成骨细胞培养
成骨细胞名词解释组织学
成骨细胞名词解释一、定义和性质成骨细胞，也称为骨细胞，是骨骼组织中的主要细胞类型之一。
它们是成熟的、功能活跃的骨形成细胞，负责骨组织的形成和重建。
成骨细胞位于骨质表面、骨膜内面及骨髓腔中，通常与基质结合形成骨组织。
在组织学上，成骨细胞具有特定的形态和结构特征，表现为长柱状或不规则形状，核大而深染，核仁明显，胞质丰富。
二、功能与特点1.骨形成：成骨细胞的主要功能是合成和分泌骨基质，包括胶原蛋白和骨钙蛋白等，这些成分是构成骨质的主要成分。
通过合成这些基质，成骨细胞有助于骨质的形成和增加。
2.骨重建：成骨细胞也参与了骨组织的重建过程。
在破骨细胞对旧骨质进行吸收后，成骨细胞会在吸收部位形成新的骨质，实现骨组织的更新和修复。
3.调节血钙平衡：成骨细胞还能调节血液中的钙浓度，通过调节骨质矿化和吸收，以维持机体血钙平衡。
4.黏附于骨表面：成骨细胞具有黏附于骨表面的能力，通过特定的受体与骨基质结合，维持骨组织的结构和完整性。
5.表达多种生长因子：成骨细胞能表达多种生长因子，如胰岛素样生长因子、转化生长因子等，这些因子能刺激成骨细胞的增殖和分化，对骨组织的形成和发育具有重要影响。
三、成骨细胞与骨组织的形成在胚胎发育过程中，间充质干细胞在一定的诱导条件下会分化为成骨细胞。
这些成骨细胞会合成和分泌骨质基质，形成原始的骨质。
随着胎儿的生长和发育，成骨细胞会不断合成新的骨质，使骨骼逐渐生长和发育成熟。
在成年后，成骨细胞仍保持着合成骨质的功能，同时参与破骨细胞的诱导和骨组织的重建过程。
四、成骨细胞的分化与调控1.信号转导途径：多种信号转导途径参与了成骨细胞的分化和调控。
例如，BMPs、TGF-βs等生长因子可通过相应的受体激活Smad或多条MAPK信号转导途径，调节成骨细胞的基因表达和功能活动。
2.转录因子：Runx2、Osterix等转录因子在成骨细胞的分化过程中发挥关键作用。
这些转录因子能调控成骨细胞的特异性基因表达，促进其向成熟成骨细胞分化。
人成骨细胞原代培养
人成骨细胞原代培养1.人成骨细胞的分离和培养：在无菌条件下取自体骨移植患者少量的松质骨，装入无菌HANK’S液中，迅速运送至实验室，充分剥离骨膜及软组织，把将骨块置于盛有DMEM培养液的培养皿中修整为1mm×1mm×1mm大小的碎块，将松质骨块置入含有2∼3mlPBS的EP管中，用力摇动数次，然后静止30秒，令骨块沉下，小心倒掉含有造血组织和细胞的上清液，无菌PBS冲洗3次。
在松质骨块粒内加入红细胞裂解液(碳酸氢钠840mg、乙二胺四乙酸37.2mg、氯化铵8.023g、双蒸水1000mL，pH为7.2)，体积比为1∶2，裂解8min，离心去上液，至骨片发白放入离心管内。
2.酶消化法：加入10倍的2.5g/L胰蛋白酶，在37℃恒温箱振荡预消化20min，胎牛血清终止消化，弃去消化液，PBS清洗两遍。
再加入体积比为1∶8的0.1%的Ⅰ型胶原酶密封置于37℃水浴箱内振荡消化1h，1000r/min离心5min，弃上清，沉淀用PBS洗涤后再1000r/min离心5min，沉淀用DMEM-F12完全培养液重新悬浮反复吹打均匀，将细胞悬液通过200目不锈钢筛网，去除可能存在的非成骨细胞和杂质成分，保留骨粒。
剩余骨粒重复Ⅰ型胶原酶消化，共3次。
然后将3次消化所得的细胞悬液用血球计数板计数，制成5×107L-1的细胞浓度(台盘蓝染色显示存活的细胞不少于95%)，接种于无菌培养皿中，在体积分数5%CO2、95%湿度培养箱中37℃条件下培养。
