殖活力及总凋亡率的影响，为研究孕酮在妊娠中的重要作用提供了新的研究思路。

1材料和方法1.1 材料孕酮和四甲基偶氮咗蓝（MTT）、二甲亚砜（DMSO）为sigma 公司产品，泌乳素（Prolactin PRL）一抗及免疫荧光试剂购自abcam 公司，DMEM/F12培养基、PBS 缓冲液、胰酶、胎牛血清（FBS）、青霉素、链霉素、D-Hank's 溶液为gibco 公司产品，Annexin V-FITC 细胞凋亡检测试剂盒购自BestBio 公司。

1.2 方法将FBS 加入DMEM/F12培养基中制成含10%FBS 的完全培养基。

1.2.1 细胞培养及纯度鉴定（1）获得广州中医药大学第一附属医院伦理委员会批准及患者知情同意后收集门诊孕6~9周人流患者蜕膜组织；将人流术中取得的人早孕蜕膜组织用灭菌生理盐水清洗后置于D-Hank's 液中快速运回实验室行原代培养。

（2）将蜕膜组织用PBS 快速、充分洗涤去除血污，用眼科剪将蜕膜组织剪碎至1 mm 2大小。

（3）0.25%胰酶消化组织5~10 min 后加入全培终止消化。

（4）200目筛网过滤并收集滤液，2000 r/min 离心5 min 后弃上清。

（5）完全培养基重悬沉淀，调节细胞浓度为1×105/mL 的浓度后接种于培养瓶中，于37 ℃、5%二氧化碳的饱和湿度培养箱内培养30 min。

（6）30 min 后弃去上清，更换培养基，继续放入培养箱中培养，48 h 换液。

（7）细胞传代至第3代时行细胞爬片，免疫荧光孕酮对蜕膜基质细胞体外增殖、凋亡影响李亚迪，郜洁，郝晓丽，罗颂平（广州中医药大学，广东 广州 510006）摘 要：目的：探究孕激素对人蜕膜基质细胞体外增殖、凋亡的影响。

方法：原代培养蜕膜细胞，采用四甲基偶氮咗蓝（MTT）比色法及流式细胞仪检测孕酮对细胞增殖、凋亡的影响。

结果：20~80 μmol/L 孕酮可抑制蜕膜细胞的增殖活力（P <0.05），可引起蜕膜细胞形态变化。

10~80 μmol/L 孕酮可提高蜕膜细胞总凋亡率（P <0.05），但其总凋亡率仍低于6%。

结论：孕酮可以抑制人早孕子宫蜕膜细胞的增殖，作用48 h 时抑制率与孕酮浓度正相关；孕酮可诱导蜕膜细胞凋亡。

关键词：孕酮；蜕膜基质细胞；细胞增殖；凋亡中图分类号：R711 文献标志码：A 文章编号：1673-842X (2016) 09- 0036- 04收稿日期：2015-12-07基金项目：广州市科信局广州市临床医学研究与转化中心试点建设项目（155700014）；广东省科技厅重大科技专项项目 （2012A080202019）；中国博士后科学基金资助项目（20110490557）作者简介：李亚迪（1990-），女，河南南阳人，博士研究生，研究方向：生殖健康与生殖障碍的中医药研究。

通讯作者：罗颂平（1957-），女，广东广州人，教授，博士研究生导师，研究方向：生殖健康与生殖障碍的中医药研究。

E-mail：songpingluo@。

Impact of Progesterone on Proliferation and Apoptosis ofDecidual Stell Cells（DSCs）in Vitro LI Yadi，GAO Jie，HAO Xiaoli，LUO Songping（Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine，Guangzhou 510006，Guangdong，China）Abstract：Objective ：Study of the impact of progesterone and apoptosis of DSCs in vitro. Methods ：Using colorimetric method of MTT and flow cytometry to detect the impact of progesterone on proliferation and apoptosis of DSCs in vitro. Results ：20~80 μmol/L progesterone inhibited the proliferation of DSCs （P <0.05）with morphological changes of DSCs. 10~80 μmol/L progesterone enhanced the total rate of apoptosis of DSCs（P <0.05），but <6%. Conclusion ：Progesterone can inhibit the proliferation of DSCs. The rate of inhibition of 48 h and the concentration is positively correlated. Progesterone can enhace the apoptosis of DSCs .Keywords：progesterone；DSCs；proliferation；apoptosisDOI：10.13194/j.issn.1673-842x.2016.09.0103718卷 辽宁中医药大学学报鉴定PRL 表达阳性率。

1.2.2 DSCs 增殖实验（1）将细胞经胰酶消化后传至盖好盖玻片的细胞计数板计数，根据计数结果将蜕膜细胞的浓度分别调整为3×104个/mL 制成细胞悬液，分别接种于96孔板培养板，每孔200 μL。

37 ℃、5%二氧化碳的饱和湿度培养箱过夜贴壁。

（2）取出培养板后用移液器枪吸出孔内培养液，实验组分别加入含孕酮1、10、20、30、40、50、60、70、80 μmol/L 的DMEM/F12，空白对照组加入含1‰DMSO 的DMEM/F12。