48h后换液，弃去悬浮细胞，每隔2d换液1次，细胞接近融合时传代。
3.组织块法：将消化过的骨块，先用血清润湿，然后用吸管均匀接种至25 cm2的培养瓶中，翻转培养瓶，小心加入5 mL DMEM-F12完全培养液后，放入体积分数5%CO2、95%湿度培养箱中37 ℃条件下培养4 h后小心翻瓶。
每周换液1次，第3周起每周换液2次，细胞接近融合时按1∶ 2传代。
成骨细胞-血管内皮细胞共培养体系的研究进展
２ ． １ Ｏ Ｂ ｓ — Ｖ Ｅ Ｃ ｓ 细胞间的直 接作 用
共培养体 系中 ， Ｏ Ｂ ｓ与
Ｖ Ｅ Ｃ ｓ 通过 间隙连接发挥细胞 间直接作 用 ， 间隙连接 的实质
为： 两种细胞 内的各 自的水性通道组 成特殊 的膜区域 ， 通过 这种特殊的膜区域实现两相 邻细胞间胞质连接 。因此 ， 特殊生物结构决定了该 连接仅允许 Ｃ ａ ， ｃ Ａ ＭＰ ， ｃ Ｇ ＭＰ ， 肌糖 ｉ ｎ ｏ ｓ ｉ ｔ ｏ ｌ （ １ ， ４ ， ５ ） － 磷 酸 三酯 ｔ ｒ ｉ ｓ ｐ ｈ ｏ ｓ ｐ ｈ ａ ｔ ｅ （ Ｉ Ｐ ３ ） 等 离子及 小 分 子通过 。在调节体系中 ， 一个完整的通 道由两个半通道对 接 组成或者通过两种细胞胞 膜 中的连 接子组成 。每 一个连 接
Ｏ Ｂ ｓ — Ｖ Ｅ Ｃ ｓ 共 培养 实验 研究 已经证 实 ： 与 Ｏ Ｂ ｓ 或 Ｖ Ｅ Ｃ ｓ 单独培养相比 ， Ｏ Ｂ ｓ 与Ｖ Ｅ Ｃ ｓ的共培养 能显示 出更 高的碱性 磷酸酶（ ａ ｌ ｋ ａ ｌ ｉ ｎ ｅ ｐ ｈ ｏ ｓ ｐ ｈ ａ ｔ ａ ｓ ｅ ， Ａ Ｌ Ｐ ） 活性及 血管样 结构 ， 表 明 两类细胞问存在着 相互 促进 的生 物学作 用 ， 各 自体现 在分 化、 成熟和特异性结构 的表达上 。然 而， Ｅ ｔ 前 国 内外 报道 中 涉及这一共 培养 体系细胞 间生 物学现象发 生机制 的研究甚 少。因此 ， Ｏ Ｂ ｓ — Ｖ Ｅ Ｃ ｓ 细胞共 培养实验 尚有待进 一步的深入 探讨。首先 列入研究 的内容是共 培养最适 培养基 的条件及
成骨细胞培养
成骨诱导液：地塞米松，β-磷酸甘油，维生素C，OB或3T3-E1：α-MEM+10%FBS+50ug/ml ascorbic acid+10mM β-glycerophosphatePG(磷酸甘油)和Vc配好放四度，Vc尽量分装保存，减少与空气接触，三种分开配，不能配一起，培养液也是现用现配成骨细胞分离培养：无菌条件下取出新生鼠的颅盖骨，置入冷PBS中，剔除附着的结缔组织。
用PBS液清洗3次，将其置入盛有DMEM培养基的培养皿中，剪成0.5 mm×0.5 mm大小碎块，约30块，加入0.25%胰蛋白酶5 mL，置入孵箱中消化20 min，血清终止消化，弃上清液，加入1.0 g/L Ⅰ型胶原酶10 mL，置于孵箱中消化90 min，1 000 r/min 离心10 min，使细胞沉淀，用PBS洗涤细胞2次，200目滤网过滤去除骨碎片。
所沉淀物以含体积分数10%的胎牛血清、100 U/mL青霉素，100 mg/L链霉素的DMEM培养液重悬细胞，吹打均匀，接种至多个25 cm2培养瓶。
于37 ℃，含体积分数5%CO2培养箱培养。
48 h后换液，以后隔日换液1次。
成骨细胞的培养，纯化及传代：在原代培养过程中，每48 h换液1次至细胞融合成单层，密度长至80%融合时，1∶3的比例进行传代培养。
将原代培养细胞用0.25%胰酶消化，制成细胞悬液，采用差速贴壁法进行成骨细胞的纯化。
成骨细胞鉴定：活细胞形态观察细胞：培养后每日用倒置相差显微镜观察细胞形态变化及生长状况并拍照。
Giemsa染色：将纯化后的第2代细胞调整细胞浓度至5×107 L-1，接种到12孔细胞培养板中，每孔接种0.75 mL，以后每3 d换液。
待细胞分布均匀、约80%融合时，PBS洗3次，甲醇固定10 min，Giemsa 染液染2 min，蒸馏水冲洗，显微镜下观察拍照。
碱性磷酸酶活性检测细胞化学染色：细胞接种方法同上，体积分数95%乙醇固定30 min，按碱性磷酸酶活性检测试剂盒要求进行检测。
成骨细胞与破骨细胞的共培养体系
成骨细胞与破骨细胞的共培养体系
1 建立成骨细胞与破骨细胞共培养体系
成骨细胞和破骨细胞是骨再生的重要细胞，在成骨和破骨之间存
在矛盾性相互作用，为解决该矛盾性作用，建立成骨细胞与破骨细胞
共培养体系是有必要的。
1.1 获取细胞
获取成骨细胞和破骨细胞是共培养体系的第一步。
一般的获取方
式有从动物原位骨组织采集、从动物移植位骨组织采集以及从动物分
化出的骨细胞培养采集等；此外，还可以利用旁路移植操作获得成骨
和破骨细胞，以及通过多剂量胶原纤维骨再生制备法获取到成骨细胞，以及经过分离纯化的单个样品。
1.2 制备培养基
共培养体系建立的必要组成部分之一是，必须将对成骨细胞和破
骨细胞培养基进行优化；即构建一个基于实验的的多层联合的培养体系。
1.3 实现活细胞共培养
实现活细胞共培养仅用AMP法是不能取得理想效果的，而且很容
易造成细胞成骨破骨细胞凋亡和发生假复合，因此需要考虑利用有特
殊支架结构的凝胶体，或者应用其他生物材料来实现活细胞共培养。
1.4 动物实验
为了在实际应用中证实共培养体系的可行性，需要在动物实验上进行实验验证，有助于进一步用于临床应用，以达到促进骨再生的目的。
建立成骨细胞与破骨细胞的共培养体系具有重要的理论指导意义和临床应用价值，从而实现骨量的增加与骨质的维持，这不仅将有助于改善骨健康，而且有助于促进骨骼可塑性，有助于改善患者的生活质量，也是进一步改善骨病患者的治疗方法。
成骨培养基配方
成骨培养基配方一、前言成骨培养基是一种用于细胞培养的营养液，主要用于骨细胞的生长和分化。
成骨培养基中含有多种营养物质和生长因子，可以促进骨细胞的增殖和分化，从而加速骨组织的形成和修复。
成骨培养基配方的制备需要严格控制各种成分的比例和浓度，以保证其对骨细胞具有最佳的促进作用。
二、成骨培养基配方1. 基础培养基成骨培养基的基础部分通常采用Dulbecco's Modified Eagle's Medium（DMEM）或Minimum Essential Medium（MEM）等常见的细胞培养基。
这些基础培养基中含有必需氨基酸、糖类、维生素、盐类等多种营养物质，可以为细胞提供必要的生长条件。
2. 补体为了促进骨细胞在体外生长和分化，成骨培养基中通常添加一些补体。
这些补体包括：（1）胎牛血清（Fetal bovine serum，FBS）：FBS是最常用的补体之一，可以为细胞提供多种生长因子和营养物质，促进细胞增殖和分化。
（2）骨形成素（Bone morphogenetic protein，BMP）：BMP是一种重要的生长因子，可以促进骨细胞的分化和骨组织的形成。
（3）维生素D3（Vitamin D3）：Vitamin D3是一种脂溶性维生素，在体内可以促进钙的吸收和利用。