每组设6个复孔，培养箱内干预培养24 h 及48 h。

（3）每孔加入20 μL 浓度为5 mg/mL 的MTT 溶液，继续孵育2~4 h 后吸去上清液，每孔加入二甲亚砜溶液150 μL，振荡10 min，酶标仪在波长为490 nm 处测定每孔的吸光度（A）值，计算不同浓度的孕酮对细胞生长的抑制率[抑制率=（空白对照组A 均值-实验组A 均值）/空白对照组A 均值]。

本实验重复3次。

1.2.3 DSCs 凋亡检测将细胞制成1.5×105/mL的细胞悬液，接种于六孔板，每孔1.5 mL，放入培养箱过夜。

吸出培养基加入含孕酮1、10、20、30、40、50、60、70、80 μmol/L的完全培养基（含10%FBS、100 IU/mL 青霉素及100 μL/mL 链霉素），空白对照组加入含1‰DMSO 的完全培养基。

培养箱培养24 h 及48 h 后，收集上清，以0.25%胰酶消化并终止，收集细胞悬液于流式管并离心，以PBS 清洗细胞两次，按照试剂盒说明书操作，按要求加入Annexin V 结合液、Annexin V-FITC 染色液及PI 染色液，流式细胞仪进行检测。

实验重复3次。

1.2.4 细胞形态学观察显微镜下观察不同浓度孕酮处理后细胞形态特征。

1.3 统计学方法所有数据皆用x —±s 分析，采用SPSS 13.0统计软件，对计量资料多组间比较进行方差分析。

2结果2.1 DSCs 分离培养本研究中采用全组分蜕膜细胞分离培养，30 min 差时贴壁法与自然传代纯化法相结合的分离培养方式。

DSCs 为妊娠期蜕膜组织主要功能细胞，可分泌PRL，本研究中将PRL 表达阳性作为DSCs 的主要鉴定标准。

蜕膜细胞传代至第3代时免疫荧光鉴定显示PRL 表达阳性率达99%以上，说明本研究中DSCs 分离培养成功，纯度99%以上，见图1。

图1 PRL 鉴定阳性2.2 孕酮对DSCs 增殖活力的影响MTT 结果显示，孕酮处理24 h 及48 h 时，当孕酮浓度在20 μmol/L 以上，实验组吸光度与空白组比较，P <0.05，差异有统计学意义，提示20~80 μmol/L 孕酮处理24 h 及48 h 后可显著抑制DSCs 的增殖活力；组内两两比较，P <0.05，差异有统计学意义，提示吸光度与孕酮浓度负相关；孕酮作用48 h 时，抑制率与孕酮浓度显著正相关；见表1~表2。

表1 24 h 及48 h 蜕膜细胞增殖活力实验各组吸光度组别吸光度/OD（24 h）吸光度/OD（48 h）空白组0.299±0.0120.220±0.0321 μM 孕酮组0.305±0.039$$$0.207±0.051$$$10 μM 孕酮组0.288±0.015*$$$0.195±0.023*$$$20 μM 孕酮组0.271±0.020*$$$0.181±0.012*$$$30 μM 孕酮组0.279±0.012*$$$0.177±0.014*$$$40 μM 孕酮组0.273±0.016*$$$0.177±0.011**$$$50 μM 孕酮组0.269±0.017**$$$0.170±0.015**$$$60 μM 孕酮组0.264±0.033*$0.147±0.010***$70 μM 孕酮组0.220±0.013***$$$0.140±0.010***$$$80 μM 孕酮组0.231±0.011***$$$0.131±0.007***$$$注：与空白组相比，*P <0.05，**P <0.01，***P <0.001；孕酮组组内两两相比，$P <0.05，$$$P <0.001。

表2 24 h 及48 h DSCs 增殖活力各组抑制率组别24 h 抑制率（%）48 h 抑制率（%）空白组001 μM 孕酮组-2.00 5.9110 μM 孕酮组 3.3811.3620 μM 孕酮组 9.3617.7330 μM 孕酮组 6.6919.5440 μM 孕酮组 8.7019.5450 μM 孕酮组10.0322.7360 μM 孕酮组11.7133.1870 μM 孕酮组26.4236.3680 μM 孕酮组22.7440.452.3 孕酮对人早孕蜕膜细胞总凋亡率的影响流式细胞仪凋亡检测结果显示10~80 μmol/L 孕酮作用24 h 及48 h 可提高DSCs 总凋亡率，P <0.05，差异有统计学意义；相邻组组内相比，P <0.05，差异有统计学意义，提示凋亡率与孕酮浓度存在显著正相关，见表3，图2~图3。