在成骨培养基中添加适量的Vitamin D3可以促进骨细胞的分化和钙化。
（4）β-甘油磷酸钠（β-glycerophosphate）：β-glycerophosphate是一种有机磷酸盐，在体内可以促进钙离子的沉积和骨组织的形成。
在成骨培养基中添加适量的β-glycerophosphate可以促进骨细胞的分化和矿化。
3. 抗生素为了防止培养基受到污染，通常会在成骨培养基中添加一些抗生素。
常用的抗生素包括青霉素、链霉素等，可以有效地抑制细菌和真菌的生长。
4. 其他成分除了以上几种成分外，成骨培养基中还可能添加一些其他的营养物质和生长因子，以满足不同类型的骨细胞对营养物质和生长因子的特殊需求。
成骨培养基配方
成骨培养基配方
成骨培养基是一种特殊的细胞培养基，它可以用于培养和研究骨细胞、软骨细胞和成骨细胞。
成骨培养基的配方是关键之一，下面介绍一种经典的成骨培养基配方。
1. DMEM/F12培养基：DMEM和F12培养基的混合物能够提供足够的营养物质和生长因子，支持细胞的存活和生长。
2. FBS：胎牛血清(FBS)是细胞培养中最广泛使用的血清，提供多种生长因子和营养物质，促进细胞的增殖和分化。
3. 抗生素和抗真菌剂：如青霉素和链霉素，保持培养物的纯度和无菌状态。
4. 抗氧化剂：细胞长期培养会产生氧化应激，影响细胞的生长和功能，加入抗氧化剂如谷胱甘肽(GSH)和丙酮酸可以减少氧化应激的影响。
5. 骨形态发生蛋白-2(BMP-2)：BMP-2是一种重要的成骨分化因子，能够促进干细胞向成骨细胞的转化，加入BMP-2能够促进细胞的成骨分化。
6. 维生素C：维生素C是一种重要的抗氧化剂，能够抑制细胞凋亡和促进胶原合成，加入适量的维生素C可以促进细胞的生长和分化。
以上是一种经典的成骨培养基配方，但随着科学技术的发展和研究的深入，配方也在不断改进和完善。
未来的成骨培养基会更加精细化，能够更好地模拟人体环境，促进细胞的生长和分化。
成骨细胞原代培养
成骨细胞原代培养
成骨细胞是一类能够形成骨组织的细胞，它们可以通过原代培养的方法进行研究。
下面是成骨细胞原代培养的步骤：
1.选择合适的细胞来源：成骨细胞可以来源于小鼠、大鼠、人等，根据研究需要选择合适的动物或人类来源。
2.预处理组织：从动物或人体中取出骨骼组织，去除软组织和肌肉，然后将骨骼切成小块。
3.分离成骨细胞：用酶等物质对骨骼块进行消化，获得含有成骨细胞和间充质细胞的细胞悬液。
4.培养：将获得的细胞悬液接种在含有成骨细胞培养物的培养皿中，培养温度为37℃，CO2浓度为5%。
5.细胞传代：细胞在生长过程中会不断分裂，可以将细胞培养到达一定密度后用胰酶等物质分离，得到更多的细胞用于后续实验。
通过原代培养方法获得的成骨细胞具有更高的细胞活力和稳定性，适合用于体外研究成骨细胞的生物学特性和调控机制。
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成骨诱导液：
地塞米松，β-磷酸甘油，维生素C，
OB或3T3-E1：α-MEM+10%FBS+50ug/ml ascorbic acid+10mM β-glycerophosphate
PG(磷酸甘油)和Vc配好放四度，
Vc尽量分装保存，减少与空气接触，
三种分开配，不能配一起，培养液也是现用现配
成骨细胞分离培养：无菌条件下取出新生鼠的颅盖骨，置入冷PBS中，剔除附着的结缔组织。
用PBS液清洗3次，将其置入盛有DMEM培养基的培养皿中，剪成0.5 mm×0.5 mm大小碎块，约30块，加入0.25%胰蛋白酶5 mL，置入孵箱中消化20 min，血清终止消化，弃上清液，加入1.0 g/L Ⅰ型胶原酶10 mL，置于孵箱中消化90 min，1 000 r/min 离心10 min，使细胞沉淀，用PBS洗涤细胞2次，200目滤网过滤去除骨碎片。
所沉淀物以含体积分数10%的胎牛血清、100 U/mL青霉素，100 mg/L链霉素的DMEM培养液重悬细胞，吹打均匀，接种至多个25 cm2培养瓶。
于37 ℃，含体积分数5%CO2培养箱培养。
48 h后换液，以后隔日换液1次。
成骨细胞的培养，纯化及传代：在原代培养过
程中，每48 h换液1次至细胞融合成单层，密度长至80%融合时，1∶3的比例进行传代培养。
将原代培养细胞用0.25%胰酶消化，制成细胞悬液，采用差速贴壁法进行成骨细胞的纯化。
成骨细胞鉴定：
活细胞形态观察细胞：培养后每日用倒置相差显微镜观察细胞形态变化及生长状况并拍照。
Giemsa染色：将纯化后的第2代细胞调整细胞浓度至5×107 L-1，接种到12孔细胞培养板中，每孔接种0.75 mL，以后每3 d换液。
待细胞分布均匀、约80%融合时，PBS洗3次，甲醇固定10 min，Giemsa 染液染2 min，蒸馏水冲洗，显微镜下观察拍照。
碱性磷酸酶活性检测细胞化学染色：细胞接种方法同上，体积分数95%乙醇固定30 min，
按碱性磷酸酶活性检测试剂盒要求进行检测。
核固红复染细胞核，自然干燥后中性树胶封固。
阳性细胞可见蓝黑色颗粒沉积在胞浆碱性磷酸酶活性部位。
• 茜素红染液
操作 1. 成骨诱导分化结束后，吸走六孔板中的成骨诱导分化完全培养基，用
1×PBS冲洗 1-2次。
每孔加入2 mL 4%中性甲醛溶液，固定30 min。
2.吸走中性甲醛溶液，用1×PBS冲洗2次。
每孔中加入1 mL茜素红染液染3-5 min。
3.吸走茜素红染液，用1×PBS冲洗2-3次。
4. 将培养板置于显微镜下观察成骨染色效果。
用4周龄大鼠，用全骨髓贴壁法取得原代细胞，消化传代，用第3代培养至80-90%融合后，胰酶消化，接种在事先明胶包被的六孔板中，当细胞生长达接近80-90%时，使用cyagen的成骨诱导培养液诱导，每2-3天换液，诱导28天后，吸去六孔板中培养基，用PBS冲洗，加入4%中性甲醛固定30min，再次用PBS冲洗，加入茜素红染4min，PBS冲洗后观察。
骨科手术中获得成
人松质骨，经PBS 或者D-Hanks 液冲洗数次后剪成1 ～3 mm3 左右小粒，在1%庆大霉素中浸泡30 min。
如不能立即使用，可浸泡于含12% 胎牛血清及青霉素、链霉素的Ham’s F12 培养液中，放在4℃冰箱过夜。
②用PBS 或者D-Hanks 反复冲洗至小骨粒发白，移入小瓶中，加0. 25% 胰蛋白酶，37℃孵箱中消化20 min，弃去上清。
③剩余小粒移入培养瓶，加入Ham’s F12 培养液，将培养瓶竖放或瓶底向上，并使小粒均匀分布; 将培养瓶放入5% CO2、37℃孵箱中培养2 h 后轻轻将瓶底翻转向下，继续培养5 ～7 d，观察细胞生长情况，酌情换液。
( 为避免组织块脱落要轻拿轻放) ④细胞长满后可除去组织块，用胰蛋白酶消化离心法收集细胞，传代培养。
（此法较难）
---人骨髓源性成骨细胞体外培养和生物学特性的研究
人骨髓梯度离心法提取成骨细胞和破骨细胞。